黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的熒光定量pcr檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用。該檢測(cè)技術(shù)利用熒光染料（SYBRGreenI）和正義引物、反義引物和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，可以快速、定量地檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌。同時(shí)，該方法可直接定量檢測(cè)模擬病種表面所帶的病原菌，省去了提取病原菌DNA的步驟，大大節(jié)省檢測(cè)的時(shí)間，降低檢測(cè)難度，并能真實(shí)反應(yīng)種子帶菌量，為病害的早期預(yù)測(cè)和預(yù)警提供方法和基礎(chǔ)。因此，該方法適合作為植物病害診斷檢測(cè)方法推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為一種黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用，專用于檢測(cè) 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌，屬于農(nóng)作物病害診斷與防治【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜細(xì)菌性角斑病由丁香假單胞流淚致病變種sjriflgae pv. /^乃引起，該病原菌屬于丁香假單胞50個(gè)致病變種之一，是引起黃瓜 (Ci/c腫is safiras)的主要細(xì)菌性病害之一。該病原引起細(xì)菌性角斑?。ˋngular leaf spot)，在世界上廣泛發(fā)生，我國(guó)主要分布在華北、東北及華中地區(qū)，保護(hù)地及露地生產(chǎn)中均 有發(fā)生。感病植物的主要癥狀：葉脈呈水浸狀小斑點(diǎn)，病斑褪綠，進(jìn)一步擴(kuò)展逐漸發(fā)展成為 近圓形或不規(guī)則病斑，病果會(huì)出現(xiàn)水浸狀病斑。黃瓜細(xì)菌性角斑病發(fā)病時(shí)間短，在適宜的發(fā) 病條件下7-10d可發(fā)病，除頂端嫩葉外，可使黃瓜整株葉片枯死，影響結(jié)瓜產(chǎn)量，一般減產(chǎn) 可達(dá)30%-50%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 傳統(tǒng)的病原細(xì)菌檢測(cè)采用培養(yǎng)基分離純化與致病性鑒定的方法，隨后血清學(xué)技術(shù) 的應(yīng)用使得病原細(xì)菌的快速檢測(cè)成為可能。Rassmusen和Prosen于1991年首次采用PCR 方法檢測(cè)植物病原菌及感染種子，推動(dòng)基于PCR方法的植物病原菌檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展。20 世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)靶標(biāo)核酸進(jìn)行精確定量檢測(cè)，突 破了傳統(tǒng)PCR技術(shù)只能對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行定性檢測(cè)的局限。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理是 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 曲線和Ct值對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常規(guī)PCR中，擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子）是通過(guò)終 點(diǎn)法來(lái)分析檢測(cè)，即PCR反應(yīng)結(jié)束后，DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行成像分析。相對(duì)常 規(guī)PCR而言，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)植物病原菌的主要優(yōu)點(diǎn)是有實(shí)時(shí)性強(qiáng)，靈敏 度高，特異性強(qiáng)，反應(yīng)過(guò)程封閉，操作簡(jiǎn)易，處理量高等。
[0004] 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病原菌的快速檢測(cè)最早采用的方法是免疫學(xué)方法，特別是 ELISA。Fogliano等建立基于ELISA的檢測(cè)方法可以定量到0. lmg/g植物組織的角斑病原 菌。而由于丁香假單胞種下致病變種多，難以獲得特異性好的抗體，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 基于PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)方法不受植物病癥的限制，具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)。目前，通過(guò) ITS等序列的常規(guī)PCR方法可特異性檢測(cè)角斑病原菌，但由于常規(guī)PCR本身存在的局限性， 使得該方法的靈敏度和特異性受到局限，且常規(guī)PCR為半定量，不能定量檢測(cè)受檢植株或 種子上的病原菌。由于黃瓜細(xì)菌性角斑病原菌為種傳，少量甚至微量的病原菌在合適的氣 候條件下能夠很快地傳播，導(dǎo)致嚴(yán)重的病害流行，故高靈敏性和高特異性的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病原菌的方法和對(duì)帶菌種子的檢測(cè)技術(shù)亟需建立。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供角斑病菌的熒光定量PCR快速檢測(cè)的方法，克服角斑病菌 傳統(tǒng)檢測(cè)方法和半定量PCR檢測(cè)方法的不足。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種熒光定量PCR試劑盒在黃瓜細(xì)菌性角斑病流 行動(dòng)態(tài)檢測(cè)和種子帶菌的早期檢測(cè)等應(yīng)用。
