一種飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方法，包含以下步驟：1)制備飲用水消毒工藝出水的提取物的溶液；2)用步驟1)的提取物溶液暴露處理離體的永生化人胚胎腎細(xì)胞；3)步驟2)處理后的細(xì)胞依次進(jìn)行EMA染色和SYTOX?Green染料染色；4)流式細(xì)胞儀分析。本發(fā)明的檢測(cè)方法可減少假陽(yáng)性結(jié)果，孔板離心排除碎片干擾，可實(shí)現(xiàn)飲用水消毒工藝水樣的遺傳毒性的快速、微量化、高通量分析，提高了檢測(cè)方法的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果易于統(tǒng)一，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠。
【專利說(shuō)明】一種飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水環(huán)境研究領(lǐng)域，涉及飲用水的毒性檢測(cè)分析，特別涉及一種飲用水 消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境污染對(duì)飲用水水質(zhì)造成威脅，飲用水消毒工藝有效控制飲用水中致病微生 物的介水傳染病等，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。但在消毒的同時(shí)，消毒劑不可避免的與水中 天然有機(jī)物（NOM，natural organic matters)及人為污染物、原水中存在的溴、碘離子 等反應(yīng)生成飲用水消毒副產(chǎn)物（disinfection by-products，DBPs) (Richardson，S.D.; Plewa, M. J. ；Wagner, E.D. ；Schoeny, R. ；DeMarini, D. M. , Occurrence,genotoxicity, and carcinogenicity of regulated and emerging disinfection by-products in drinking water ：a review and roadmap for research. Mutation Research/Reviews in Mutation Research [J] 2007,636 (1-3) : 178-242)。飲用水安全問(wèn)題得到廣泛關(guān)注，針對(duì)水質(zhì)評(píng)價(jià)開展 的方法研究具有重要意義。
[0003] 目前已報(bào)道的DBPs高達(dá)600多種，但飲用水消毒過(guò)程中產(chǎn)生復(fù)雜化合物還無(wú)法 通過(guò)化學(xué)分析一一識(shí)別。研究表明飲用水消毒過(guò)程中產(chǎn)生的部分副產(chǎn)物具有遺傳毒性，而 DBPs在飲用水中以混合物的形式存在，暴露途徑及相互作用尤為復(fù)雜，通過(guò)對(duì)單一 DBPs的 毒性試驗(yàn)無(wú)法準(zhǔn)確反映消毒工藝的潛在危害。生物毒性測(cè)試以其測(cè)定復(fù)雜環(huán)境樣品總體效 應(yīng)的優(yōu)勢(shì)彰顯，將快速、高通量的生物遺傳毒性測(cè)試體系應(yīng)用于飲用水水質(zhì)應(yīng)急與預(yù)警技 術(shù)研究顯得尤為重要。
[0004] 體外微核試驗(yàn)是一種檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷遺傳毒性的重要 方法(Michael Fenech. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis[J]2000,455(1-2)： 81-95)。自1959年由Evans等將蠶豆根尖細(xì)胞暴露于電離輻射，以微核發(fā)生率反映染色體 異常評(píng)價(jià)遺傳毒性以來(lái)，微核試驗(yàn)檢測(cè)方法、技術(shù)及手段也在不斷進(jìn)步，由傳統(tǒng)鏡檢法像自 動(dòng)化測(cè)試方向發(fā)展。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（0ECD)測(cè)試導(dǎo)則No. 487 (2010)及中華人民共和 國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T28646-2012對(duì)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)測(cè)試方法用于化學(xué)品檢測(cè)進(jìn)行 補(bǔ)充，將流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法納入規(guī)范。微核試驗(yàn)以其經(jīng)濟(jì)、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，且所誘發(fā)的 微核率在一定范圍內(nèi)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，適于定量化評(píng)價(jià)飲用水遺傳毒性。
