專利名稱：人類重度子癇前期發(fā)生相關的血清微小核糖核酸標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學領域，涉及人類重度子癇前期發(fā)生相關的血清微小核糖核酸(microRNA, miRNA)標志物及其應用。
背景技術：
我國妊娠期高血壓疾病發(fā)病率約為9.4%，國外報道為7% 12%，是孕產婦及圍生兒死亡的重要原因。妊娠期高血壓疾病包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及慢性高血壓。子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的涉及多系統(tǒng)的疾病，發(fā)病率為1% 5%，以妊娠20周后發(fā)生高血壓、蛋白尿、水腫等為主要臨床特點。子癇前期根據(jù)病情輕重分為輕度和重度兩類。輕度子癇前期是指妊娠20周后出現(xiàn)血壓彡140/90mmHg,尿蛋白(+ )或尿蛋白彡300mg/24h,可伴有上腹部不適、頭痛等癥狀。子癇前期患者出現(xiàn)下述任一不良情況可診斷為重度子癇前期:①血壓持續(xù)升高:收縮壓彡16OmmHg和(或)舒張壓彡IlOmmHg ;②蛋白尿彡2.0g/24小時或隨機蛋白尿彡(++) !③血清肌酐彡1.2mg/dL除非已知之前就已升高血小板〈100，000/ML (<100X 109/L) ； 微血管病性溶血一LDH升高；⑥血清轉氨酶水平升高一ALT或AS ;，⑦持續(xù)頭痛或其他大腦或視覺障礙；⑧持續(xù)上腹部疼痛。病情嚴重者可以導致子癇，甚至合并全身多臟器損害如肝腎功能損害、腦出血、心力衰竭、彌漫性血管內凝血等，嚴重威脅母兒的安全。子癇前期的好發(fā)因素包括初產婦、孕婦年齡小于18歲或大于40歲、多胎妊娠、合并慢性高血壓、慢性腎炎、抗磷脂綜合征、糖尿病等內科疾病、營養(yǎng)不良以及子癇前期家族史等。子癇前期發(fā)病愈早、母兒受損時間越長、并發(fā)癥越多、預后也越差。因此圍生醫(yī)學根據(jù)本病發(fā)病早晚又分為早發(fā)型子癇前期和遲發(fā)型子癇前期。近來研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型與遲發(fā)型子癇前期在遺傳背景、發(fā)病與復發(fā)風險、病理生理指標改變、臨床特點、遠期心血管病風險有一定差別。早發(fā)型子癇前期主要表現(xiàn)為胎盤功能紊亂與血管內皮功能障礙；而遲發(fā)型子癇前期常表現(xiàn)為母體的異常反應。如何確定早發(fā)型與遲發(fā)型的分界？根據(jù)美國和加拿大等國家標準，一般把妊娠34周前發(fā)生的子癇前期定為早發(fā)型子癇前期；^ 34周發(fā)病的子癇前期稱為遲發(fā)型子癇前期。但近年來又有研究表明妊娠32周前發(fā)病的子癇前期引起的孕產婦死亡率是足月后發(fā)生子癇前期的20倍，所以國內外有些學者也把妊娠32周作為早發(fā)型與遲發(fā)型子癇前期的分界。子癇前期發(fā)病機制尚未完全闡明，目前大多認為是胎盤相關性疾病，胎盤的娩出后病情緩解或治愈。具有遺傳易感性，可能涉及血壓調節(jié)、血栓形成、血管內皮細胞功能、血管重鑄、代謝免疫等等相關的基因。在多基因背景下、生活行為、環(huán)境等因素相互作用，可能影響母胎免疫耐受、母胎界面滋養(yǎng)細胞功能障礙、侵襲力下降使胎盤淺著床、或螺旋動脈重鑄不足，胎盤缺血缺氧、局部細胞免疫反應增強、胎盤局部出現(xiàn)氧化應激釋放氧自由基導致血管內皮激活和損傷，血管內皮合成或分泌血管收縮因子舒張因子平衡失調，導致小動脈痙攣、胎盤及全身臟器血液灌流量下降。此外血管內皮損傷又可使凝血因子增加，抗纖溶活性增強，纖溶活性下降致血液高凝狀態(tài)或微血栓形成，甚至發(fā)生慢性血管內凝血(DIC)，引起多臟器損害。胎盤功能減退、胎盤缺血缺氧可以導致胎兒生長受限、胎兒宮內窘迫、醫(yī)源性早產、胎死宮內甚至新生兒死亡。子癇前期治療以監(jiān)測母胎狀態(tài)、對癥治療(如解痙、鎮(zhèn)靜、降壓、促胎兒生長等)、必要時終止妊娠以減少母兒并發(fā)癥為主要處理措施，至今終止妊娠仍是唯一的治愈方法。子癇前期臨床診斷時間為妊娠20周后，但本病在發(fā)病前一段時期機體就可能發(fā)生一系列病理生理改變，并且對母兒產生不同程度損害，甚至是無法挽回的不良結局。因此我們需要在亞臨床或更早、甚至孕前就采取相關的干預措施來避免或減少本病的發(fā)生、減慢病程，減輕母兒的不良結局。為此我們迫切需要尋找本病特異標志物與治療靶點，從而盡早啟動預防與干預措施，對減少本病的發(fā)生、改善母兒預后具有極其重要的意義。微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點，它是一類長約19-23個核苷酸的單鏈RNA分子，多位于基因組非編碼區(qū)，進化上高度保守，可在轉錄后水平對基因表達進行調節(jié)，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發(fā)育、組織分化、細胞凋亡以及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自參與調控線蟲時序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA已逐漸成為調控mRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯的研究熱點，分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破?