[0007] 該檢測(cè)技術(shù)，在植物病害診斷與防治領(lǐng)域適合推廣。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)具體包括以下步驟： 1、 采用改良CTAB法提取病原菌總DNA，模擬帶菌種子采用0. 1%吐溫20直接洗脫表面 病原菌，得到相應(yīng)的DNA樣本； 2、 特異性引物設(shè)計(jì)，為避免PCR反應(yīng)中出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或?qū)Ψ悄繕?biāo)菌株產(chǎn)生非特 異性擴(kuò)增，本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)分析丁香假單胞菌屬0°. 下不同致病變種的甘 油醛-3-磷酸脫氫酶(#3/77)基因序列，采用CLUSTAL對(duì)該區(qū)序列進(jìn)行比較，尋找黃瓜 細(xì)菌性角斑病原菌的特異序列，利用Primer5. 0針對(duì)該序列設(shè)計(jì)了其特異性熒光定量 PCR弓丨物Pslgapl-F/Pslgapl-R;通過(guò)Blastprogram(http://blast,ncbi.nlm.nih. Rov/Blast.CRi)比較所設(shè)計(jì)的引物序列與其它生物種屬?zèng)]有顯著同源性，并在丁香 假單胞菌屬0°. 下不同致病變種間顯示出高的特異性。正義引物序列為： (5'-TCGGCGACGCAATCAAT-3'），反義引物序列為：（5'-GGTGGITTCACGCTTCAGG-3'），擴(kuò)增片段 大為 162bp;Pseudomonassyringaepv.lachrymansStJglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(辟/77)基因部分序列登錄號(hào)為（HQ171970. 1)和（AY610653. 1); 3、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：熒光定量反應(yīng)體系為25沿，其中濃度為10Mm〇l/L正 義引物Pslgapl-F和反義引物Pslgapl-R各0.25rt、熒光染料SYBR Premix Ex Taq (內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR Green I 和 dNTP Mixture) 12.51^1，標(biāo)準(zhǔn)品 10 倍梯度稀 釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液0. 5W，ddH20補(bǔ)齊至25W ; 4、 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR采用兩步法，94°C 30s，然后94°C 5s、62°C 30s為1個(gè)循環(huán)， 共35個(gè)循環(huán)。PCR完成后，按0. 1°C /s升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn) 證； 5、 pMD-20載體插入辟片段序列后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a進(jìn)行增殖，提取質(zhì)?；蚪M DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量，10倍梯度稀釋成6個(gè)濃度梯度（2.6ng-2.6fg DNA / Ul)，按照上述PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個(gè)濃度梯度的循環(huán)閾值 (Ct)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6、 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在實(shí)時(shí)熒光 定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì)照采用ddH 20， 陽(yáng)性對(duì)照采用角斑病菌菌株基因組DNA;反應(yīng)結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值（Ct)與標(biāo)準(zhǔn)曲 線對(duì)照，得到DNA樣本中的區(qū)基因片段拷貝數(shù)，進(jìn)而得到原來(lái)樣本中角斑病菌的濃度。