[0005] 現(xiàn)有評(píng)價(jià)技術(shù)的缺點(diǎn)：傳統(tǒng)微核試驗(yàn)鏡檢方法試驗(yàn)周期長(zhǎng)，易受主觀因素影響； 微核的產(chǎn)生分為染色體斷裂劑及非整倍體毒劑作用兩種類型，以往流式細(xì)胞儀檢測(cè)較難區(qū) 分微核誘發(fā)原因，且多應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化合物分析，未對(duì)微核誘發(fā)因素的貢獻(xiàn)率作定量化計(jì)算。 目前采用污染指數(shù)定量評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)毒性，毒性反應(yīng)不夠直觀，毒性等級(jí)劃分有一定的 主觀性。在大量環(huán)境樣品遺傳毒性分析方面，現(xiàn)有微核技術(shù)較難滿足需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方 法，包含以下步驟：
[0007] 1)制備飲用水消毒工藝出水的提取物的溶液；
[0008] 2)用步驟1)的提取物溶液暴露處理離體的永生化人胚胎腎細(xì)胞；
[0009] 3)步驟2)處理后的細(xì)胞依次進(jìn)行EMA染色和SYTOX Green染料染色；
[0010] 4)流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)被SYTOX Green染料染色但不被EMA染色的顆粒的大小 和形態(tài)特征，判別微核、細(xì)胞核和亞二倍體顆粒，并記錄數(shù)目，得到微核率和亞二倍體貢獻(xiàn) 率，進(jìn)而得出飲用水消毒工藝出水遺傳毒性。
[0011] 具體的，所述微核率和亞二倍體貢獻(xiàn)率的計(jì)算公式如下：
[0012] 微核率（％ )=微核數(shù)目/細(xì)胞核數(shù)目X100%
[0013] 亞二倍體貢獻(xiàn)率（％ )=亞二倍體顆粒數(shù)目/微核數(shù)目X 100%
[0014] 上述方法中，步驟1)中，所述提取物的制備方法為：采集飲用水消毒工藝出水的 水樣，水樣用玻璃纖維濾膜過(guò)濾，再用HLB柱進(jìn)行固相萃取，以二氯甲烷為淋洗劑進(jìn)行洗 脫，收集洗脫液，濃縮干燥，即得。
[0015] 提取物的制備方法中，所述HLB柱是經(jīng)正己烷、二氯甲烷、甲醇、超純水活化的HLB 柱。
[0016] 所述提取物溶液中的溶劑為二甲基亞砜（DMS0)。
[0017] 上述方法中，在所述步驟1)之后，所述步驟2)之前，包括如下步驟：利用MTT細(xì)胞 毒性試驗(yàn)確定最高暴露濃度；其中，所述最高暴露濃度是指保證細(xì)胞存活率> 50%時(shí)細(xì)胞 暴露處理液中提取物的濃度。在MTT實(shí)驗(yàn)中，用細(xì)胞暴露處理液來(lái)處理離體的永生化人胚 胎腎細(xì)胞，細(xì)胞暴露處理液由提取物溶液和適合于培養(yǎng)永生化人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基 組成。
[0018] 上述方法中，所述步驟2)中暴露處理的方法如下：向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的所述永生化人 胚胎腎細(xì)胞中加入細(xì)胞暴露處理液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;其中，所述細(xì)胞暴露處理 液為適合于培養(yǎng)永生化人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基和所述提取物溶液的混合液；
[0019] 步驟2)中，所述細(xì)胞暴露處理液中提取物的濃度小于或等于所述利用MTT細(xì)胞毒 性試驗(yàn)確定的最高暴露濃度。
[0020] 上述方法中，所述細(xì)胞暴露處理液具體是將所述提取物溶液與所述適合于培養(yǎng)永 生化人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基按照5 : 995的體積比混合得到的；所述提取物溶液是將 按照上述提取物的制備方法從l〇〇mL飲用水消毒工藝出水中提取的提取物溶于1 μ LDMS0 中。
[0021] 上述方法中，所述適合于培養(yǎng)永生化人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基為細(xì)胞完全培養(yǎng) 基。
[0022] 再具體的，所述細(xì)胞完全培養(yǎng)基由MEM-EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈 霉素溶液組成；其中，MEM-EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液的體積比為 90 : 10 : 1;青霉素-鏈霉素溶液中青霉素的含量為10000U/ml,鏈霉素的含量為10mg/ mL〇
[0023] 上述方法中，所述提取物溶液中的溶劑為DMS0。
