專利名稱：一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的互花米草遺傳分型方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的互花米草遺傳分型方法。
背景技術：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。據估計，人類基因組中每1000個核苷酸就有一個SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs。組成DNA的堿基雖然有4種,但SNP —般只有兩種堿基組成,所以它是一種二態(tài)的標記，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/_的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單核苷酸多態(tài)性標記可幫助區(qū)分個體間遺傳物質的差異。隨著單核苷酸多態(tài)性標記技術的成熟及其在分子生態(tài)學中的廣泛應用，外來物種入侵機理日益成為國際上研究的重點。大量的研究表明外來入侵種能在如此短的時間內迅速地做出適應性的進化，可能與其自身的遺傳結構密切相關。因而，在外來入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外 來入侵物種遺傳本質的方法?；セ撞?Spartina alternif1ra)是一種原產北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護堤作用顯著而被許多國家引種。1979年，南京大學從美國東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅里達引種了 3種不同生態(tài)型互花米草至福建羅源灣，隨后擴大分布至我國海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區(qū)域，并取得了一定的生態(tài)和經濟效益。但作為外來物種，其強大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對我國沿海灘涂地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)、生物多樣性和水產養(yǎng)殖產生了較大的負面影響，2003年被環(huán)?？偩至腥胛覈谝慌?6種外來入侵物種名單。因此，對其入侵過程和擴張機制的研究已刻不容緩。本發(fā)明以列入中國首批外來入侵物種的互花米草為對象，在整個基因組內批量尋找多態(tài)性位點，全面評估互花米草的多樣性，并揭示其遺傳本質和入侵機制，為進一步研究和控制互花米草等相關物種提供有力的技術支持。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的互花米草遺傳分型方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態(tài)性標記，發(fā)現(xiàn)引入的不同互花米草種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質和入侵機制，進一步研究和控制互花米草提供有力的技術支持。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，步驟如下:I)種群調查及取樣；
2) DNA 提??；3)測序;4)篩選目標基因R59;5)根據目標基因R59設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；6) PCR 擴增；7)測序；

8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點。進一步地，所述目標基因R59是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。進一步地，所述PCR擴增的反應條件為:94°C預變性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,38 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin0進一步地，所述目標基因R59在互花米草種群中有7個單核苷酸多態(tài)性位點，目標基因R59基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中7個單核苷酸多態(tài)性位點分別位于93、347、436、536、555、683、684。進一步地,高通量轉錄組測序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA,構建轉錄組測序文庫,插入片段長度約為500bp,在illuminaHiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。本發(fā)明的有益效果:包括互花米草在內的許多物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數據，在進行傳統(tǒng)的各種傳統(tǒng)分子標記分析時，如RAPD、SSR、AFLP,發(fā)現(xiàn)實驗結果的一致性較差，假陽性率偏高。而且，傳統(tǒng)分子標記一次實驗只能找到少量多態(tài)性位點信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次實驗。本發(fā)明在一次實驗中，即可得到7個單核苷酸多態(tài)性SNP位點，提供豐富的多態(tài)性信息。同時，本發(fā)明的實驗條件簡單，成功率高，可重復性好。在實施過程中，實驗成功率在98%以上，實驗結果可重復性更達到100%。本發(fā)明采用的7個SNP位點，單倍體基因型理論上可以達到2的7次方，即128，能夠提供非常豐富的多態(tài)性信息，使結果更加準確。SNP標記遺傳穩(wěn)定，可用于不同來源的樣本，適宜高通量自動化分析。
具體實施方式
