一種馬流產(chǎn)沙門菌pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可用于檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCCT3’下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC3’，PCR檢測方法：提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH2O，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴(kuò)增；在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物；分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。該P(yáng)CR試劑盒配制方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，PCR檢測方法檢測馬流產(chǎn)沙門菌的靈敏度高、檢測周期短、速度快、可操作性強(qiáng)、其檢測精度達(dá)30個菌或5.7pg的模板DNA，而檢測成本卻相對較低，在該病的臨床防控中具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】—種馬流產(chǎn)沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可用于檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，具體內(nèi)容是利用試劑盒中自行設(shè)計的特異引物，結(jié)合PCR檢測方法檢測馬流產(chǎn)沙門菌，為馬流產(chǎn)沙門菌的檢測提供了一種特異、敏感、快速的方法。
技術(shù)背景
[0002]馬副傷寒性流產(chǎn)是由馬流產(chǎn)沙門氏桿菌所引起的馬屬動物的一種慢性傳染病，在臨床上無明顯的全身癥狀，以孕馬突然流產(chǎn)為特征。該病廣泛地分布于世界各國，在歐洲18-19世紀(jì)大批流行，1893年由Smith和hlome發(fā)現(xiàn)本菌后，在世界各地均發(fā)現(xiàn)此病。渡部氏于1939年曾報告在內(nèi)蒙海拉爾地區(qū)某些馬場中發(fā)現(xiàn)本病，1958年河北省壩上地區(qū)某些馬場中亦有發(fā)生。1959和1963年察北牧場流產(chǎn)80余匹，流產(chǎn)率分別達(dá)53%以上。
[0003]準(zhǔn)確而快速的診斷是控制疾病的關(guān)鍵，在疾病暴發(fā)時顯得尤其重要。診斷的速度決定疾控響應(yīng)的速度，而疾控響應(yīng)的速度又決定疾病傳播的范圍、疾病控制的成敗和經(jīng)濟(jì)損失的程度。在我國隨著養(yǎng)馬業(yè)的快速發(fā)展對馬流產(chǎn)的診斷也越來越受重視。
[0004]馬流產(chǎn)沙門菌傳統(tǒng)的診斷方法主要依靠流產(chǎn)病原材料中病原微生物學(xué)分離、培養(yǎng)和生化試驗等進(jìn)行鑒定。這種方法存在諸多局限性，如馬流產(chǎn)沙門菌在生化試驗時往往出現(xiàn)不一致現(xiàn)象，可靠性差。另外檢測周期長，一般至少需要7~14d才能做出結(jié)果，極不利于對患馬進(jìn)行及時治療。此外一些養(yǎng)殖場特別是發(fā)展中國家的普遍使用抗生素使得檢測沙門氏菌較困難。
[0005]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新的分子生物學(xué)技術(shù)正在被用來進(jìn)行馬流產(chǎn)沙門菌的分離鑒定。最近幾年出現(xiàn)了一些新的檢測方法，如:膠乳凝集反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗，免疫熒光試驗、和DNA雜交試驗。這些方法雖然快速但特異性差，且免疫方法檢測沙門氏菌的檢出率較低，從而限制了它們的推廣和應(yīng)用。
[0006]PCR技術(shù)近年來在檢測沙門氏菌方面得到了廣泛的應(yīng)用，其具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡便、能高通量檢測、重復(fù)性好等突出優(yōu)點?？傊甈CR技術(shù)的應(yīng)用很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的弊端。PCR法已被證明可為檢測沙門氏菌提供一個新方法。PCR診斷方法與傳統(tǒng)的形態(tài)染色、培養(yǎng)特性和生化鑒定方法相比較，能夠提高檢測靈敏度、縮短檢測時間、簡化檢測程序，實現(xiàn)檢測的自動化、快速化、特異化，在沙門氏菌的臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價值。
[0007]國內(nèi)目前對馬流產(chǎn)沙門氏菌的研究較少，診斷也主要依靠傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)和生化試驗等進(jìn)行鑒定，這些方法過程復(fù)雜，周期長，所需試劑繁多，可靠性差。目前PCR技術(shù)在檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌方面的研究和應(yīng)用還尚未見報道。
[0008]發(fā)明目的
[0009]針對目前國內(nèi)馬業(yè)快速發(fā)展及馬流產(chǎn)沙門菌病診斷和研究中對于快速簡便診斷方法的需求，本發(fā)明提供了一種馬流產(chǎn)沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)已發(fā)表的馬流產(chǎn)沙門菌基因序列，設(shè)計合成引物，擴(kuò)增得到了 1300bp的基因產(chǎn)物。該P(yáng)CR診斷方法與傳統(tǒng)的形態(tài)染色、培養(yǎng)特性和生化鑒定方法相比較，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，并且具特異性好，靈敏度高，在該病的臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明建立的馬鏈球菌馬亞種PCR診斷方法具有以下特征:
[0011](I)自行設(shè)計的鑒定引物，利用PCR方法擴(kuò)增基因片段，擴(kuò)增引物正向引物為上游引物是 5 ’ ATTAGTGCCGGTTTTATCGT3，下游引物是 5 ’ TTACCACTCGCATCAAATC3，經(jīng)該引物的擴(kuò)增應(yīng)得到1300bp的條帶。
[0012](2)對被檢細(xì)菌的基因組的PCR擴(kuò)增。
[0013]將提取馬流產(chǎn)沙門菌基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到1300bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。
[0014](3)對建立的馬流產(chǎn)沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的敏感性檢測。
[0015]提取細(xì)菌的基因組DNA，進(jìn)行5倍梯度稀釋，對提取各稀釋度基因組DNA按最適條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，以確定本方法對該菌的檢測限。
[0016](4)建立的馬流產(chǎn)沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的特異性的檢測。
[0017]利用所建立的馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR方法擴(kuò)增經(jīng)煮沸法提取的試驗菌株的基因組DNA,驗證本方法的特異性。
[0018]發(fā)明效果
[0019](I)與傳統(tǒng)和現(xiàn)有的方法相比該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有操作簡便的特點。