[0009] 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以生成試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA 模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由含有插入目的片段的PGM-T(購(gòu)自天根公司）載體制備而成。 標(biāo)準(zhǔn)品的制備過(guò)程為：采用引物Pslgapl-F和Pslgapl-R擴(kuò)增角斑病菌的^卻彳部分序列， 電泳PCR產(chǎn)物后切下含有目的片段的凝膠，凝膠試劑盒回收純化目的片段，加入pGM-T載體 后16°C過(guò)夜連接，采用大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB平板記性培養(yǎng)， 挑取白斑，采用引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R進(jìn)行PCR鑒定。通過(guò)序列分析進(jìn)一步鑒定陽(yáng) 性克隆結(jié)果的可靠性。選擇PCR和序列分析均為陽(yáng)性的克隆菌落，將其接種到含有氨芐青 霉素的LB培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。質(zhì)粒DNA采用質(zhì)粒小提試劑盒提取。DNA經(jīng)A260紫外分光光 度計(jì)定量，10倍梯度稀釋為2. 6ng-2. 6fg /iil，于-20°C保存。
[0011] 熒光定量反應(yīng)體系由正義引物Pslgapl-F、反義引物Pslgapl-R、熒光染料SYBR Premix Ex Taq 內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR Green I 和 dNTP Mixture 組成。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25 iil，其中SYBR Premix Ex Taq 12.5111，1011111〇1正義引物？8化&口14和反義引物？8化&口1-1?各0.25111，標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度 稀釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液0. 5iU，用ddH20補(bǔ)充至25iU。PCR采用兩步法，94°C 30s， 然后94°C 5s、62°C 30s為1個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)。
[0013] 本發(fā)明提供的角斑病菌熒光定量PCR試劑盒，針對(duì)角斑病菌基因組辟以基因特異 的靶序列設(shè)計(jì)引物。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系（引物濃度、模版DNA濃度、擴(kuò)增程序等）的優(yōu)化，采 用定量檢測(cè)系統(tǒng)(包括ABI Prism系統(tǒng)、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad)，可用于黃瓜細(xì) 菌性角斑病菌靈敏的、快速的、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。此熒光定量PCR檢測(cè)方法多次重復(fù)試驗(yàn)誤 差值很小，復(fù)現(xiàn)性良好，引物對(duì)的檢測(cè)靈敏度限點(diǎn)為2. 6X l(T2fg質(zhì)粒DNA /yl，相當(dāng)于297 個(gè)細(xì)胞，比普通PCR靈敏性高出1000倍。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果： 1)特異性高、鑒定速度快 引物擴(kuò)增角斑病菌的特異性序列，PCR檢測(cè)特異性高。自然條件下，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的 方法檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病過(guò)程繁瑣，鑒定周期長(zhǎng)，在生產(chǎn)實(shí)踐中達(dá)不到快速鑒定的要求， 本發(fā)明克服了這一不足之處，并且對(duì)于病種、病植株表面帶菌的檢測(cè)無(wú)需DNA提取步驟，檢 測(cè)速度快。
[0015] 2)靈敏度高、可準(zhǔn)確定量 與普通PCR檢測(cè)相比，本發(fā)明可以準(zhǔn)確定量目標(biāo)菌株。本方法在濃度為2. 6ng-2. 6fg/ ill目標(biāo)DNA濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，且檢測(cè)靈敏度比普通PCR高1000倍；同時(shí) 該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。
[0016] 3)實(shí)用性高、應(yīng)用范圍廣 可以定量檢測(cè)帶菌種子上的黃瓜細(xì)菌性角斑病菌，結(jié)合該病害種傳發(fā)病閾值，可以為 病害的早期預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供方法依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R特異性檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1、2的模板 為黃瓜細(xì)菌性角斑病菌基因組DNA，3~13的模板分別為番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌DNA、平菇褐斑 病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘藍(lán)黑腐病菌NA、絲瓜葉斑病菌DNA、西葫蘆葉斑病菌DNA、大 白菜軟腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌DNA、黃瓜枯萎病菌DNA、甘藍(lán)黑斑病菌DNA、黃瓜褐斑病菌 DNA ;N 為陰性對(duì)照；M 為 150bp DNA ladder (Takara 公司）； 圖2實(shí)施例1熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱軸為Ct值，橫軸為L(zhǎng)og DNA ;標(biāo)準(zhǔn)誤為 0. 