[0024] 上述過(guò)程中，所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1 X 105個(gè)/mL，500 μ L/孔接種 于細(xì)胞培養(yǎng)板中置于在37°C、體積百分比為5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中，貼壁生長(zhǎng)12h后的細(xì)胞。
[0025] 具體的，所述方法中，所述步驟3)中EMA染色的方法包括如下步驟：
[0026] 向步驟2)處理后的細(xì)胞中加入EMA染色液，浸于碎冰下2cm固定，可見光源離液 面1〇-15(^照射3〇1^11 ;光激活結(jié)束后，加入41：預(yù)冷的含體積百分比為2.5(%胎牛血清的 PBS，吸棄后，PBS洗滌，鋁箔紙避光。
[0027] 具體的，所述方法中，所述步驟3)中所述SYTOX Green染料染色的方法如下：
[0028] 向EMA染色洗滌后的細(xì)胞加入低滲熒光探針染液，渦旋，37°C避光染色lh ;再加入 高滲熒光探針染液，渦旋，室溫避光放置30min。
[0029] 具體的，所述EMA染色液由EMA和含體積百分比為2. 5%的胎牛血清的PBS緩沖液 組成，EMA在EMA染色液中的濃度為0. 5-15 μ g/mL ;所述PBS緩沖液pH值為7. 2-7. 4 ;再具 體的，所述EMA在EMA染液中的濃度1 μ g/mL ;
[0030] 所述低滲熒光探針為FCM溶液I ;再具體的，所述FCM溶液I由溶質(zhì)和溶劑組成，溶 質(zhì)及其在FCM溶液I中的濃度為：l-800mg/L氯化鈉，500-2000mg/L檸檬酸鈉，0. 5-2mg/mL RNAse A，0.1-0. 5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.2-1. 0μ M SYTOX Green染料，溶劑為超純 水；再具體的，所述溶質(zhì)及其在FCM溶液I中的濃度如下：584mg/L氯化鈉，1000mg/L檸檬酸 鈉，0.5mg/mL RNAse A，0.3mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0·4μ M SYTOX Green染料，溶劑為 超純水。
[0031] 所述高滲熒光探針為FCM溶液II ;再具體的，所述FCM溶液II由溶質(zhì)和溶劑組成， 溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為：80-160mg/L蔗糖，15-30mg/L檸檬酸及0. 2-1. 0 μ Μ SYTOX Green染料，溶劑為超純水；再具體的，所述溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為： 85. 6mg/mL蔗糖，15mg/L檸檬酸及0. 4μΜ SYTOX Green染料，溶劑為超純水。
[0032] 具體的，所述方法中，是將細(xì)胞放置在24孔板中進(jìn)行暴露處理的，在所述步驟3) 之后，所述步驟4)之前，包括如下步驟：將所述24孔板離心。
[0033] 具體的，所述永生化的人胚胎腎細(xì)胞為永生化的人胚胎腎細(xì)胞HEK293。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于體外微核檢測(cè)飲用水消毒工藝出水遺傳毒 性的試劑盒，包括以下溶液：
[0035] MTT儲(chǔ)備液：用pH值為7. 2-7. 4的PBS (磷酸鹽緩沖液）配制成濃度為5mg/mL的 MTT溶液；所述PBS緩沖液pH值為7. 2-7. 4 ;
[0036] EMA染液：由含體積百分比為2. 5%的胎牛血清的PBS緩沖液和EMA組成，EMA在 EMA染液中的濃度為0. 5-15 μ g/mL ;所述PBS緩沖液pH值為7. 2-7. 4 ;再具體的，所述EMA 在EMA染液中的濃度1 μ g/mL ;
[0037] FCM溶液I :由溶質(zhì)及溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液I中的濃度如下：l_800mg/L 氣化納，500-2000mg/L朽1樣酸納，0.5_2mg/mL RNAse Α，0· l_0.5mL/L乙基苯基聚乙二醇以 及0.2-1. 0μ M SYTOX Green染料，溶劑為超純水；再具體的，所述溶質(zhì)及其在FCM溶液I中 的濃度如下：584mg/L氯化鈉，1000mg/L朽 1檬酸鈉，0. 5mg/mL RNAse A，0. 3mL/L乙基苯基聚 乙二醇以及〇.4μ M SYTOX Green染料，溶劑為超純水。
[0038] FCM溶液II :由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為：80-160mg/ mL蔗糖，15-30mg/L檸檬酸及0. 2-1.0μΜ SYTOX Green染料，溶劑為超純水；再具體的， 所述溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為：85. 6mg/mL蔗糖，15mg/L檸檬酸及0. 4 μ MSYT0X Green染料，溶劑為超純水。
[0039] 所述乙基苯基聚乙二醇為Nonidet P-40。
[0040] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0041] 1.MTT急性毒性試驗(yàn)在流式細(xì)胞儀微核檢測(cè)前預(yù)篩合適濃度，減少以往因細(xì)胞死 亡造成的假陽(yáng)性結(jié)果。