，F(xiàn)在預測miRNA至少能調控數(shù)千個人類基因，占所有基因的30%以上。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。目前，miRNA與腫瘤的關系已成為研究的重點，已發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過負調控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結腸癌高度相關。然而，血清miRNA與重度子癇前期等的相互關系尚未見報道。最新的研究成果發(fā)現(xiàn)血清中存在上百種的miRNA，性質穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、結腸癌中已經證實血清miRNA的表達譜可作為早期診斷的潛在生物標志物。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮，血清miRNA作為一類非編碼調節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標志物，開拓了生物標志物的新境界。該研究迅速引起國際媒體的廣泛關注，路透社、合眾社、《科學的美國人》、美國《技術評論》等都對該研究成果進行了 專門報道，《Nature》雜志也在其網站首頁的一最新研究進展||專欄中展示了這一最新研究進展。然而血清中miRNA在重度子癇前期早期診斷監(jiān)測中的應用還未得到相應的關注，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與重度子癇前期發(fā)病相關的特異血清miRNA作為生物標志物，并研發(fā)相應疾病的診斷、監(jiān)測試劑盒，不僅在該領域處于國際領先地位，可創(chuàng)造令人矚目的經濟效益，對我國妊娠高血壓的防治也將是一次強有力的推動。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供與人類重度子癇前期發(fā)生相關的血清microRNA標志物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述血清microRNA標志物的引物。本發(fā)明還有一個目的是提供上述血清microRNA標志物或其引物的應用。本發(fā)明再有一個目的是提供含有上述血清microRNA標志物或其引物的用于人類重度子癇前期診斷或監(jiān)測的試劑盒。本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的:與人類重度子癇前期相關的血清microRNA標志物，選自hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多種。所述的血清microRNA 標志物由 hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和hsa-miR-10a構成。所述的血清microRNA標志物，其中hsa-miR-193a_5p的序列為ugggucuuugcgggcgagaugaCSEQ ID N0.1), hsa-miR-424 的序列為 cagcagcaauucauguuuugaa(SEQ ID N0.2), hsa-miR-10a 的序列為 uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID N0.3)。所述的血清microRNA標志物的引物，其中序列為SEQ ID N0.1的標志物的上游引物為SEQ ID N0.4，下游引物為SEQ ID N0.5 ;序列為SEQ ID N0.2的標志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.3的標志物的上游引物為SEQID N0.8，下游引物為 SEQ ID N0.9。所述的血清microRNA標志物或其引物在制備重度子癇前期診斷或監(jiān)測試劑中的應用。所述試劑是能夠測定這些血清microRNA標志物在血清中表達量的試劑。一種人類重度子癇前期診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有上述血清microRNA標志物(hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多種)的引物。所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有上述引物(SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9)中的多對。所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有下列3對引物SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。試劑盒中除引物外的其他試劑可采用現(xiàn)有技術中相應檢測技術的常用試劑。本發(fā)明詳細描述如下:本發(fā)明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎信息和臨床資料，并采用了 RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array,Real-time PCRCTaqMan探針和染料法)方法的一種或幾種進行檢測。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:一、研究對象選擇和分組依據(jù)A組:健康對照組(n=100，20人芯片篩選，40人一期驗證，40人獨立人群驗證)，無
