專利名稱：一種大豆抗倒伏主效基因位點及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于大豆分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一種大豆抗倒伏主效基因位點及與該主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，同時還涉及該分子標(biāo)記在大豆抗倒伏育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是一種重要農(nóng)作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及世界糧食作物構(gòu)成和國際油料作物生產(chǎn)中均占有重要地位。植株倒伏是大豆生產(chǎn)中一個普遍存在的嚴(yán)重問題，已成為實現(xiàn)大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的主要限制因素之一，特別是生育后期遭受風(fēng)雨影響，極易造成倒伏。倒伏破壞作物群體結(jié)構(gòu)，打亂葉片在空間的正常分布秩序，降低光合效率；倒伏植株易受污染并加劇病蟲危害，增加農(nóng)藥使用量；生長后期倒伏不僅會增加收獲難度，不適應(yīng)機(jī)械化收獲，極大 地影響收獲產(chǎn)量，而且會引起籽粒皺縮，降低含油量等，使大豆外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)都受到嚴(yán)重影響。一般大豆倒伏可引起減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重倒伏造成的大豆減產(chǎn)率在45% - 80%之間。有些高產(chǎn)品種由于不抗倒伏，遇到風(fēng)雨災(zāi)害易造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失，因而很難推廣應(yīng)用。為了防治大豆倒伏，生產(chǎn)上采用一些防控栽培措施，包括使用植物生長調(diào)節(jié)齊U，如三碘苯甲或多效唑等，雖然有較好的防倒效果，但增加了生產(chǎn)成本，并對生態(tài)環(huán)境會造成一定的影響，不利于生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。通過矮桿育種可以提高作物的抗倒能力，但矮桿品種的生物產(chǎn)量明顯低于高桿品種，矮桿品種只有通過提高經(jīng)濟(jì)系數(shù)來提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，而經(jīng)濟(jì)系數(shù)的提高有一定的限度，如果只靠降低株高來增加抗倒能力，勢必會降低生物產(chǎn)量，進(jìn)而影響經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的提高。隨植株矮化，出現(xiàn)葉層密集、群體內(nèi)通風(fēng)透光不暢、植株早衰、病蟲害加重、桿粒皺瘡等一系列不良反應(yīng)。目如水稻超聞廣育種發(fā)展趨勢是:適當(dāng)提聞株聞，以增加生物學(xué)產(chǎn)量而提高谷物產(chǎn)量。有關(guān)大豆的研究也表明，大豆株高與倒伏程度呈極顯著正相關(guān)，株高也與單株產(chǎn)量及有關(guān)產(chǎn)量構(gòu)成因子呈極顯著正相關(guān)，表明株高既影響植株倒伏也影響籽粒產(chǎn)量，使得高產(chǎn)與倒伏矛盾突出。因此，提高大豆的抗倒性，是實現(xiàn)大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑。作物的許多重要農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等都是數(shù)量性狀，由多個基因控制，表現(xiàn)為連續(xù)變異，且易受環(huán)境影響，相對于由單基因控制的質(zhì)量性狀而言，選擇效果不好。通過構(gòu)建遺傳圖譜，定位數(shù)量性狀位點(quantitative trait loci, QTL),利用與QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記在早代對育種材料進(jìn)行選擇，可克服環(huán)境影響，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高選擇效率，加快育進(jìn)程。對大豆抗倒伏的QTL定位研究也有一些報道，但檢測出的QTL效應(yīng)值較小，且重復(fù)性不好，較難在大豆育種中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定大豆、中豆29和中豆32的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測所得到的PCR產(chǎn)物，按照下述方法確定所述待鑒定大豆的抗倒伏性狀:如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示為與中豆29的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同的一個條帶，所述待鑒定大豆為抗倒伏大豆或為候選抗倒伏大豆，如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示為與中豆32的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同的一個條帶，所述待鑒定大豆為非抗倒伏大豆或為候選非抗倒伏大豆；所述待鑒定大豆選自中豆29X中豆32的雜種后代中的F7及其以后世代的家系。