[0042] 2.采用24孔板微量化體外細(xì)胞培養(yǎng)，減少樣品量，孔板離心排除碎片干擾，流式 細(xì)胞儀檢測(cè)，高通量獲得數(shù)據(jù)。
[0043] 3.經(jīng)流式細(xì)胞儀一系列門的設(shè)定，在獲得細(xì)胞微核率的同時(shí)可獲得細(xì)胞周期信息 及亞二倍體信息，實(shí)現(xiàn)微核誘發(fā)因素的定量化分析，方便進(jìn)一步研究不同消毒工藝的微核 產(chǎn)生機(jī)理。
[0044] 因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)飲用水消毒工藝水樣的遺傳毒性的快速、微量化、高通量分析， 提高了檢測(cè)方法的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果易于統(tǒng)一，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1為體外微核測(cè)試試驗(yàn)流程圖。
[0046] 圖2為前向散射光-側(cè)向散射光（FSC vs SSC)散點(diǎn)圖。
[0047] 圖3為SYTOX Green染細(xì)胞核（FL1-H) -維直方圖。
[0048] 圖4為SYTOX Green染細(xì)胞核寬度-面積（FL1-W vs FL1-A)散點(diǎn)圖。
[0049] 圖 5 為 EMA-SYTOX Green 熒光信號(hào)（FL3-H vs FL1-H)散點(diǎn)圖。
[0050] 圖6為前向散射光-SYTOX Green熒光信號(hào)（FSC vs FL1-H)散點(diǎn)圖。
[0051] 圖7為側(cè)向散射光-SYTOX Green熒光信號(hào)（SSC vs FL1-H)散點(diǎn)圖。
[0052] 圖8為圈門設(shè)定主核、微核及亞二倍體（FSC vs FL1-H)散點(diǎn)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0054] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
[0056] 永生化人胚胎腎細(xì)胞HEK293購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中 心。
[0057] 實(shí)施例1、對(duì)南方某飲用水廠臭氧消毒工藝出水進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)
[0058] 采用體外微核測(cè)試試驗(yàn)對(duì)該飲用水廠臭氧消毒工藝出水進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)，體外 微核測(cè)試試驗(yàn)流程見圖1。
[0059] -、南方某飲用水廠飲用水消毒工藝出水提取物的提取
[0060] 用棕色玻璃瓶原位采集10L水后，立即送回實(shí)驗(yàn)室過(guò)0. 7 μ m玻璃纖維濾膜過(guò)濾， 去除懸浮物，過(guò)經(jīng)5mL正己烷、5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL超純水活化過(guò)的HLB柱進(jìn)行 固相萃取，每根HLB柱富集2L水，過(guò)柱流速控制在10mL/min左右；萃取后吹干吸附柱，以 10mL二氯甲烷為淋洗劑分三次洗脫富集在吸附柱上的物質(zhì)；所有有機(jī)溶劑均為色譜純；洗 脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近2mL后，濃縮物過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱脫水，氮吹后溶劑置換至100 μ LDMS0,將該水樣提取物的DMS0溶液作為儲(chǔ)備液，保存于-20°C冰箱備用，其中，1 μ LDMS0 中含有相當(dāng)于l〇〇ml水樣中提取的提取物。
[0061] 二、細(xì)胞培養(yǎng)
[0062] 取永生化的人胚胎腎細(xì)胞HEK293,在37°C、體積百分比為5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 細(xì)胞每?jī)商靷鞔淮危瑐鞔笠惶鞊Q培養(yǎng)基。
[0063] 在整個(gè)體外微核測(cè)試試驗(yàn)過(guò)程中，均采用細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)永生化的人胚胎腎 細(xì)胞HEK293 ;所述細(xì)胞完全培養(yǎng)基由MEM-EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液組 成，其中，MEM-EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液的體積比為90 : 10 : 1;青霉 素-鏈霉素溶液中青霉素的含量為l〇〇〇〇U/ml,鏈霉素的含量為10mg/mL。
[0064] 三、細(xì)胞暴露處理
[0065] 1、MTT急性細(xì)胞毒性預(yù)篩試驗(yàn)
