用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)和探針及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)丁香疫霉的熒光RT-PCR法，其是以樣品總DNA為模板，利用上述引物對(duì)和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。該方法可從被丁香疫霉侵染的發(fā)病植物組織中快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出丁香疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，特異性好，靈敏度高，對(duì)丁香疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測(cè)以及進(jìn)出口安全等方面具有重要意義。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)和探針及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)丁香疫霉的引物 對(duì)和探針及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 丁香疫霉（Phytophthora syringae (Klebahn) Klebahn)是我國(guó)重要的檢疫性病 菌，可以引起觀賞植物、果樹發(fā)生嚴(yán)重、具有毀滅性的病害。該病菌寄主范圍廣泛，主要危害 14個(gè)科中的29個(gè)屬，如：歐洲丁香（Syringa vulgaris)、柑桔屬的朽1檬（Citrus limon)、臍 澄（C. sinensis)、小茴香（Foeniculum vulgare)、蘋果屬的蘋果（Malus pumila)、李屬的甜 搜桃（Prunus avium)、梨屬的西洋梨（Pyrus communis)，火棘屬（Pyracantha ssp.)等，能 引發(fā)根、莖、葉、果實(shí)上的多種病害。目前，在美洲、歐洲、亞洲、非洲的許多國(guó)家都有丁香疫 霉病菌發(fā)生危害的報(bào)道。
[0003] 因此開發(fā)丁香疫霉的早期快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)相關(guān)植物生產(chǎn)中的病害防控和無(wú)公害 化具有重要的意義。
[0004] 近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (熒光RT-PCR)技術(shù)及其相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于 植物病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的分子檢測(cè)與預(yù)警，然而國(guó)內(nèi)外鮮有利用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)丁香 疫霉方面的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)和探針。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)丁香疫霉的熒光RT-PCR法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)，其包括 上游引物PS-F :5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'（SEQIDNo·l)和下游引物PS-R: 5'-AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3'（SEQ ID Νο·2)。
[0008] 本發(fā)明還提供含有上述引物對(duì)PS-F和PS-R的用于檢測(cè)丁香疫霉的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)丁香疫霉的探針，所述探針為： 5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'（SEQ ID No. 3)，其中 F1 為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q1 為非熒光性 的淬滅基團(tuán)。優(yōu)選F1為FAM熒光染料，Q1為MGB。
[0010] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)丁香疫霉的熒光RT-PCR法：以樣品DNA為模板，采用引物 對(duì)PS-F和PS-R以及上述探針進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后 根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0011] 上述熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，25μ L的反應(yīng)體系含有成分如下：樣品 DNA1 μ L (0· 0005-50ng)，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液（不含 Mg2+) 2. 5 μ L，25mM MgCL22. 0 μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ M 引物 PS-F1 μ L，10 μ M 引物 PS-R1 μ L，10 μ M 探針 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 3 μ L，ddH2013. 7 μ L。
[0012] 熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中使用的退火溫度為60°C。優(yōu)選地，反應(yīng)程序?yàn)椋?951：3111丨11;951：1〇8,6〇1：3〇8,40個(gè)循環(huán)。
[0013] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)丁香疫霉的試劑盒，其包括引物對(duì)PS-F和PS-R以及上述 探針。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種 或多種。
[0015] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0016] 本發(fā)明在測(cè)序分析丁香疫霉及其近似種和近緣種的ITS序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì) 用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)和熒光探針。該探針與普通的Taqman探針不同之處在于3'端 采用了非熒光性的淬滅基因，即淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本 底信號(hào)的干擾。
[0017] Taqman MGB探針技術(shù)，即將報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5'端，而3'端采用了非熒 光性的淬滅基因，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅基團(tuán)吸 收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告熒光染料信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中，探針同 模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴(kuò)增 延伸階段將探針切斷，淬滅基團(tuán)的抑制作用消失，報(bào)告熒光染料信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)丁香 疫霉的檢測(cè)。
[0018] 本發(fā)明根據(jù)丁香疫霉ITS序列，設(shè)計(jì)出可快速檢測(cè)丁香疫霉病菌的特異性引物對(duì) 和探針，并在此基礎(chǔ)上建立了熒光RT-PCR檢測(cè)法，可從發(fā)病植物組織中快速、準(zhǔn)確地檢測(cè) 出丁香疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，特異性好，靈敏度高，對(duì)丁香疫霉疫 情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測(cè)以及進(jìn)出口安全等方面具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)丁香疫霉的結(jié)果示意圖，其 中，1 :丁香疫霉（Phytophthora syringae，來(lái)源于美國(guó)）；2 :丁香疫霉（P. syringae，來(lái)源 于英國(guó)）；3_4 :冬生疫霉（P. hibernalis) ;5_7 :雪松疫霉（P. lateralis) ;8_9 :櫟樹粹死 病菌（P.ramorum) :苜猜疫霉根腐病菌（P.medicaginis) ;12-13 :馬鈴薯緋腐疫霉 (P. erythroseptica);14_16 :栗黑水疫霉（P. cambivora);17_18 :草莓疫霉（P. fragariae); 19-20 :樹霉疫霉（Ρ· fragariae var. rubi) ;21 :大豆疫霉（Ρ· sojae) ;22 :棕櫚疫霉 (P. palmivora) ;23 :辣椒疫霉（P. capsici) ;24 :康沃爾疫霉（P. kernoviae) ;25 :空白對(duì)照。