其中，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度(凝膠溶液中單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺的總質(zhì)量濃度)可為60g/L，所述聚丙烯酰胺凝膠的交聯(lián)度(凝膠溶液中甲叉雙丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù))可為5%。上述方法中，所述PCR擴(kuò)增中先進(jìn)行10個第一個循環(huán)后再進(jìn)行25個第二個循環(huán)，所述第一個循環(huán)的引物退火條件為60°C 30s，所述第二個循環(huán)的引物退火條件為55°C 30s。其中，所述第一個循環(huán)的溫度程序是:先94°C 30s，然后60°C 30s，最后72°C Imin ；所述第二個循環(huán)的溫度程序是:先94°C 30s，然后55°C 30s，最后72°C lmin。上述方法中，所述待鑒定大豆具體選自中豆29 X中豆32的雜種后代中的F7至F11豕系。在本發(fā)明的個實施例中，所述待鑒定大 具體選自中 29X中 32的雜種后代中的F11的家系。上述方法中，所述抗倒伏大豆是指 倒伏率< 25%的大豆品種或品系，如倒伏率低于21%的大 品種或品系；所述非抗倒伏大 是指倒伏率> 25%的大 品種或品系。上述方法中，在中豆29Χ中豆32這個雜交組合中，中豆29為母本，中豆32為父本。上述方法可用于大豆育種、大豆抗倒伏性狀的早期預(yù)測和篩選抗倒伏大豆。在大豆育種中，可選擇上述方法鑒定出的抗倒伏大豆或候選抗倒伏大豆進(jìn)行育種。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的引物對。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的引物對，名稱為GmSSR13_27，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。其中，SEQ ID N0.1由22個脫氧核苷酸組成，SEQ ID N0.2由24個脫氧核苷酸組成。含有上述引物對GmSSR13_27的鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述引物對GmSSR13-27、含有上述引物對GmSSR13-27的試劑或試劑盒的下述a)、
b)或c)用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:a)在大豆育種中的應(yīng)用；b)在大豆抗倒伏的早期預(yù)測中的應(yīng)用；c)在篩選抗倒伏大豆中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供一種大豆抗倒伏主效基因位點。本發(fā)明所提供的大豆抗倒伏主效基因位點是qLD.13_1，該主效基因位點的貢獻(xiàn)率(37.6%)超過已往的報導(dǎo)，對大豆抗倒伏起著關(guān)鍵作用，可用作圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明的引物對GmSSR13_27，是與主效基因位點qLD.13-1緊密連鎖的標(biāo)記，與主效基因位點qLD.13-1相距0.8cM，且是基于PCR技術(shù)的共顯性SSR標(biāo)記，因而可靠且使用方便。實驗證明，利用引物對GmSSR13_27對大豆育種群體進(jìn)行輔助選擇得到了倒伏率低于21%的抗倒伏家系，這表明引物對GmSSR13-27用于大豆抗倒伏育種的分子標(biāo)記輔助選擇是切實有效的。本發(fā)明通過對大豆抗倒伏的QTL定位，首次精細(xì)定位了抗倒伏主效基因位點q LD.13 -1并獲得了與其緊密連鎖的分子標(biāo)記Gm S S R13 - 2 7，該大豆抗倒伏主效基因位點qLD.13-1，可解釋37.6%的表型變異，可用于圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。在常規(guī)育種方法中，抗倒伏性狀要等到成熟期才能鑒定，且易受環(huán)境，尤其是風(fēng)雨的影響，鑒定田間誤差大，選擇效率低下。通過檢測抗倒伏主效基因位點來預(yù)測大豆抗倒伏性狀，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，從而加快育種進(jìn)程。本發(fā)明中抗倒伏主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過檢測與抗倒伏主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，即可預(yù)測抗倒性，進(jìn)而準(zhǔn)確快速篩選高抗倒伏的材料。本發(fā)明通過分子標(biāo)記GmSSR13-27輔助選擇得到的家系倒伏率均低于21%，利用本發(fā)明的GmSSR13-27進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可提高大豆抗倒伏育種的選擇效率，加快育種進(jìn)程。


圖1為利用GmSSR13-27對1_36的家系的F11代、母本和父本的基因組DNA進(jìn)行PCR得到的PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中1-36為材料編號，Pl和P2分別代表母本中豆29和父本中豆32。圖2為大豆抗倒伏性狀LOD值分布曲線。圖中橫坐標(biāo)代表連鎖群，縱坐標(biāo)代表LOD值。箭頭所示為抗倒伏主效基因位點(qLD.13-1)曲線。圖3為大豆13號染色體對應(yīng)的F連鎖群。左側(cè)為抗倒伏主效基因位點(qLD.13-1)位置及置信區(qū)間示意圖，右側(cè)為標(biāo)記名稱及遺傳距離(CM)。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。大豆中豆29和中豆32 (周新安等，大豆重組自交系群體三、四粒莢變異及其與產(chǎn)量的關(guān)系，中國油料作物學(xué)報，2005，27:22-25)公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所獲得，以重復(fù)本發(fā)明實驗。