[0066] 1)細(xì)胞接種
[0067] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的永生化人胚胎腎細(xì)胞HEK293,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為IX 105個(gè)細(xì)胞/ mL，100 μ L/孔接種于96孔板中，在37°C、體積百分比為5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng) 12h。設(shè)陰性對(duì)照組、調(diào)零孔（無(wú)細(xì)胞）和樣品暴露組，每組設(shè)4個(gè)平行試驗(yàn)。
[0068] 2)細(xì)胞暴露
[0069] 12h后將96孔培養(yǎng)板取出，棄去舊細(xì)胞完全培養(yǎng)液，加入下述配制的細(xì)胞暴露處 理液20〇μ L，細(xì)胞在37°C、體積百分比為5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)暴露24h。
[0070] 細(xì)胞暴露處理液的配制：取新鮮配制的完全培養(yǎng)基995 μ L，再加5 μ L樣品，混合 搖勻，為配置好的細(xì)胞暴露處理液，備用，其中5 μ L樣品分別指：
[0071] 陰性對(duì)照組樣品：5 μ L不含飲用水消毒工藝出水提取物的空白溶劑即二甲基亞 砜 DMS0 ;
[0072] 暴露組樣品：將水樣提取物的DMS0儲(chǔ)備液稀釋為4個(gè)不同的濃度，分別為5 μ L提 取物溶液中含有相當(dāng)于50〇1^、25〇1^、1251^、62.511^水樣中提取的提取物；取該4個(gè)不同濃 度的提取物溶液各5 μ L加入995 μ L的完全培養(yǎng)基中混勻；
[0073] 調(diào)零孔樣品：5 μ L DMS0。
[0074] 3) MTT應(yīng)用液處理暴露細(xì)胞
[0075] MTT (噻唑藍(lán)）應(yīng)用液的配制：用pH值為7. 2-7. 4的PBS配制成濃度為5mg/mL的 MTT儲(chǔ)備溶液；使用時(shí)，用pH值為7. 2-7. 4的PBS稀釋成濃度為0. 5mg/mL的MTT應(yīng)用液， 現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0076] 暴露結(jié)束后，棄去暴露液，加入100 μ LMTT應(yīng)用液/孔，將96孔板置于細(xì)胞培 養(yǎng)箱，在37 °C、體積百分比為5 % C02培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)4h后，棄去ΜΤΤ應(yīng)用液，加入 150 μ LDMS0/孔，平板搖床振蕩5min。波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度，暴露樣品、調(diào)零孔、陰性對(duì) 照的吸光度值分別標(biāo)記為A550 (樣品）、A550 (調(diào)零孔）、A550 (陰性對(duì)照）。
[0077] 4) MTT預(yù)篩試驗(yàn)結(jié)果處理
[0078] 細(xì)胞相對(duì)存活率的計(jì)算公式為：
[0079] 細(xì)胞相對(duì)存活率（％)二（A5S0(樣品)_ASS0(調(diào)零孔）X100% 廿m午如5〇(陰性對(duì)照)_Ass〇(調(diào)零孔,）a丄uu/o
[0080] 最后，以保證細(xì)胞存活率> 50%為標(biāo)準(zhǔn)，確定HEK293在該飲用水消毒工藝出水物 提取物中的最1?暴露濃度。
[0081] MTT預(yù)篩試驗(yàn)結(jié)果表明，暴露濃度為500mL水樣/mL細(xì)胞暴露處理液（從提500mL 水樣中取出來(lái)的提取物/mL細(xì)胞暴露處理液，所述lmL細(xì)胞暴露處理液含995 μ L細(xì)胞完全 培養(yǎng)基和5 μ L提取物溶液）時(shí)，細(xì)胞存活率是（89. 8 ± 2. 8) %，細(xì)胞存活率彡50 %，不存在 急性毒性，選取該濃度為后續(xù)流式細(xì)胞儀微核檢測(cè)的濃度，從而減少高急性毒性對(duì)微核測(cè) 試假陽(yáng)性結(jié)果的干擾。
[0082] 2、微核試驗(yàn)的細(xì)胞暴露處理
[0083] 1)細(xì)胞接種
[0084] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的永生化人胚胎腎細(xì)胞ΗΕΚ293,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1Χ105個(gè)/mL， 500 μ L/孔接種于24孔板中置于在37°C、體積百分比為5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中，貼壁生長(zhǎng) 12h后暴露處理。設(shè)對(duì)照組、調(diào)零孔（無(wú)細(xì)胞）和樣品暴露組，每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。
[0085] 2)細(xì)胞暴露
