篩查和鑒定bcr-abl非常見融合型別的方法、引物、探針和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明設(shè)計(jì)出用于檢測BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、e19a2、e1a3、e13a3和e14a3這6種非常見融合型別的方法、引物、探針和試劑盒。先采取兩管熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行血液樣本進(jìn)行初篩，再對通過初篩判斷屬于a2或a3組的血液樣本進(jìn)行具體型別定量鑒定。這樣即減少了篩查的成本又提高了檢測的通量。本發(fā)明所述的檢測方法、引物、探針和試劑盒其靈敏度高，特異性好，檢測通量大，快速且準(zhǔn)確的篩查及型別鑒定方法。
【專利說明】篩查和鑒定BCR-ABL非常見融合型別的方法、引物、探針和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種臨床篩查BCR-ABL融合基因非常見融合型別的方法、引物、探針和試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對人血液樣本中BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3、el4a3這6種非常見型別進(jìn)行初步篩查和型別鑒定?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]BCR-ABL融合基因是由9號染色體長臂易位至22號染色體長臂上，致使ABL原癌基因與BCR基因發(fā)生融合而產(chǎn)生的。t(9;22) (q34;qll)易位后的22號染色體又稱為費(fèi)城染色體(Ph染色體)。Ph染色體和BCR-ABL融合基因是慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic MyeloidLeukemia, CML)產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。此外，BCR-ABL融合基因還可見于急性淋巴細(xì)胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia, ALL),少見于急性髓系白血病(Acute MyeloblasticLeukemia, AML)。
[0003]當(dāng)9號染色體與22號染色體發(fā)生易位時(shí)，9號染色體上的斷裂位置通常位于ABL基因的第I內(nèi)含子上，其次是第2內(nèi)含子；而22號染色體上的斷裂位置則可位于BCR基因的多個(gè)區(qū)段上，故會(huì)形成多種融合型別。在各種融合型別中，有三種是最常見的，分別為:el3a2 (又稱為b2a2)、el4a2 (又稱為b3a2)和ela2 ;前兩種融合型別就是常說的BCR-ABLP210,后者常稱為BCR-ABL P190。除此以外，報(bào)道較多的非常見型別則有:e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3。在CML患者中，BCR-ABL el3a2和el4a2兩種融合型共計(jì)占~98% ;而非常見融合型別至少占1_2%，甚至更多。在成人和兒童ALL患者中，BCR-ABL陽性率分別為~25%和~3% ;這其中el3a2、el4a2和ela2共計(jì)占~99% ;而非常見融合型別也至少占1-2%。
[0004]目前，臨床在對疑似CML、ALL和AML患者做BCR-ABL融合基因篩查時(shí)，通常只針對el3a2、el4a2和ela2三種型別做出檢測，其他非常見的型別則是通過染色體核型分析或原位熒光雜交(FISH)技術(shù)檢查時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。這種通過肉眼觀察判斷的篩查方式存在如下缺點(diǎn):(1)對BCR-ABL融合基因非常見型別的篩查存在漏檢的情況。首先，染色體核型分析的前提是需對樣本中的有核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，具有核分裂相；若細(xì)胞培養(yǎng)失敗，無核分裂相，則無法進(jìn)行分析。其次，在細(xì)胞培養(yǎng)增殖過程中，某類細(xì)胞會(huì)過度生長，若正常細(xì)胞過度生長，則會(huì)將病變細(xì)胞“淹沒”掉，造成染色體核型正常的假象。而在無法抽取骨髓的情況下，抽取外周血做染色體核型分析，也會(huì)有假陰性出現(xiàn)。再者，有些病例染色體的易位極其微小，出現(xiàn)隱匿性的Ph染色體，這是在靠肉眼觀察進(jìn)行分析的染色體檢查中無法發(fā)現(xiàn)的。而FISH方法檢測BCR-ABL融合時(shí)，雖然不用培養(yǎng)細(xì)胞，對隱匿性的Ph染色體也能檢測到，但其檢查費(fèi)用過高，大部分患者都不會(huì)選擇該方法進(jìn)行檢測，故起不到真正篩查的作用。(2)無法區(qū)分BCR-ABL的具體型別，因而就無法有針對性地進(jìn)行微小殘留病灶(Minimal ResiduaDisease, MRD)的監(jiān)控。染色體核型分析是通過肉眼對染色體的易位進(jìn)行識別；同樣，F(xiàn)ISH是借助熒光信號，觀察不同染色體的融合，亞微觀的變化是無法觀察到的。(3)檢測成功率及靈敏度低。
[0005]目前，即使有針對性地對BCR-ABL融合基因非常見型別進(jìn)行鑒定，也是先通過進(jìn)行多重PCR(my ltiplex PCR)或巢式PCR(nested PCR)方法進(jìn)行擴(kuò)增，再結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳或測序。多重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳或測序進(jìn)行篩查的缺點(diǎn)如下:(I)存在非特異的擴(kuò)增，電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)多條PCR產(chǎn)物條帶，易出現(xiàn)假陽性；(2)通過電泳進(jìn)行分析時(shí)結(jié)果判斷存在主觀性，特別是在對MRD的監(jiān)控時(shí)，臨界結(jié)果無法進(jìn)行明確的分析判斷，而通過測序會(huì)到導(dǎo)致成本增加，而且時(shí)間周期極大地延長；(3)靈敏度低于巢式PCR及熒光PCR ; (4)只能進(jìn)行定性檢測；(5)耗時(shí)長，若通過電泳鑒定PCR產(chǎn)物需要5-6小時(shí)；若通過測序鑒定，則需要10-12小時(shí)。而巢式PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳或測序進(jìn)行篩查也存在如下缺點(diǎn):(I)過程繁瑣，易污染，電泳鑒定時(shí)臨界結(jié)果的判斷較主觀；(2)PCR反應(yīng)體系多，成本高，不適用于高通量的樣本檢測；(3)只能進(jìn)行定性檢測；(4)耗時(shí)長，若通過電泳鑒定PCR產(chǎn)物需要