其他全身性重大疾病。B組:重度子癇前期組(n=100，20人芯片篩選，40人一期驗證，40人獨立人群驗
證)，無其他全身性重大疾病。二、血液血清分離及前處理(I)新鮮肝素抗凝血5ml于離心機3000rpm離心5min，取上清每100 μ I分裝至潔凈1.5ml EP管中(2)向EP管中加入900 μ I TRIzol，充分混勻后，12000rpm離心15min，立即取上清至一潔凈1.5ml EP管中。(3)向EP管中加入1.5倍上清水相體積的無水乙醇，充分混勻后轉移至離心柱，IOOOOrpm離心15秒,棄下層廢液。(4)在離心柱上加入700 μ I RffT緩沖液，IOOOOrpm離心15秒,棄下層廢液。(5)在離心柱上加入500 μ I RPE緩沖液，IOOOOrpm離心15秒，棄下層液。重復一遍。

(6)將離心柱加入一個新的2ml的管子，IOOOOrpm離心I分鐘，用于去除RPE緩沖液。(7)將離心柱裝在一個新的1.5ml的離心管中，并在柱子上加入50 ii IDEPC處理的水，離心I分鐘。(8)_70°C保存處理后的樣本。本發(fā)明實驗中使用的離心柱和配套試劑(RWT緩沖液、RPE緩沖液)均來自QiagenmiRNeasy Mini Kit (貨號217004)這個試劑盒,下同。三、Real-time PCR方法測量血清miRNAs表達量1.取經前處理的血清，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品。按下表所示配制反轉錄體系:

權利要求
1.人類重度子癇前期相關的血衆(zhòng)microRNA標志物，選自hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 中的多種。
2.根據(jù)權利要求1所述的血衆(zhòng)microRNA標志物，其特征在于由hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-424 和 hsa-miR-lOa 構成。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的血衆(zhòng)microRNA標志物，其特征在于hsa-miR-193a-5p的序列為 SEQ ID N0.1，hsa-miR-424 的序列為 SEQ ID N0.2，hsa-miR-lOa 的序列為 SEQ IDN0.30
4.權利要求3所述的血漿microRNA標志物的引物，其特征在于序列為SEQID N0.1的標志物的上游引物為SEQ ID N0.4，下游引物為SEQ ID N0.5 ;序列為SEQ ID N0.2的標志物的上游引物為SEQ ID N0.6，下游引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.3的標志物的上游引物為SEQ ID N0.8，下游引物為SEQ ID N0.9。
5.權利要求1或2所述的血漿microRNA標志物在制備人類重度子癇前期診斷或監(jiān)測試劑中的應用。
6.權利要求4所述的引物在制備人類重度子癇前期診斷或監(jiān)測試劑中的應用。
7.一種人類重度子癇前期診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權利要求1或2所述的血漿microRNA標志物的引物。
8.根據(jù)權利要求7所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權利要求4所述引物中的多對。
9.根據(jù)權利要求8所述的診斷或監(jiān)測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有引物SEQIDN0.4 和 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學領域，公開了人類重度子癇前期發(fā)生相關的血清微小核糖核酸標志物及其應用。該標志物選自hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-424和hsa-miR-10a中的多種。該標志物對重度子癇前期患者具有特異性和敏感性，可用于制備重度子癇前期的診斷或監(jiān)測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK103205430SQ20131015781
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權日2013年4月28日
發(fā)明者夏彥愷, 吳煒, 呂述彥, 傅廣波, 陸春城, 王心如 申請人:夏彥愷