[0086] 12h后將24孔培養(yǎng)板取出，棄去舊細(xì)胞完全培養(yǎng)液，加入下述配制的細(xì)胞暴露處 理液200 μ L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行暴露處理，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% C02， 暴露培養(yǎng)24h。
[0087] 細(xì)胞暴露處理液的配制：
[0088] 陰性對(duì)照組樣品：取新鮮配制的完全培養(yǎng)基995 μ L，再加5 μ L DMS0。
[0089] 實(shí)驗(yàn)組樣品：取新鮮配制的完全培養(yǎng)基995 μ L，再加5 μ L提取物溶液，混合搖勻， 為配置好的細(xì)胞暴露處理液。lml細(xì)胞暴露處理液中提取物的量為從500mL水樣中提取的 提取物。
[0090] 調(diào)零孔樣品：取新鮮配制的完全培養(yǎng)基995 μ L，再加5 μ L DMS0。
[0091] 四、熒光探針染色
[0092] 1、染液制備
[0093] ΕΜΑ染液：由ΕΜΑ和含體積百分比為2.5%的胎牛血清的PBS緩沖液組成，ΕΜΑ在 ΕΜΑ染色液中的濃度為1 μ g/mL ;所述PBS緩沖液pH值為7. 2-7. 4 ;
[0094] FCM溶液I :由溶質(zhì)及溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液I中的濃度如下：584mg/L氯 化鈉，l〇〇〇mg/L 檸檬酸鈉，0.5mg/mL RNAse A，0.3mL/L Nonidet P-40 以及 0·4μΜ SYT0X Green核染料，溶劑為超純水。
[0095] FCM溶液II :由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為：85. 6mg/mL 蔗糖，15mg/L檸檬酸及0. 4 μ MSYTOX Green核染料，溶劑為超純水。
[0096] 2、細(xì)胞固定、熒光探針染色及細(xì)胞裂解
[0097] 將暴露處理后的24孔板取出，棄舊培養(yǎng)基。加入300 μ LEMA染色液/孔，浸于碎 冰下2cm固定，可見光源離液面15cm照射30min ;光激活結(jié)束后，加入200 μ L含2. 5%胎牛 血清的PBS (4°C預(yù)冷），吸棄后，PBS洗滌，鋁箔紙避光；于室溫輕輕加入500 μ L FCM溶液I， 渦旋，37°C避光染色lh ;用力加入500 μ L FCM溶液II，渦旋，室溫避光放置30min后，24孔 板離心（600-1200 Xg，10min)棄上清，沉淀物經(jīng)PBS重懸，過(guò)300目尼龍網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢 測(cè)或4°C冰箱避光保存。
[0098] 五、流式細(xì)胞儀分析
[0099] 1、流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置
[0100] 激發(fā)光源為氬離子激光器，激發(fā)光：488nm
[0101] 發(fā)射光：SYT0X Green 熒光通道為 FL1 (515/30band-pass filter)
[0102] EMA 熒光通道為 FL3 ( > 6501ong-pass filter)
[0103] 2、流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖門的設(shè)置
[0104] 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)后根據(jù)熒光信號(hào)和顆粒大小復(fù)雜程度等設(shè)置一系列門，篩選 出目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞核及產(chǎn)生的微核。
[0105] 流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)收集后，軟件分析時(shí)以前向角（FSC-Η)和側(cè)向角（SSC-H)為橫、縱 坐標(biāo)作散點(diǎn)圖2。FSC-H、SSC-H分別反映細(xì)胞顆粒度大小及顆粒內(nèi)容物的精細(xì)結(jié)構(gòu)等復(fù)雜 程度，通過(guò)將其設(shè)為閾值來(lái)排除樣品中的各種非特異性碎片的干擾。細(xì)胞核顆粒物的FSC-H 與SSC-H成一定比例（Light scatter門設(shè)置），低于該比例則為非目標(biāo)物質(zhì)。
[0106] 以FL1設(shè)閾值，SYTOX Green熒光探針（FL1-H)的熒光強(qiáng)度作一維直方圖3,細(xì)胞 計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以分析細(xì)胞區(qū)域內(nèi)DNA含量的細(xì)胞數(shù)目，峰處分別代表不同時(shí)相的細(xì)胞周 期（G0/G1、S、G2/M期）以觀察細(xì)胞暴露處理所處狀態(tài)，排除碎片干擾（FLIRange門設(shè)置）。