5-6小時(shí)；若通過測序鑒定，則需要10-12小時(shí)。故無論是先通過進(jìn)行多重PCR(my ItiplexPCR)還是巢式PCROiested PCR)方法進(jìn)行擴(kuò)增，再利用瓊脂糖凝膠電泳或測序來鑒定BCR-ABL融合基因非常見型別，都不能同時(shí)滿足靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于目前篩查BCR-ABL融合基因非常見型別方法的不足，本發(fā)明設(shè)計(jì)出用于檢測BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的方法、引物、探針和試劑盒，從而能夠高靈敏度地、高特異性地、高通量地并且快速準(zhǔn)確地篩查和鑒定BCR-ABL融合基因非常見型別。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供用于篩查BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針的核苷酸序列如下:`[0008]E6F:5’ -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
[0009]E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0010]E19F:5，-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0011]A2R: 5，-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0012]A2P:5， -FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0013]ElF:5，-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0014]E13F:5’ -GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0015]E14F:5，-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3，
[0016]A3R: 5 ’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3，
[0017]A3P: 5 ’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3，。
[0018]進(jìn)一步地，所述引物和探針還包括用于擴(kuò)增作為內(nèi)參的管家基因ABL的引物和探針，其核苷酸序列如下:
[0019]ABL-F:5’ -GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0020]ABL-R:5，-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
[0021 ] ABL-P: 5，-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3，。[0022]本發(fā)明還提供了用于鑒定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的引物和探針，其特征在于，
[0023]鑒定e6a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0024]E6F:5， -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
[0025]A2R:5，-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0026]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0027]鑒定e8a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0028]E8F:5， -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0029]A2R:5， -AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0030]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0031]鑒定el9a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0032]E19F:5，-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3 ’
[0033]A2R:5，-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0034]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0035]鑒定ela3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0036]ElF:5，-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0037]A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0038]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0039]鑒定el3a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0040]E13F: 5，-GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3，
[0041 ]A3R: 5 ’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3，
[0042]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0043]鑒定el4a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0044]E14F:5， -GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3，