在以下的實施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實驗指南》(第三版)(黃培堂等譯，北京:科學(xué)出版社，2002)所提供的方法進(jìn)行。
實施例1、利用引物對GmSSR13-27鑒定中豆29X中豆32的F11家系的抗倒伏性狀一、鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的PCR試劑本實施例的鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的PCR試劑由PCR引物對GmSSR13_27、10XTaq緩沖液，dNTP混合物，MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和ddH20組成。其中，PCR引物對GmSSRl3-27由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:正向引物:5，-TTTGTCGTATTTAGCTTCAGGC-3，(SEQID N0.1),反向引物:5，-TCCACTTCTTATTTCTTATTTGCG-3’(SEQ ID N0.2)。二、待鑒定大豆中豆29 X·中豆32的F11家系是按照如下方法獲得:中豆29和中豆32雜交，雜交后代連續(xù)自交，在F3即分株行種植，以后各世代均從每一個株行中隨機(jī)選擇一個單株，衍生出下一世代。自F7世代同一個家系內(nèi)隨機(jī)選擇5個單株，種子混合，不同家系分別種植，獲得由406個F11株系組成的重組自交系群體。其中，從F2至F11的雜交方式均為自交。三、田間實驗和利用引物對GmSSR13_27鑒定待鑒定大豆的抗倒伏性狀(一)隨機(jī)區(qū)組實驗測定倒伏率從步驟二的406個家系中隨機(jī)選36個F11家系，即編號為1_36的大豆材料種植以測定每個家系的倒伏率。試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)三個重復(fù)區(qū)。每個重復(fù)區(qū)設(shè)38個小區(qū)，36個家系中每個家系I個小區(qū)，母本中豆29 (Pl) I個小區(qū)，父本中豆32 (P2) I個小區(qū)，所有試驗材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗農(nóng)場。每個小區(qū)種植3行，行長3.5m，行距為
0.4m，株距為0.1m。大豆成熟時，參照邱麗娟等(邱麗娟等.大豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，中國農(nóng)業(yè)出版社，2006)方法測定抗倒伏率:在大豆成熟時，以試驗小區(qū)全部植株為觀察對象，計算倒伏(主莖與地面傾斜角度小于30° )植株占全小區(qū)植株的比率。倒伏率(25%為抗倒伏大豆，倒伏率> 25%為非抗倒伏大豆。結(jié)果如表2 所示，表明家系 1、2、4、6、7、10、12、14、16、17、18、23、24、27、28、32、34、35這18個家系以及中豆29的倒伏率均低于21%，是抗倒伏大豆；家系3、5、8、9、11、13、15、19、20、21、22、25、26、29、30、31、33、36這18個家系以及中豆32的倒伏率均高于39%，是非抗倒伏大豆。(二)利用引物對GmSSR13_27鑒定大豆的抗倒伏性狀在步驟(一)編號為1-36的家系的F11代、母本中豆29 (Pl)和父本中豆32的3葉期分別采集大豆葉片提取其基因組DNA，利用引物對GmSSR13-27進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行60g/L變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為5%)電泳，檢測電泳條帶大小。其中，編號為1-36的家系每個家系采集5個植株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA，母本采集10個植株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA，父本采集10個植株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA。具體的實驗方法如下:1、用 CTAB 法(Keim P.A rapid protocol for isolating soybean DNA.Soybeangenet newslett, 1988, 15:147-148)提取葉片基因組 DNA
(I)取0.5g新鮮葉片放入1.5ml離心管中，用玻璃棒磨為勻漿，加入700 μ I經(jīng)65°C預(yù)熱30min的CTAB溶液和20 μ I β -巰基乙醇搖勻，放入65°C的水浴鍋中水浴30min。(2)取出離心管，加入700 μ I氯仿-異戊醇(24:1/ν:ν)輕搖幾次，靜置30min后12000rpm,離心 lOmin。(3)吸取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，置于_20°C冰箱30min。12000rpm離心10分鐘讓DNA沉淀，倒掉離心管中乙醇溶液。(4)用75%(V/V)乙醇清洗2_3次，倒乙醇溶液，打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干。(5)加入200 μ I雙蒸水溶解DNA，用紫外分光光度計測定DNA的濃度，于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、分別以步驟I提取的中豆29X中豆32的的F11代家系1-36及親本的基因組DNA為模板，利用引物對GmSSR13-27進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表1:表1.