997 ； 圖3實(shí)施例1熒光定量PCR引物特異性擴(kuò)增溶解曲線，縱軸為Delta Rn;橫軸為Cycle Number，曲線a，b，c，d，e和f的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量分別為2. 16ng， 216pg，21.6pg，2. 16pg，216fg，21.6fg ;其中1的模板為黃瓜細(xì)菌性角斑病菌基因組DNA， 2?12的模板分別為番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌DNA、平菇褐斑病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘藍(lán) 黑腐病菌NA、絲瓜葉斑病菌DNA、西葫蘆葉斑病菌DNA、大白菜軟腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌 DNA、黃瓜枯萎病菌DNA、甘藍(lán)黑斑病菌DNA、黃瓜褐斑病菌DNA ; 圖4實(shí)施例2中田間病植株樣本分離的細(xì)菌性角斑病原菌和陽(yáng)性對(duì)照菌株的PCR擴(kuò)增 結(jié)果，其中1~7的模板為分別對(duì)應(yīng)表2中不同黃瓜細(xì)菌性角斑病菌供試菌株的基因組DNA ; N 為陰性對(duì)照；M 為 150bp DNA ladder (Takara 公司）； 圖5實(shí)施例2田間病植株樣本分離的黃瓜細(xì)菌性角斑病原菌和陽(yáng)性對(duì)照菌株熒光定量 PCR擴(kuò)增的溶解曲線，縱軸為Delta Rn;橫軸為Cycle Number，模板為分別對(duì)應(yīng)表2中不同 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌供試菌株的基因組DNA ; 圖6普通PCR靈敏性擴(kuò)增結(jié)果，其中1~12的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量 分別為 2. 6ng，260pg，26pg，2. 6pg，260fg，26fg，2. 6fg，0? 26fg，2. 6 X l(T2fg，2. 6 X l(T3fg， 2.6父1041^，2.6\1051^#為陰性對(duì)照；]\1為150匕卩0嫩1&(1(161'(丁&1^四公司）； 圖7實(shí)施例3熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，縱軸為Delta Rn;橫軸為Cycle Number，曲線1，2,3,4,5和6的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量分別為2. 16ng， 216pg, 21. 6pg, 2. 16pg, 216fg, 21. 6fg〇

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明要求保護(hù)范圍。 實(shí)施例1黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的特異性引物檢測(cè) 采用黃瓜細(xì)菌性角斑病菌、丁香假單胞菌屬下其他致病變種以及其他蔬菜常見細(xì)菌真 菌性病害病原菌為材料，對(duì)角斑病菌引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R進(jìn)行特異性檢測(cè)。相關(guān) 病原細(xì)菌菌株在NA培養(yǎng)基培養(yǎng)。其它病原真菌菌株在ro培養(yǎng)基培養(yǎng)；所有菌株由固體培 養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，病原細(xì)菌28°C培養(yǎng)24h，病原真菌28°C培養(yǎng)1周后收集菌 絲或菌體提取DNA。DNA的提取采用改良CTAB提取法。
[0019] 以角斑病菌及丁香假單胞菌屬下其他致病變種以及其他蔬菜常見細(xì)菌真菌性病 害病原菌基因組DNA為模板，利用引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，同時(shí)用 該熒光定量PCR體系對(duì)上述菌株進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)該引物的特異性。普通PCR反應(yīng)體系如 下：總反應(yīng)體積 25 ii L，10XPCR buffer 2. 5 ii L，dNTP (10 ii mol/L)0. 5 ii L，引物（10 ii mol/ L)各 0? 25 ii L，模板 DNAO. 5 ii L，TaqDNA 聚合酶 0? 5 ii L，最后以 ddH20 補(bǔ)足至 25 ii L。PCR 反 應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72°C 延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)；突光定量PCR循環(huán)結(jié)束后，采用 儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果。
