專利名稱：一種花生spl轉(zhuǎn)錄因子基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花生(Arachis hypogaea L.)是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)是全球最大的花生生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和糧油安全具有重要的戰(zhàn)略意義?；ㄇ嗨厥且环N超強(qiáng)抗氧化的天然物，具有預(yù)防心血管疾病、延緩細(xì)胞老化、減緩糖尿病癥、改善視力及抗癌等功能，因此廣泛應(yīng)用于保健食品及化妝品中。目前，黑米、黑豆等黑色食品因富含花青素、維生素以及多種微量元素而受到廣大消費(fèi)者的青睞。彩色花生，又名五彩花生，按照籽粒種皮顏色可以分為黑、紫黑、白、紫紅、紅白、彩粒等色系。其中黑色花生更是一種典型的堿性食品，在調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能，提高機(jī)體免疫力以及疾病預(yù)防等方面發(fā)揮重要作用。目前，隨著人民生活水平的提高以及保健意識(shí)的增強(qiáng)，彩色花生的市場(chǎng)需求也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于綠色植物中。SPL在植物形態(tài)建成、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變、孢子發(fā)生、花和果實(shí)發(fā)育、花青素積累、逆境脅迫應(yīng)答以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生理生化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用(Gouet al.，2011)。例如，擬南芥 AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5、AtSPL9、AtSPLlO 等可以控制植物幼年期到成年期以及成花轉(zhuǎn)變；擬南芥AtSPLS不僅參與調(diào)控GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且在維持植物育性方面發(fā)揮重要作用；擬南芥AtSPL9和AtSPLlO可以通過(guò)MYB-bHLH-WD40復(fù)合體以及DFR調(diào)控花青素合成代謝，過(guò)量表達(dá)AtSPL9和AtSPLlO會(huì)抑制花青素積累；水稻0sSPL14是控制水稻株型的關(guān)鍵基因， 它可以減少水稻的分蘗數(shù)，增加花序分枝、穗粒數(shù)以及千粒重，從而提高水稻產(chǎn)量；0sSPL16則可以控制米粒大小、形狀和色澤；番茄LeSPL-CNR是控制果實(shí)成熟的一個(gè)關(guān)鍵基因，該基因發(fā)生突變會(huì)抑制果實(shí)的正常成熟。鑒于人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品多樣性的需求以及保健意識(shí)的增強(qiáng)，利用現(xiàn)有的一些花生種質(zhì)資源，深入研究花生花青素積累的生理生化以及分子生物學(xué)機(jī)制，從而挖掘出一些花青素合成代謝過(guò)程中的關(guān)鍵性基因，并運(yùn)用基因工程手段培育紫色或黑色農(nóng)作物，對(duì)于提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。SPL是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，涉及多種代謝途徑及生理生化過(guò)程，但關(guān)于SPL能夠促進(jìn)花青素積累的研究還未見報(bào)道，該研究具有一定的創(chuàng)新性和前瞻性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在充分利用花生紫色突變體的基礎(chǔ)上，提供一種促進(jìn)花青素積累的轉(zhuǎn)錄因子基因一 SPL2-1及其編碼蛋白與應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:
一種促進(jìn)花青素積累的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1，核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。一種促進(jìn)花青素積累的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一種重組載體，是將SEQ ID N0.1所示核苷酸序列連接入載體中獲得。一種重組細(xì)胞，該細(xì)胞包含有上述重組載體或表達(dá)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1。上述花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1、重組載體和/或重組細(xì)胞在提高作物中花青素含量的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述作物為花生、小麥、水稻或玉米。有益效果本發(fā)明利用一個(gè)花生紫色突變體，通過(guò)RACE技術(shù)克隆到SPL2-1轉(zhuǎn)錄因子基因。分別測(cè)定了花生紫色突變體以及豐花I號(hào)的根、莖和葉片中花青素含量；并且采用Real-timePCR技術(shù)定量檢測(cè)SPL2-1 在紫色突變體以及豐花I號(hào)的根、莖和葉片中的相對(duì)表達(dá)水平；結(jié)果顯示，紫色突變體以及豐花I號(hào)的根、莖、葉中青素含量同SPL2-1的表達(dá)水平非常吻合；紫色突變體的莖和葉片中花青素含量顯著高于豐花I號(hào)，SPL2-1的表達(dá)水平也顯著高于豐花I號(hào)；兩者根中花青素含量基本一致，SPL2-1的表達(dá)水平也沒(méi)有明顯差異。在煙草中過(guò)量表達(dá)SPL2-1可以提高轉(zhuǎn)基因煙草中花青素含量。從而為提高作物中花青素含量打下了基礎(chǔ)。


