一種癌性胸腹水來(lái)源的til細(xì)胞的高效擴(kuò)增方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明目的是提供一種癌性胸腹水來(lái)源的TIL細(xì)胞的高效擴(kuò)增方法，本發(fā)明所制備出的TIL細(xì)胞具有增殖速度快、細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞活性高等特點(diǎn)。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是：利用層粘連蛋白和纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶對(duì)TIL進(jìn)行培養(yǎng)，這兩種蛋白的吸附作用可以使細(xì)胞成半貼壁狀態(tài)，從而利于細(xì)胞接受各種因子的刺激，并且這兩種蛋白本身就有對(duì)TIL細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用；而抗OX-40單克隆抗體的使用可以刺激TIL細(xì)胞中CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的共刺激信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的活化，提高細(xì)胞穿孔素和顆粒酶的表達(dá)，增強(qiáng)其殺傷能力。到目前為止，仍未見(jiàn)有將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗OX-40單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用于TIL細(xì)胞制備的研究報(bào)道，本發(fā)明首次提供出一種在TIL細(xì)胞制備中通過(guò)添加以上三種因子提高細(xì)胞數(shù)量和殺傷活性的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種癌性胸腹水來(lái)源的TIL細(xì)胞的高效擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TumorInfiltrating lymphocyte, TIL)的培養(yǎng)，即利用各種細(xì)胞因子的組合來(lái)刺激胸腹水來(lái)源的淋巴細(xì)胞，使其可以高效擴(kuò)增。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(Tumor Infiltrating lymphocyte, TIL)是指侵潤(rùn)到腫瘤組織周?chē)牧馨图?xì)胞，細(xì)胞表型以⑶3+CD8+T和⑶3+⑶4+T細(xì)胞為主，另外還有少量的NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞。由于TIL細(xì)胞多數(shù)與腫瘤細(xì)胞發(fā)生過(guò)接觸，所以理論上可以對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷作用。但是，由于腫瘤微環(huán)境中，存在很強(qiáng)的免疫抑制因子，所以實(shí)際上TIL細(xì)胞的功能是受到極大的抑制，無(wú)法發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷作用。
[0003]上個(gè)世紀(jì)八十年代，Rosenberg教授首次分離腫瘤組織中的TIL細(xì)胞，并通過(guò)白細(xì)胞介素2的刺激接來(lái)解除其免疫抑制狀態(tài)，體外擴(kuò)增后，用于回輸治療黑色素瘤患者，并取得了一定的效果。
[0004]TIL細(xì)胞的來(lái)源主要有兩個(gè):1、手術(shù)切除的腫瘤組織或淋巴結(jié)；2、癌性胸腹水。從手術(shù)樣品中分離TIL細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)機(jī)械剪切，多種蛋白酶的酶解等多個(gè)步驟，方法比較繁瑣，而且最終能夠分離并成功培養(yǎng)的比例不高，這很大程度上限制了手術(shù)樣品來(lái)源TIL的臨床應(yīng)用。癌性胸腹水來(lái)源的TIL細(xì)胞，分離的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，也容易在體外培養(yǎng)，所以在臨床得到了較為廣泛的應(yīng)用。但是，由于使用傳統(tǒng)方法，TIL在體外的擴(kuò)增有限，通常20天左右的時(shí)間，細(xì)胞數(shù)量?jī)H擴(kuò)增20-50倍左右，且TIL細(xì)胞中⑶3+⑶8+T細(xì)胞的殺傷能力不高，極大的影響了 TIL細(xì)胞臨床應(yīng)用的效果。
[0005]科研工作者不斷探索培養(yǎng)TIL的新方法，比如在培養(yǎng)中期添加抗⑶3單克隆抗體、使用炎性因子等。因此，盡早建立一種高效擴(kuò)增TIL細(xì)胞的方法，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)著研究工作的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種癌性胸腹水來(lái)源的TIL細(xì)胞的高效擴(kuò)增方法，即使用腫瘤患者的胸腹水，分離得到TIL細(xì)胞，在體外通過(guò)多種因子的刺激作用，使TIL細(xì)胞得到大量擴(kuò)增，并提高其殺傷活性。
[0007] 申請(qǐng)人:在長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白和纖維連接蛋白可以極大的提高TIL細(xì)胞的增殖速度；而抗0X-40單克隆抗體的添加可以有效的刺激TIL細(xì)胞的活化，上調(diào)CD3+CD8+T細(xì)胞中行使殺傷功能的穿孔素和顆粒酶的表達(dá)，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。 申請(qǐng)人:將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗0X-40單克隆抗體三種因子共用引入到TIL細(xì)胞的培養(yǎng)中，從而促成了本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明的TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟:
[0009]I)將層粘連蛋白和纖維連接蛋白溶解稀釋后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中包被；[0010]2)將從胸腹水分離得到的TIL細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸后，接種到包被后的培養(yǎng)瓶中；添加IL-2刺激；
[0011]3)培養(yǎng)4天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，并添加抗0X-40單克隆抗體；
[0012]4)持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至第20天時(shí)，完成高效TIL細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0013]本發(fā)明步驟2)所述的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、維生素 21.4mg/ml、微量元素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素 8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺卩密唳0.12mg/ml。