[0045]A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0046]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0047]進(jìn)一步地，鑒定選自e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3型別中任一種型別的引物和探針的核苷酸序列還包括擴(kuò)增作為內(nèi)參的管家基因ABL的引物和探針，其核苷酸序列如下:
[0048]ABL-F:5’ -GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0049]ABL-R:5，-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
[0050]ABL-P:5’ -FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3’
[0051]本發(fā)明還提供了一種篩查和鑒定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:
[0052](I)提取血液樣本中的RNA ；
[0053](2)將步驟(1)中的RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA;
[0054](3)利用熒光PCR擴(kuò)增步驟⑵所述的cDNA，進(jìn)行所述非常見融合型別的初步篩查；
[0055](4)若通過步驟(3)的初步篩查，確定所述血液樣本不是所述非常見融合型別，則檢測結(jié)束；若通過步驟(3)的初步篩查，確定所述血液樣本為所述非常見融合型別，則再通過熒光PCR擴(kuò)增進(jìn)行具體型別定量鑒定。
[0056]進(jìn)一步地，利用所述步驟(3)的初步篩查判斷所述血液標(biāo)本屬于a2組、a3組或不是所述非常見融合型別。
[0057]進(jìn)一步地，用于所述步驟(3)的擴(kuò)增引物和探針的核苷酸序列為:
[0058]E6F:5，-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
[0059]E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3J
[0060]E19F:5，-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3J[0061 ]A2R: 5 ’ -AGTTCCAACGAGCGGCTT-3’
[0062]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0063]ElF:5，-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0064]E13F: 5 ’ -GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3，
[0065]E14F:5，-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3J
[0066]A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0067]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0068]進(jìn)一步地，根據(jù)步驟(3)中的判斷結(jié)果，若是a2組，則進(jìn)行e6a2，e8a2, el9a2型別鑒定；若是a3組，則進(jìn)行ela3，el3a3，el4a3型別鑒定。
[0069]進(jìn)一步地，在所述步驟(4)中，用于通過所述熒光PCR擴(kuò)增進(jìn)行具體型別定量鑒定的引物和探針的核苷酸序列為:
[0070]鑒定e6a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0071]E6F: 5 ’ -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
[0072]A2R:5，-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0073]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0074]鑒定e8a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0075]E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
[0076]A2R:5， -AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0077]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0078]鑒定el9a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0079]E19F:5，-TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3’
[0080]A2R:5， -AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0081]A2P:5， -FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0082]鑒定ela3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0083]ElF:5，-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0084]A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0085]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0086]鑒定el3a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0087]E13F: 5 ’ -GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3，
[0088]A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
[0089]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’[0090]鑒定el4a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