圖1、花生紫色突變體以及豐花I號(hào)中花青素含量測(cè)定結(jié)果；其中:Root為根、Stem為莖、Leaf為葉、Purple表示紫色突變體、Green表示豐花I號(hào);圖2、花生紫色突變體以及豐花I號(hào)中SPL2-1的相對(duì)表達(dá)水平；其中:Root為根；Stem為莖；Leaf為葉；Purple表示紫色突變體；Green表示豐花I號(hào)。圖3、轉(zhuǎn)基因煙草葉片中花青素含量；其中:T3-2為轉(zhuǎn)基因煙草T3-2株系；T5_7為轉(zhuǎn)基因煙草T5-7株系。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合說(shuō)明書附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。生物材料花生紫色突變體和煙草品種SRl購(gòu)自山東魯生生物科技有限公司；豐花I號(hào)花生購(gòu)自山東種業(yè)集團(tuán)有限公司?；ㄉ仙蛔凅w以及豐花I號(hào)花生品種的種植選取種仁飽滿、沒(méi)有病蟲害及霉變的花生籽粒作為種子。首先溫水浸種2 4h，然后種植于直徑15cm，深I(lǐng)Ocm的花盆中。將花盆置于光照培養(yǎng)箱中，白天光照時(shí)間為16h，溫度(25±0.3) °C，濕度為80% ;夜晚黑暗時(shí)間8h，溫度(20±0.3) °C，濕度為80%。一周左右子葉即可出土，選取出土兩周左右的幼苗進(jìn)行樣品采集。實(shí)施例1:花生花青素含量測(cè)定參照Mancinelliet al (1991)和 Serrano et al (2012)的方法，分別測(cè)定花生紫色突變體及豐花I號(hào)的根、莖、葉中花青素含量。具體步驟如下:(I)稱取50mg花生材料置于1.5mL離心管中，用液氮將其研成粉末。(2)加入700iU酸性甲醇(CH3OH = HCl體積比為99:1)，4°C過(guò)夜提取。(注:設(shè)置三
組生物學(xué)重復(fù),每組重復(fù)測(cè)量3次。)(3)4°C，12000rpm離心lmin，取600 y L上清液置于新的離心管中，然后加入ImL三氯甲烷，再加400 ill蒸餾水。(4)4°C, 12000rpm離心IOmin,上清液用于花青素含量測(cè)定。(5)利用分光光度儀(U-3000，HITACHI)分別在530nm與657nm處測(cè)定吸光值。(6)花青素含量計(jì)算公式如下:花青素含量=(OD530-0.25 X OD657) /mOD530:花青素在530nm波長(zhǎng)下的光密度OD657:葉綠素在657nm波長(zhǎng)下的光密度111:樣品質(zhì)量(區(qū))測(cè)定結(jié)果如圖1所示。花青素測(cè)定結(jié)果顯示，花青素主要在花生的莖和葉片中積累，根中花青素含量較低；此外，花生紫色突變體的莖和葉片中花青素含量均明顯高于豐花I號(hào)。實(shí)施例2:花生SPL2-1基因克隆花生總RNA提取方法如下:(I)稱取Ig豐花I號(hào)莖和葉片的混合材料，液氮中徹底研磨，然后迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5mL Eppendof管中(每管大約200mg樣品)。(2) 65°C預(yù)熱CTAB提取液(組分:2wt%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，1.4mol/LNaCl，20mmo/L 乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0), 100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，2wt% 聚乙烯吡咯燒酮(pvp-40))。(3)加入600 u L預(yù)熱的CTAB提取液，迅速混勻，65°C溫浴5min，期間充分混勻3 5次。(4)冷卻至室溫后，加入等體積(600 iiL)的水飽和酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)混合液，充分混勻。(5) 4°C, 12000rpm,離心 15min。

(6)將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL Eppendof管中，加入等體積氯仿/異戍醇(體積比24:1)混合液，重復(fù)抽提一次。(7) 4°C, 12000rpm,離心 15min。(8)取上清，加入等體積異丙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒混勻，室溫靜置IOmin。(9) 4°C, 12000rpm,離心 20min。(10)棄上清，用體積比為70%的乙醇(_20°C預(yù)冷)清洗沉淀2 3次。(11)室溫下靜置3 5min，待沉淀干燥后，用30 50 焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O 溶解 RNA?；ㄉ俁NA純化方法如下:(I)在微量離心管中配制下列反應(yīng)液；
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)花青素積累的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種促進(jìn)花青素積累的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種重組載體，是將SEQ ID N0.1所示核苷酸序列連接入載體中獲得。
4.一種重組細(xì)胞，該細(xì)胞包含有上述重組載體或表達(dá)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1。
5.權(quán)利要求1所述花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因SPL2-1、權(quán)利要求3所述重組載體和/或權(quán)利要求4中的重組細(xì)胞在提高作物中花青素含量的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述作物為 花生、小麥、水稻或玉米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種花生SPL轉(zhuǎn)錄因子基因及其編碼蛋白與應(yīng)用?；ㄉㄇ嗨胤e累調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AhSPL2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明所提供的花生AhSPL2-1轉(zhuǎn)錄因子在植物花青素積累方面發(fā)揮重要作用，并在高花青素作物培育中具潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103215280SQ201310166928
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者王興軍, 李明, 夏晗, 李長(zhǎng)生, 趙術(shù)珍, 侯蕾, 李愛芹, 趙傳志 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心