[0014]其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴(lài)氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
[0015]維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素B1、20份D-泛酸酯。
[0016]微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
[0017]為了獲得更好的培養(yǎng)效果，在培養(yǎng)液中還添加有25mg/L的小球藻生長(zhǎng)因子(Chlorella Growth Factor, CGF)。
[0018]本發(fā)明所制備出的TIL細(xì)胞具有增殖速度快、細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞活性高等特點(diǎn)。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是:利用層粘連蛋白和纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶對(duì)TIL進(jìn)行培養(yǎng)，這兩種蛋白的吸附作用可以使細(xì)胞成半貼壁狀態(tài)，從而利于細(xì)胞接受各種因子的刺激，并且這兩種蛋白本身就有對(duì)TIL細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用；而抗0X-40單克隆抗體的使用可以刺激TIL細(xì)胞中CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的共刺激信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的活化，提高細(xì)胞穿孔素和顆粒酶的表達(dá)，增強(qiáng)其殺傷能力。到目前為止，仍未見(jiàn)有將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗0X-40單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用于TIL細(xì)胞制備的研究報(bào)道，本發(fā)明首次提供出一種在TIL細(xì)胞制備中通過(guò)添加以上三種因子提高細(xì)胞數(shù)量和殺傷活性的方法。
[0019]具體實(shí)施方法
[0020]本發(fā)明所用的材料描述如下:
[0021]抗0X-40單克隆抗體:鼠抗人0X-40單克隆抗體，購(gòu)于安迪生物科技(上海)有限公司
[0022]HTB-135細(xì)胞:人胃癌細(xì)胞系，購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)
[0023]NC1-H596細(xì)胞:人肺癌細(xì)胞系，購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)
[0024]HepG2細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞系，購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)
[0025]本發(fā)明的癌性胸腹水來(lái)源的TIL細(xì)胞的高效擴(kuò)增方法，包括如下的步驟:
[0026]I)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置3-5小時(shí)。
[0027]2)細(xì)胞接種:收集400-1000毫升的癌性胸腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細(xì)胞層，生理鹽水洗滌2次，用60毫升的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，取樣計(jì)數(shù)后，接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中。添加60000單位的IL-2。
[0028]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第5天時(shí)，轉(zhuǎn)入透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基至400毫升，添加200000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0029]4)擴(kuò)大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無(wú)血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0030]收獲細(xì)胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算TIL細(xì)胞的增殖倍數(shù)。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞，取適量細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0032]實(shí)驗(yàn)例I
[0033]1)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置4小時(shí)。
[0034]2)細(xì)胞接種:收集600毫升的癌性腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細(xì)胞層，生理鹽水洗滌2次，用60毫升的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)為2.6 X IO7個(gè)。將細(xì)胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加60000單位的IL-2。其中無(wú)血清培養(yǎng)基的組份如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫鈣1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、維生素 21.4mg/ml、微量兀素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺卩密唳0.12mg/ml、25mg/L的小球藻生長(zhǎng)因子。
[0035]其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴(lài)氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
[0036]維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素B1、20份D-泛酸酯。
[0037]微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
[0038]上述的培養(yǎng)基是長(zhǎng)期優(yōu)化獲得的，在同樣的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的增殖效果要明顯好于現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞增殖速度可以提高約12%。