[0091]E14F: 5，-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3，
[0092]A3R:5， -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3，
[0093]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
[0094]本發(fā)明還提供了一種篩查和鑒定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的試劑盒，包括血液RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括引物和探針，其特征在于，所述引物和探針的核苷酸序列如下:
[0095]E6F:5，-GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
[0096]E8F:5，-TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3J
[0097]E19F:5’ -TGGAGGAGGTGGGCATCTA-3J
[0098]A2R:5，-AGTTCCAACGAGCGGCTT-3，
[0099]A2P:5，-FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC-TAMRA-3’
[0100]ElF:5，-CTCGCAGAACTCGCAACAG-3’
[0101]E13F:5’ -GATGCTGACCAACTCGTGTGT-3’
[0102]E14F:5，-GTCATCGTCCACTCAGCCAC-3J
[0103]A3R: 5 ’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3，
[0104]A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’
[0105]ABL-F:5’ -GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’
[0106]ABL-R: 5，-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3 ’
[0107]ABL-P: 5，-FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA-3，。
[0108]由于BCR-ABL 融合基因 e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3 和 el4a3 這 6 種非常見融合型別的發(fā)生率低，故本發(fā)明通過引物探針的設(shè)計(jì)優(yōu)化，采取兩管PCR反應(yīng)先用多重引物結(jié)合熒光PCR的方法進(jìn)行血液樣本初篩，再對屬于a2組或a3組的血液標(biāo)本進(jìn)行具體型別定量鑒定的方法，這樣減少了篩查的成本，又提高了檢測的通量。
[0109]本發(fā)明引物探針的設(shè)計(jì)及篩查體系的分組如下:根據(jù)BCR-ABL在融合過程中，ABL基因上的斷裂位置相對固定的特點(diǎn)，將篩查體系分為兩組:a2組(斷裂位置位于ABL基因第I內(nèi)含子)，由e6a2，e8a2，el9a2型別組成；a3組(斷裂位置位于ABL基因第2內(nèi)含子)，由ela3，el3a3, el4a3型別組成。同時(shí)，在ABL基因的第2外顯子上設(shè)計(jì)a2組的下游引物和熒光探針；在第3外顯子上設(shè)計(jì)a3組的下游引物和熒光探針。隨后，根據(jù)下游引物設(shè)計(jì)與之適宜進(jìn)行PCR反應(yīng)的的上游引物。a2組的上游引物分別位于BCR基因的第6外顯子、第8外顯子和第19外顯子；這樣與下游引物組合正好能檢測e6a2、e8a2、el9a2三種型別。同理，a3組的上游引物分別位于BCR基因的第I外顯子、第13外顯子和第14外顯子，與下游引物組合檢測ela3、el3a3和el4a3三種型別。這種設(shè)計(jì)三條上游引物共用一條下游引物和探針的配對方式，減少了一管反應(yīng)體系中由于存在多條引物探針而相互抑制干擾的情況，既節(jié)約了成本又增加了檢測體系的靈敏度和特異性。同時(shí)不論是在a2組還是在a3組中，由于在每組內(nèi)下游引物是共用的，所以應(yīng)當(dāng)遵循先設(shè)計(jì)同組的共有下游引物再設(shè)計(jì)同組內(nèi)不同融合型別的上游引物的原則，不然若事先設(shè)計(jì)同組內(nèi)的一個(gè)融合型別的上游引物再設(shè)計(jì)其下游引物，然后設(shè)計(jì)同組內(nèi)的另一個(gè)融合型別的上游引物再設(shè)計(jì)其下游引物，很有可能產(chǎn)生兩次設(shè)計(jì)的下游引物不一致的現(xiàn)象，而導(dǎo)致下游引物重新設(shè)計(jì)，從而帶來極大的時(shí)間浪費(fèi)。
[0110]據(jù)統(tǒng)計(jì)，在這6種非常見融合型別中，任何一種型別的發(fā)生率大概在1-2%，因而容易在臨床檢測中被忽視和漏檢。若采用在單管中利用多重?zé)晒釶CR進(jìn)行篩查，針對每個(gè)型別的探針?biāo)捎玫臒晒饣鶊F(tuán)必需是不同的，這不僅會(huì)增加檢測成本，則靈敏度、特異性不能滿足臨床的要求，結(jié)果可靠性也較差。若對每個(gè)型別都進(jìn)行單獨(dú)鑒定，則需要進(jìn)行六管檢測，同時(shí)也鑒于在這6種非常見融合型別中，任何一種型別的發(fā)生率僅僅為1-2%左右，這就意味著在1000份血液樣品中，至少由980份樣品不屬于這6種非常見融合型別中的任何一種，如果對這至少980份樣品都進(jìn)行六管檢測，那么不僅要消耗病人更多的血樣樣本，同時(shí)也極大地增加試劑和人力成本。本發(fā)明利用一條下游引物探針對應(yīng)多條上游引物的組合方式，先進(jìn)行定性篩查后進(jìn)行定量分型，將初篩檢查的反應(yīng)體系縮減到兩管，這樣就可在初篩階段將上述至少980份樣品排除掉，就不用再進(jìn)行后續(xù)的定量檢測和分型，因此這不僅節(jié)約了成本，又增加了一個(gè)批次檢測的通量，為高通量的血液樣本篩查工作提供便利。再者，針對每個(gè)型別的探針可共用相同的熒光基團(tuán)，也有助降低試劑開發(fā)成本，為便于產(chǎn)品的開發(fā)。此外，將這種組合方式與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，避免巢式PCR的開蓋反應(yīng)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免污染的發(fā)生；也提高了結(jié)果的易判斷性，使檢測結(jié)果更加客觀易讀。最后，在具體型別鑒定時(shí)引入ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線，既進(jìn)行了分型，又進(jìn)行了定量，有利于在臨床上結(jié)合骨髓檢查、染色體核型分析、免疫分型等結(jié)果綜合評估疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，同時(shí)有針對性地進(jìn)行MRD監(jiān)控，預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0111]圖1是本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)位置圖