[0107] 以FL1通道熒光信號(hào)中顆粒寬度FL1-W為橫坐標(biāo)及顆粒表面積FL1-A為縱 坐標(biāo)作散點(diǎn)圖4。熒光信號(hào)標(biāo)記的細(xì)胞核中FL1-W與FL1-A成相應(yīng)比例，設(shè)置Double Discrimination門可有效地排除細(xì)胞的雙粘體及其他非核物質(zhì)。
[0108] 以FL3-H通道表征的EMA熒光信號(hào)為橫坐標(biāo)與以FL1-H通道表征的SYTOX Green 熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖5。細(xì)胞處理時(shí)，EMA本身無(wú)熒光，在細(xì)胞裂解前加入，標(biāo)記凋亡 中后期及壞死細(xì)胞的細(xì)胞核，經(jīng)光激活后產(chǎn)生可在FL3通道識(shí)別的熒光信號(hào)。EMA陽(yáng)性顆粒 標(biāo)記凋亡小體及壞死細(xì)胞。設(shè)置EMA negative門可剔除上述非正常細(xì)胞的細(xì)胞核顆粒干 擾。
[0109] 經(jīng) Light scatter 門、FLl-Range 門、Double Discrimination 門及 EMA negative 門一系列交集設(shè)門篩選后確定目標(biāo)顆粒群。以FL1-H通道表征的SYTOX Green熒光顆粒 信號(hào)為橫坐標(biāo)分別與FSC-Η及SSC-H為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖（圖6,圖7)。標(biāo)記DNA的SYT0X Green熒光信號(hào)與FSC-H及SSC-H呈線性比例，設(shè)置FSC vs SYTOX及SSC vs SYTOX門，可 進(jìn)一步除去熒光強(qiáng)度非線性顆粒，保證微核計(jì)數(shù)準(zhǔn)確均一性。
[0110] 經(jīng)上述門的設(shè)定篩選用于微核計(jì)數(shù)。以FL1-H通道的SYTOX Green熒光信號(hào)為橫 坐標(biāo)與以前向散射光信號(hào)（FSC-H)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖8,根據(jù)被SYTOX Green染料染色但不 被EMA染色的目標(biāo)顆粒的大小和形態(tài)特征，判別微核（Micronuclei)、細(xì)胞核（Nuclei)和亞 二倍體顆粒（Hypodiploid)，并記錄數(shù)目，得到微核率和亞二倍體貢獻(xiàn)率，進(jìn)而得出飲用水 消毒工藝出水遺傳毒性。
[0111] 3、檢測(cè)結(jié)果處理
[0112] 飲用水消毒處理工藝樣品的計(jì)算公式：
[0113] 微核率（％ )=微核數(shù)目/細(xì)胞核數(shù)目X100%
[0114] 亞二倍體貢獻(xiàn)率（％ )=亞二倍體顆粒數(shù)目/微核數(shù)目X 100%
[0115] 微核誘發(fā)倍率（％ )=微核率（樣品）/微核率（對(duì)照）
[0116] 4、南方某飲用水廠臭氧消毒工藝出水體外微核測(cè)試結(jié)果見表2。
[0117] 表 2
[0118] I細(xì)胞相對(duì)存活率（％)I微核率（％ ) I微核誘發(fā)倍率~~|亞二倍體貢獻(xiàn)率（％ )~ WM 100.0 + 5.5 1.2 + 0. 1 24. 1 + 1. 3 臭氧消毒工藝出水 89. 8±2. 8 3.2 + 0. 1 Υ? 27. 9 + 2. 5
[0119] 實(shí)施例2、對(duì)北方某飲用水廠氯化消毒工藝出水進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)
[0120] 評(píng)價(jià)方法同實(shí)施例1。相同暴露濃度下，即暴露濃度為500mL水樣/mL細(xì)胞暴露處 理液時(shí)，北方某飲用水廠氯化消毒工藝出水體外微核測(cè)試結(jié)果見表3。
[0121] 表 3
[0122] I細(xì)胞相對(duì)存活率（％ )|微核率（％ ) I微核誘發(fā)倍率~~|亞二倍體貢獻(xiàn)率（％ )~ WM 100.0 + 7.8 1.4 + 0. 1 26.4 + 2. 5 氯化消毒工藝出水 90. 3±2. 4 2.6 + 0.2 T~8 52. 6 + 4. 1
【權(quán)利要求】
1. 一種飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的體外微核檢測(cè)方法，包含以下步驟： 1) 制備飲用水消毒工藝出水的提取物的溶液；； 2) 用步驟1)的提取物溶液暴露處理離體的永生化人胚胎腎細(xì)胞； 3) 步驟2)處理后的細(xì)胞依次進(jìn)行EMA染色和SYTOX Green染料染色； 4) 流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)被SYTOX Green染料染色但不被EMA染色的顆粒的大小和形 態(tài)特征，判別微核、細(xì)胞核和亞二倍體顆粒，并記錄數(shù)目，得到微核率和亞二倍體貢獻(xiàn)率，進(jìn) 而得出飲用水消毒工藝出水遺傳毒性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述方法中，在所述步驟1) 