[0020](2)與傳統(tǒng)和現(xiàn)有的方法相比該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有檢測速度快的優(yōu)點。
[0021](3)該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有靈敏度高的特點。
[0022](4)該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有特異性強(qiáng)的特點，非常適用于馬流產(chǎn)沙門氏菌的準(zhǔn)確的檢測與診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是馬流產(chǎn)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳結(jié)果圖。
M:DL2000DNA Marker ；1:陽性菌株2:陰性對照菌株。
[0024]圖2是馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測結(jié)果圖。
M =DNAMarker DL20001:基因組未稀釋的2:基因組10倍稀釋3:基因組20倍稀釋4:基因組50倍稀釋5:基因組100倍稀釋6:基因組200倍稀釋7:基因組500倍稀釋8:基因組103倍稀釋9:基因組104倍稀釋。
[0025]圖3是建立的馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測結(jié)果圖。
M:DNA Marker DL20001:馬流產(chǎn)沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株；2:金黃色葡萄球菌分離株3:鏈球菌獸疫亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株4:大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株5:大腸桿菌DH5a菌株6:大腸桿菌BL21菌株。
具體實施方案[0026]為了更好地理解本發(fā)明，通過以下實施實例予以進(jìn)一步說明，但并非對本發(fā)明的限定。
[0027]實施例1:被檢細(xì)菌基因組的提取及目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增。
[0028]基因組的提取
[0029]將純化好的菌株接種于3mL的液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。具體方法如下:
[0030](I)取過夜培養(yǎng)的1.5mL菌液，離心，棄去培養(yǎng)基，再用滅菌去離子水，400uL旋沉淀，充分混勻后，再次離心，12000rpm, 5min。重復(fù)上述操作一次。
[0031](2)棄去上清后，加入400uL的TE緩沖液，充分混勻后加入IOOuL (20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0032](3)加入80uL10% SDS溶液，充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0033](4)加入 IOOuL 5mol/L Nacl 溶液和 80uL CTAB/Nacl 溶液，充分混勻，37°C水浴30min, -20°C放置 20min。
[0034](5)加入500uL酚:氯仿抽提液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24:1)，充分混勻，12000rpm，離心lOmin。輕輕的吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中。
[0035](6)重復(fù)(5) —次
[0036](7)加入0.1倍體積的醋酸鈉(pH = 5.2)和0.6倍體積的異戊醇，輕輕的顛倒混勻，-20°C放置 20min。
`[0037](8)離心 12000rpm, IOmin,棄上清，沉淀用 70 % 乙醇 400ul 清洗沉淀，12000rpm,Smin離心，用移液器輕輕的吸出上清，敞開管口，置于室溫，待乙醇揮發(fā)完全。加入20uL的TE緩沖液，充分溶解沉淀，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0038]將提取后的基因組進(jìn)行凝膠電泳鑒定。
[0039]目的基因的PCR擴(kuò)增
[0040]PCR反應(yīng)體系(20uL):無酶水8.5uL，taq酶混合物10uL，上游引物0.5uL，下游引物 0.5uL，模板 0.5uL。
[0041]PCR擴(kuò)增程序為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，54°C退火30S，72°C延伸90S，循環(huán)30次，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0042]PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，片段長度約為1300bp的陽性產(chǎn)物。
[0043]實施例2:對建立的馬流產(chǎn)沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的敏感性檢測。
[0044]初始濃度為57ng/ μ L的被檢菌基因組DNA經(jīng)200倍稀釋后仍能觀察到擴(kuò)增條帶(見圖2)，表明本PCR方法對培養(yǎng)菌DNA的檢測靈敏度約為5.7pg。
[0045]實施例3:建立的馬流產(chǎn)沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的特異性的檢測。
[0046]利用建立的沙門氏菌PCR方法對數(shù)株細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測，沙門氏菌為陽性，而其他菌株均表現(xiàn)陰性(見圖3)，說明本研究建立的PCR方法具有特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種用于馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒包括引物，dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’ ATTAGTGCCGGTTTTATCGT 3’，下游引物是5’ TTACCACTCGCATCAAATC 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的特異性引物對被檢測的細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增應(yīng)得到1300bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒，該診斷方法應(yīng)當(dāng)具有的敏感性為30個菌或5.7pg的模板DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒，其特征是該試劑盒對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌35218，大腸桿菌DH5 α，大腸桿菌BL21以及獸疫鏈球菌等的擴(kuò)增呈陰性結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬流產(chǎn)沙門氏菌PCR檢測試劑盒包括其在馬流產(chǎn)沙門菌病的臨床診斷和研究中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484537SQ201310298849
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】蘇艷, 邵俊高, 楊康, 張寶江 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)