[0112]圖2是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對一個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0113]圖3是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第二個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0114]圖4是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第三個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0115]圖5是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第四個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0116]圖6是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第五個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0117]圖7是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第六個(gè)待檢樣本進(jìn)行篩查及型別鑒定的熒光擴(kuò)增曲線圖
[0118]圖8是使用本發(fā)明引物、探針和檢測方法對第七個(gè)待檢血液樣本進(jìn)行篩查的熒光擴(kuò)增曲線圖
具體實(shí)施 方式
[0119]實(shí)施例1:[0120]血液RNA的提取:在1.5ml離心管中加入ImllX紅細(xì)胞裂解液，取待檢血液樣本0.5ml，顛倒混勻。離心4000rpm，3min,吸棄上清，加紅細(xì)胞裂解液洗滌一次，得所需細(xì)胞；加I ml TotalRNA Isolation Reagent (上海普飛生物技術(shù)有限公司)，反復(fù)吹吸直至無明顯細(xì)胞團(tuán)塊，加入氯仿200 μ 1，漩渦混勻30s，冰上靜置lOmin。接著，4°C離心14，OOOrpm，IOmin0用移液器吸取上清液450 μ I轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻后在冰上靜置lOmin。4°C離心14，OOOrpm, IOmin0然后用75%的乙醇和無水乙醇分別洗滌離心一次。室溫干燥5min，加入50 μ I DEPC-H20溶解，獲得RNA提取液。 [0121]10Χ 紅細(xì)胞裂解液配方為:NH4C182g，NaHC038.4g，EDTA_Na23.72g，加 ddH20 定容至 1000ml0
[0122]實(shí)施例2:
[0123]逆轉(zhuǎn)錄:取實(shí)施例1中的RNA提取液4μ I (濃度約200ng/y I)加1μ I Primermix (ReverTra AceqPCR RT Kit，購自東洋紡(上海)生物科技有限公司)和3 μ I DEPC-H20混勻，70°C預(yù)變性 5min ;冰上驟冷 Imin 后加入 4μ 15*RT buffer (ReverTra Ace qPCR RTKit), I μ I Enzyme Mix (ReverTra Ace qPCR RT Kit),并加 7μ I DEPC-H2O 至總體積為20 μ I。37°C 60min反應(yīng)后98°C 5min滅活，所得即為待檢血液樣本的cDNA。
[0124]實(shí)施例3:
[0125]熒光PCR初篩:根據(jù)如表1所示的各材料及用量配置初篩試劑。初篩試劑共含3個(gè)反應(yīng)管:a2組、a3組和ABL各一管；其中ABL為內(nèi)參檢測管,用于判斷RNA提取質(zhì)量是否符合要求。加入實(shí)施例2中所得cDNA各2μ I。按如下程序進(jìn)行檢測:95°C預(yù)變性30s;95 °C 10s，58 °C 35s，共 40 個(gè)循環(huán)；58 °C 時(shí)采集熒光。HUNDERBIRD Probe qPCR Mix 購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。
[0126]表1
[0127]
【權(quán)利要求】
1.用于篩查BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針的核苷酸序列如下:
2.如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針還包括用于擴(kuò)增作為內(nèi)參的管家基因ABL的引物和探針，其核苷酸序列如下:
3.用于鑒定BCR-ABL融合基因e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3這6種非常見融合型別的引物和探針，其特征在于， 鑒定e6a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
4.如權(quán)利要求3所述的引物和探針，其特征在于，鑒定選自e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3和el4a3型別中任一種型別的引物和探針的核苷酸序列還包括擴(kuò)增作為內(nèi)參的管家基因ABL的引物和探針，其核苷酸序列如下:
ABL-F:5’ -GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3，
ABL-R:5’ -CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
ABL-P:5’ -FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT - TAMRA-3’。