權(quán)利要求
1.定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定大豆、中豆29和中豆32的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測所得到的PCR產(chǎn)物，按照下述方法確定所述待鑒定大豆的抗倒伏性狀: 如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示為與中豆29的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同的條帶，所述待鑒定大豆為抗倒伏大豆或為候選抗倒伏大豆，如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示為與中豆32的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同的條帶，所述待鑒定大豆為非抗倒伏大豆或為候選非抗倒伏大豆； 所述待鑒定大 選自中 29 X中 32的雜種后代中的F7及其以后世代的豕系。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度為60g/L，所述聚丙烯酰胺凝膠的交聯(lián)度為5%。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增中先進(jìn)行10個第一個循環(huán)后再進(jìn)行25個第二個循環(huán)，所述第一個循環(huán)的引物退火條件為60°C 30s，所述第二個循環(huán)的引物退火條件為55°C 30s。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述第一個循環(huán)的溫度程序是:先940C 30s，然后60°C 30s，最后72°C Imin ;所述第二個循環(huán)的溫度程序是:先94°C 30s，然后55°C 30s，最后 72°C Imin。
5.據(jù)權(quán) 利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述待鑒定大豆選自中豆29X中豆32的雜種后代中的F7至F11家系。
6.利要求1-5中任一所述的方法的用途，所述用途為1)、2)或3): 1)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在大豆育種中的應(yīng)用； 2)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在大豆抗倒伏性狀的早期預(yù)測中的應(yīng)用； 3)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在篩選抗倒伏大豆中的應(yīng)用。
7.定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的引物對，名稱為GmSSR13-27，由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。
8.有權(quán)利要求7所述的引物對的鑒定或輔助鑒定大豆抗倒伏性狀的試劑或試劑盒。
9.利要求7所述的引物對、權(quán)利要求8所述的試劑或試劑盒的用途，所述用途為a)、b)或 c): a)權(quán)利要求7所述的引物對、權(quán)利要求8所述的試劑或試劑盒在大豆育種中的應(yīng)用； b)權(quán)利要求7所述的引物對、權(quán)利要求8所述的試劑或試劑盒在大豆抗倒伏性狀的早期預(yù)測中的應(yīng)用； c)權(quán)利要求7所述的引物對、權(quán)利要求8所述的試劑或試劑盒在篩選抗倒伏大豆中的應(yīng)用。
10.種大豆抗倒伏主效基因位點，其特征在于:所述主效基因位點為qLD.13-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆抗倒伏主效基因位點及應(yīng)用。該大豆抗倒伏主效基因位點及其在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。該抗倒伏主效基因位點為qLD.13-1,貢獻(xiàn)率為37.6%。與抗倒伏主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記為GmSSR13-27。利用緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測育種群體家系是否含有該主效基因位點，可預(yù)測其抗倒伏性，大大提高了大豆抗倒伏育種的選擇效率。
文檔編號C12Q1/68GK103088148SQ201310053958
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月20日
發(fā)明者陳海峰, 沙愛華, 單志慧, 楊中路, 張曉娟, 張嬋娟, 陳李淼, 陳水蓮, 邱德珍, 周蓉, 吳學(xué)軍, 周新安 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所