之后，所述步驟2)之前，包括如下步驟：利用MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定最高暴露濃度；其中， 所述最高暴露濃度是指保證細(xì)胞存活率> 50%時(shí)細(xì)胞暴露處理液中提取物的濃度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述暴露處理的方法 如下：向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的所述永生化人胚胎腎細(xì)胞中加入細(xì)胞暴露處理液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24h;其中，所述細(xì)胞暴露處理液為適合于培養(yǎng)永生化人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基 和所述提取物溶液的混合液；所述細(xì)胞暴露處理液中提取物的濃度小于或等于所述利用 MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定的最高暴露濃度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述EMA染色的方 法包括如下步驟： 向步驟2)處理后的細(xì)胞中加入EMA染色液，浸于碎冰下2cm固定，可見光源離液面 10-15cm照射30min ;光激活結(jié)束后，加入含體積百分比為2. 5%胎牛血清的PBS，4°C預(yù)冷， 吸棄后，PBS洗滌，鋁箔紙避光。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述SYTOX Green染 料染色的方法如下： 向EMA染色后的細(xì)胞加入低滲熒光探針染液，渦旋，37°C避光染色lh ;再加入高滲熒光 探針染液，渦旋，室溫避光放置30min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述EMA染色液由 EMA和含體積百分比為2. 5%胎牛血清的PBS緩沖液組成，EMA在EMA染色液中的濃度為 0.5-15 μ g/mL ； 所述低滲熒光探針為FCM溶液I ;再具體的，所述FCM溶液I由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及 其在FCM溶液I中的濃度為：l-800mg/L氯化鈉，500-2000mg/L檸檬酸鈉，0. 5-2mg/mL RNAse A，0. 1-0. 5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0. 2-1. 0 μ M SYTOX Green染料，溶劑為超純水； 所述高滲熒光探針為FCM溶液II ;再具體的，所述FCM溶液II由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì) 及其在FCM溶液II中的濃度為：80-160mg/mL蔗糖，15-30mg/L檸檬酸及0. 2-1.0μΜ SYTOX Green染料，溶劑為超純水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述方法中，是將細(xì) 胞放置在24孔板中進(jìn)行暴露處理的，在所述步驟3)之后，所述步驟4)之前，包括如下步 驟：將所述24孔板離心。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的體外微核測(cè)試方法，其特征在于：所述永生化的人胚 胎腎細(xì)胞為永生化的人胚胎腎細(xì)胞HEK293。
9. 一種用于體外微核檢測(cè)飲用水消毒工藝出水遺傳毒性的試劑盒，包括以下溶液： MTT儲(chǔ)備液：用pH值為7. 2-7. 4的PBS配制成濃度為5mg/mL的MTT溶液； EMA染液：由含體積百分比為2. 5%胎牛血清的PBS緩沖液和EMA組成，EMA在EMA染 液中的濃度為〇. 5-15 μ g/mL ; FCM溶液I :由溶質(zhì)及溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液I中的濃度如下：l-800mg/L氯 化納，500-2000mg/L朽1樣酸納，0.5_2mg/mL RNAse A，0. l_0.5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及 0. 2-1. 0 μ M SYTOX Green 染料，溶劑為水； FCM溶液II :由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在FCM溶液II中的濃度為：80-160mg/mL蔗 糖，15-30mg/L檸檬酸及0. 2-1. 0 μ M SYTOX Green染料，溶劑為超純水。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104140997SQ201310163456
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】王子健, 劉楠楠, 馬梅, 饒凱鋒, 李娜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心