5.一種篩查和鑒定 BCR-ABL 融合基因 e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3 和 el4a3 這 6 種非常見融合型別的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)提取血液樣本中的RNA; (2)將步驟(1)中的RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA; (3)利用熒光PCR擴(kuò)增步驟(2)所述的cDNA，進(jìn)行所述非常見融合型別的初步篩查； (4)若通過步驟(3)的初步篩查，確定所述血液樣本不是所述非常見融合型別，則檢測結(jié)束；若通過步驟(3)的初步篩查，確定所述血液樣本為所述非常見融合型別，則再通過熒光PCR擴(kuò)增進(jìn)行具體型別定量鑒定。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述步驟(3)的初步篩查判斷所述血液標(biāo)本是屬于a2組、a3組或不是所述非常見融合型別。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用于所述步驟(3)的擴(kuò)增引物和探針的核苷酸序列為:
E6F:5’ -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
E19F:5’ - TGGAGGAGGTGGGCATCTA -3’
A2R:5，- AGTTCCAACGAGCGGCTT -3，
A2P:5’ -FAM- CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC -TAMRA-3，
ElF:5’ - CTCGCAGAACTCGCAACAG -3，
E13F:5’ - GATGCTGACCAACTCGTGTGT -3’
E14F:5’ - GTCATCGTCCACTCAGCCAC -3’
A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，根據(jù)步驟(3)中的判斷結(jié)果，若是a2組，則進(jìn)行e6a2，e8a2，el9a2型別鑒定；若是a3組，則進(jìn)行ela3，el3a3，el4a3型別鑒定。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，用于通過所述熒光PCR擴(kuò)增進(jìn)行具體型別定量鑒定的引物和探針的核苷酸序列為: 鑒定e6a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下 :
E6F:5’ -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
A2R:5，- AGTTCCAACGAGCGGCTT -3，A2P:5’ -FAM- CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC _TAMRA_3， 鑒定e8a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
A2R:5，- AGTTCCAACGAGCGGCTT -3，
A2P:5’ -FAM- CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC -TAMRA-3， 鑒定el9a2型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
E19F:5’ - TGGAGGAGGTGGGCATCTA -3’
A2R:5，- AGTTCCAACGAGCGGCTT -3，
A2P:5’ -FAM- CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC -TAMRA-3， 鑒定ela3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
ElF:5’ - CTCGCAGAACTCGCAACAG -3，
A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3， 鑒定el3a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
E13F:5’ - GATGCTGACCAACTCGTGTGT -3’
A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3， 鑒定el4a3型別的引物和探針的核苷酸序列如下:
E14F:5’ - GTCATCGTCCACTCAGCCAC -3’
A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3’。
10.一種篩查和鑒定 BCR-ABL 融合基因 e6a2、e8a2、el9a2、ela3、el3a3 和 el4a3 這 6 種非常見融合型別的試劑盒，包括血液RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括引物和探針，其特征在于，所述引物和探針的核苷酸序列如下:
E6F:5’ -GAGCCAGAAGCAACAAAGATG-3，
E8F:5’ -TTCCTGTCCAGCATCAATGAG-3’
E19F:5’ - TGGAGGAGGTGGGCATCTA -3’
A2R:5，- AGTTCCAACGAGCGGCTT -3，
A2P:5’ -FAM- CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC -TAMRA-3，
ElF:5’ - CTCGCAGAACTCGCAACAG -3，
E13F:5’ - GATGCTGACCAACTCGTGTGT -3’
E14F:5’ - GTCATCGTCCACTCAGCCAC -3’
A3R:5’ -TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’
A3P:5’ -FAM-CTCCGGGTCTTAGGCTATAATCAC-TAMRA-3，
ABL-F:5’ -GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3，
ABL-R:5’ -CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3’
ABL-P:5’ -FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT - TAMRA-3’。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571945SQ201310450028
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】鄒媛, 董越, 金海波, 陳紅梅, 夏成青 申請人:沈陽艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司