[0039]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第5天時(shí)，轉(zhuǎn)入透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基至400毫升，添加200000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0040]4)擴(kuò)大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無(wú)血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0041]收獲細(xì)胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)為5.4X109個(gè)，增殖倍數(shù)為208倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞，取適量細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。高效TIL細(xì)胞在效靶比為10:1的條件下，對(duì)HTB-135、NC1-H596和!fepG2細(xì)胞系的殺傷分別達(dá)到22.8%、19.4%、13.4%。
[0042]按照上述步驟，重復(fù)試驗(yàn)7次，高效TIL細(xì)胞增殖倍數(shù)的平均值為172倍。在效靶比為10:1的條件下，高效TIL細(xì)胞對(duì)對(duì)HTB-135、NC1-H596和!fepG2細(xì)胞系殺傷的平均值為 26.2%, 20.7% 和 15.8%.[0043]實(shí)驗(yàn)例2
[0044]I)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置5小時(shí)。
[0045]2)細(xì)胞接種:收集400毫升的癌性胸水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細(xì)胞層，生理鹽水洗滌2次，用80毫升的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)為3.2 X IO7個(gè)。將細(xì)胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加80000單位的IL-2。
[0046]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第5天時(shí)，轉(zhuǎn)入透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基至400毫升，添加160000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0047]擴(kuò)大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無(wú)血清培養(yǎng)基，并按400單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0048]4)收獲細(xì)胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)為5.7 X IO9個(gè)，增殖倍數(shù)為178倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞，取適量細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。高效TIL細(xì)胞在效靶比為10:1的條件下，對(duì)HTB-135、NC1-H596和!fepG2細(xì)胞系的殺傷分別達(dá)到16.3%, 27.6%、15.5%。
[0049]實(shí)驗(yàn)例3
[0050]1)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置3小時(shí)。
[0051]2)細(xì)胞接種:收集900毫升的癌性腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細(xì)胞層，生理鹽水洗滌2次，用80毫升的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)為3.6X107個(gè)。將細(xì)胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加80000單位的IL-2。
[0052]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第5天時(shí)，轉(zhuǎn)入透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基至450毫升，添加180000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0053]擴(kuò)大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無(wú)血清培養(yǎng)基，并按400單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0054]5)收獲細(xì)胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)5.5 X IO9個(gè)，增殖倍數(shù)為153倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞，取適量細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。高效TIL細(xì)胞在效靶比為10:1的條件下，對(duì)HTB-135、NC1-H596和!fepG2細(xì)胞系的殺傷分別達(dá)到14.6%、12.9%, 20.1%。
[0055]本發(fā)明所制備的高效TIL細(xì)胞在培養(yǎng)第20天時(shí)，增殖倍數(shù)超過(guò)150倍，是比常規(guī)TIL培養(yǎng)方法增殖倍數(shù)的300%以上，并且高效TIL細(xì)胞在較低的效靶比條件下，即可對(duì)常見(jiàn)的胃癌、肺癌和肝癌細(xì)胞系產(chǎn)生較高的殺傷。
【權(quán)利要求】
1.一種TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟: 1)將層粘連蛋白和纖維連接蛋白溶解稀釋后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中包被； 2)將從胸腹水分離得到的TIL細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸后，接種到包被后的培養(yǎng)瓶中；添加IL-2刺激； 3)培養(yǎng)4天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，并添加抗0X-40單克隆抗體； 4)持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至第20天時(shí)，完成高效TIL細(xì)胞的培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化韓40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、維生素21.4mg/ml、微量兀素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺喃P定 0.12mg/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴(lài)氨酸、20份蛋氨 酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素Bl、20份D-泛酸酯。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液添加有25mg/L的小球藻生長(zhǎng)因子。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK103468641SQ201310452172
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】徐矯健, 孫威 申請(qǐng)人:青島麥迪賽斯生物科技有限公司