[0020] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例5中熒光RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，其 中，1 _8 的 DNA 濃度分別為 50ng/y L、5ng/y L、0. 5ng/y L、0. 05ng/y L、0. 005ng/y L、 0· 0005ng/y L、0. 00005ng/y L 和 0· 000005ng/y L，9 為空白對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或 Draper 等（Blackwell 科學(xué)出版 社，1988)，鄭小波(疫霉菌及其研究技術(shù)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997)中所述的操作技術(shù)規(guī)程， 或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。
[0023] 實(shí)施例1引物對(duì)及探針的設(shè)計(jì)與合成
[0024] 根據(jù)丁香疫霉ITS序列，采用探針設(shè)計(jì)軟件Express3. 0設(shè)計(jì)引物對(duì)及探針，引物 對(duì)序列為：
[0025] PS-F (正向引物）：5, -GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3，
[0026] PS-R (反向引物）：5, -AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3，
[0027] 探針的序列為：5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3' ；其中，F(xiàn)1 為 FAM 熒光染料，Q1 為 非熒光性的淬滅基團(tuán)MGB。
[0028] 上述引物對(duì)及探針序列合成由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。實(shí)施例2樣品總 DNA的提取
[0029] 采集適量丁香疫霉（Phytophthora syringae)真菌菌絲體或染病果實(shí)、葉片，用賽 默飛世爾植物直接提取試劑盒（Thermo Phire Direct PCR Kit)提取DNA。
[0030] 實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量PCR (熒光RT-PCR)法的建立
[0031] 1、熒光RT-PCR反應(yīng)體系
[0032] 以總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（總體積25μ L)為：樣品 DNA1 μ L (0· 0005-50ng)，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液（不含 Mg2+) 2. 5 μ L，25mM MgCL22. 0 μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ M 引物 PS-F1 μ L，10 μ M 引物 PS-R1 μ L，10 μ M 探針 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 3 μ L，ddH2013. 7 μ L。
[0033] 2、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件
[0034] 將樣品管放入BIO-RAD公司IQ?5熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)：第1個(gè) 循環(huán)為95°C 3min;然后是95°C 10s，6(TC 30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng) 結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0035] 實(shí)施例4 丁香疫霉熒光RT-PCR檢測(cè)法的特異性分析
[0036] 以丁香疫霉的總DNA為模板，以丁香疫霉的近似種及近緣種的總DNA為對(duì)照，通過(guò) 熒光RT-PCR檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。
[0037] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0038] 以丁香疫霉（Phytophthora syringae)的總DNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)突光 PCR檢測(cè)可觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而丁香疫霉的近似種及近緣種，如冬生疫霉 (P. hibernalis)、雪松疫霉（P. lateralis)、櫟樹粹死病菌（P. ramorum)、苜猜疫霉根腐病 菌（P. medicaginis)、馬鈴薯緋腐疫霉（P. erythroseptica)、栗黑水疫霉（P. cambivora)、 草莓疫霉（Ρ· fragariae)、樹霉疫霉（Ρ· fragariae var. rubi)、大豆疫霉（Ρ· sojae)、棕櫚 疫霉（P. palmivora)、辣椒疫霉（P. capsici)、康沃爾疫霉（P. kernoviae)的突光強(qiáng)度沒(méi)有 變化，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
[0039] 實(shí)施例5 丁香疫霉熒光RT-PCR檢測(cè)法的靈敏度分析
[0040] 用超純水分別稀釋丁香疫霉的DNA，進(jìn)行相對(duì)靈敏度檢測(cè)，在25μ L反應(yīng)體系中， DNA 分別為 50ng/y L、5. Ong/μ L、0. 5ng/y L、0. 05ng/y L、0. 005ng/y L、0. 0005ng/y L、 0· 00005ng/μ L和0· 000005ng/μ L。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，最低檢測(cè)限為0· 0005ng/μ L。
[0041] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0001] 序列表 <--〇>中B檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 <120〉用于檢測(cè)Γ香疫霉的引物對(duì)和探針及其檢涵方法 <130> KHP12115911.1 <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213〉人丁序列 <400> 1 gtctggcttc ggctggat 18 <210> 2 <211〉 21 <212> DNA <213〉人丄序列 <400> 2 agtgggctac tagctccagg c 21 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213〉人工序列 <400 3 tggcgaccgc tctga 15
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)丁香疫霉的引物對(duì)，其特征在于， 上游引物 PS-F :5' -GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'， 下游引物 PS-R :5' -AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3'。
2. 用于檢測(cè)丁香疫霉的探針，其特征在于，所述探針為： 5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'，其中F1為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q1為非熒光性的淬滅基團(tuán)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，F(xiàn)1為FAM，Q1為MGB。
4. 檢測(cè)丁香疫霉的熒光RT-PCR法，其特征在于，以樣品DNA為模板，采用權(quán)利要求1 所述的引物對(duì)以及權(quán)利要求2或3所述的探針進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù) 據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，25yL的反應(yīng)體系含有成分如下： 0· 0005-50ng/ μ L 樣品 DNA1 μ L，10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，25mM MgCL22. Ο μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ Μ 引物 PS-F1 μ L，10 μ Μ 引物 PS-R1 μ L，10 μ Μ 探針 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 3 μ L，ddH2013. 7 μ L ;其中，所述PCR反應(yīng)緩沖液中不含Mg2+。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min;95°C 10s， 60 °C 30s，40 個(gè)循環(huán)。
7. 用于檢測(cè)丁香疫霉的試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的引物對(duì)以及權(quán)利要求2或3 所述的探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
10. 含有權(quán)利要求1所述引物對(duì)的用于檢測(cè)丁香疫霉的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104099404SQ201310119058
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月8日
【發(fā)明者】杜洪忠, 吳品珊 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院