[0020] 特異性檢測(cè)引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R對(duì)角斑病菌及丁香假單胞菌屬下其他 致病變種以及其它常見真細(xì)菌性病原菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié)果表明該引物具有良好的特 異性。62°C退火條件下，只有角斑病菌擴(kuò)增出162bp的產(chǎn)物，其他菌株和陰性對(duì)照均無(wú)相應(yīng) 擴(kuò)增產(chǎn)物。熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線，只有陽(yáng)性質(zhì)?？寺『徒前卟?菌在89°C有單一峰值，其他對(duì)照菌株和陰性對(duì)照無(wú)明顯峰值，說(shuō)明該引物特異性良好。
[0021] 表1引物特異性檢測(cè)菌株

【權(quán)利要求】
1. 一種黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于包括以下步驟： 1) 采用改良CTAB法提取病原菌總DNA，模擬種子帶菌采用0. 1%吐溫20直接洗脫表面 病原菌，得到相應(yīng)的DNA樣本； 2) 特異性引物設(shè)計(jì)，通過(guò)分析丁香假單胞菌 sjriflgae)不同致病變種 的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(濟(jì)識(shí)7 )基因序列，采用CLUSTAL方法進(jìn)行序列比較，對(duì)黃瓜細(xì)菌 性角斑病原菌設(shè)計(jì)了其特異性PCR引物對(duì)Pslgapl-F/Pslgapl-R，所述的引物對(duì)為：正義 引物 Pslgapl-F 序列為：5'_ TCGGCGACGCAATCAAT -3'，反義引物 Pslgapl-R 序列為：5'_ GGTGGTTTCACGCTTCAGG -3'； 3) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：熒光定量反應(yīng)體系為25沿，其中濃度為10Mm〇l/L正 義引物Pslgapl-F和反義引物Pslgapl-R各0.25W、熒光染料SYBR Premix Ex Taq (內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR Green I 和 dNTP Mixture) 12.51^1，標(biāo)準(zhǔn)品 10 倍梯度稀 釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液0. 5W，ddH20補(bǔ)齊至25W ; 4. PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR采用兩步法，94°C 30s，然后94°C 5s、62°C 30s為1個(gè)循環(huán)，共 35個(gè)循環(huán)，PCR完成后，按0. 1°C /s升溫速率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證； 5) 插入辟/72片段序列的pMD-20載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a增殖后提取的質(zhì)?；蚪M DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個(gè)濃度梯度（2. 6ng-2. 6fg DNA y r1)，按照上述PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個(gè)濃度梯度的循 環(huán)閾值（Ct)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6) 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì) 照采用ddH20,陽(yáng)性對(duì)照采用角斑病菌菌株基因組DNA ;反應(yīng)結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值 (Ct)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到DNA樣本中的^^7基因片段拷貝數(shù)，進(jìn)而得到原來(lái)樣本中角斑 病菌的濃度。
2. 權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù) 可以轉(zhuǎn)化成商品化的檢測(cè)試劑盒，試劑盒包括：正義引物Pslgapl-F、反義引物Pslgapl-R、 熒光染料 SYBR Premix Ex Taq 內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR Green I 和 dNTP Mixture,以及由插入gapl片段序列的pMD-20載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，增殖后提取的質(zhì)粒 DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍梯度稀釋。
3. 權(quán)利要求1所述的對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以應(yīng)用于對(duì) 農(nóng)田環(huán)境中黃瓜植株上細(xì)菌性角斑病菌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并可以應(yīng)用于種子帶菌及帶菌量的檢 測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450868SQ201310415572
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】李寶聚, 陳璐, 謝學(xué)文, 石延霞, 柴阿麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所