:下面結合具體樣本對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1.種群調查及取樣選擇天津塘沽海河沿岸和山東萊州朱旺海港作為采樣點，選取生長良好、無蟲害的葉片，采下后立刻放入事先準備好的裝有約半袋硅膠的自封袋里，混勻使葉片與硅膠充分混合，以便快速脫水。帶回實驗室后根據實際情況更換已經變色的硅膠，干燥之后待提取DNA用。每一采樣點隨機取樣30株左右，個體間的間距不小于50米，以盡可能避免重復采集同一克隆，記錄每一樣本的編號、生境、地理參數(經緯度)、樣品高度，樣品直徑等詳細信肩、O2.DNA 提取
使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，具體步驟稍作調整:(1)稱取0.07-0.1g干葉，用剪刀剪碎；用液氮冷凍研缽、研棒，將材料倒入盛有液氮的研缽中，用力磨成粉末，在研磨過程中注意不要讓材料反復凍融。(2)將研磨好的粉末用勺小心地轉移至預先加入450uL LP Buffer的2.0ml離心管中，混合均勻。(3)65°C金屬浴中溫浴30-60分鐘(溫浴過程中間隔振蕩2_3次)，然后移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5分鐘。(5)于13，OOOrpm離心10分鐘，再將上清液轉移至Shredder spin column中,13, OOOrpm離心I分鐘。(6)將濾液轉移到一個新的1.5ml離心管中。(7)加入·濾液體積1.5倍的P Binding Buffer,輕柔的混合均勻，管中出現(xiàn)絮狀沉淀，13, OOOrpm離心10分鐘。(8)將上清液轉移至Spin column。于7，500rpm離心一分鐘,并棄去接液管中液體。(9)向 Spin column 中加入 500uL 的 G Binding Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，
并棄去接液管中液體。(10)向 Spin column 中加入 600uL 的 Wash Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。(11)重復步驟10，一次。(12)再次將 Spin column 于 12，OOOrpm 離心 I 分鐘，并將 Spin column 轉移至一個新的1.5ml離心管。(13)向Spin column中加入IOOuL至200uL65°C溫浴的去離子水，并于室溫溫浴
2-3分鐘。(14)于12, OOOrpm離心I分鐘，并棄去Spin column。DNA存在于1.5ml離心管液體中，-20°C保存?zhèn)溆谩?.高通量轉錄組測序包括互花米草在內的許多外來入侵物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數據，在進行AFLP分子標記與錨定PCR實驗的過程中，發(fā)現(xiàn)實驗結果的一致性較差，假陽性率偏高。因此，我們選擇使用高通量轉錄組測序技術，高通量轉錄組測序不需要了解物種基因信息，能夠對任意物種進行轉錄組分析，并能測定每個轉錄本的片段序列，精確到單核苷酸的分辨率；能夠同時鑒定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本，以及檢測基因家族中相似基因和可變剪接造成的不同轉錄本的表達。高通量測序的步驟是:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA，合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在illuminaHiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。4.篩選目標基因對得到的轉錄組數據進行行篩選，去除多拷貝及重復基因，找到易于擴增的片段R59。R59基因片段如SEQ ID NO:3所示。
5.根據目標基因設計引物，引物的序列為:正向引物如SEQ ID NO:1 所不:ccactccaat caaccctagt tc反向引物如SEQ ID NO:2 所不:gatcactacc acttctcatg cc6.PCR 擴增設計50ul PCR 擴增體系，具體的組成為:34uldH20,5ul 10 X Buffer (Mg2+) ,4uldNTP Mixture (2.5mM)、0.5ul Trans T-Taq(5U/μ I)2.5ul Template DNA (20_40ng/μ L)2ul正向引物(10yM)、2ul反向引物(10 μ Μ)。PCR 反應條件為:94°C 3min 預變性，94°C 30s,54°C 30s,72°C 1.5min38 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin。7.測序PCR擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測，確定為目的條帶且無雜帶干擾。使用上海捷倍思基因技術有限公司的PCR clea-up Kit直接清潔PCR產物，PCR產物濃度達到測序要求后，R59片段使用引物R59反向測序。8.序列拼接、比對和分析所得的序列用Sequencher軟件進行拼接并根據峰圖進行手工校正，然后利用Mega軟件進行比對排列，經比對，兩端切齊后長度752bp，GC含量為48.4%。R59片段測序質量很高，峰型清晰，無雜峰。可以通過測序峰形清晰鑒定單核苷酸多態(tài)性位點。9.對天津塘沽海河沿岸 和山東萊州朱旺海港的互花米草種群進行鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點。表I天津塘沽海河沿岸和山東萊州朱旺海港的互花米草種群單核苷酸多態(tài)性位點
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鑒定結果發(fā)現(xiàn)，天津塘沽海河沿岸和山東萊州朱旺海港的互花米草種群內具有較高的多態(tài)性。752bp的片段上，共存在7個隔離位點(見表I)。天津塘沽海河沿岸的互花米草種群群體的8個個體中，3個個體含有2個單核苷酸多態(tài)性位點，3個個體含有I個單核苷酸多態(tài)性位點。山東萊州朱旺海港的互花米草種群群體的8個個體中，3個個體含有3個單核苷酸多態(tài)性位點，I個個體含有I個單核苷酸多態(tài)性位點。對天津塘沽海河沿岸和山東萊州朱旺海港的互花米草兩個群體之間進行比較發(fā)現(xiàn)，兩個地區(qū)的互花米草種群之間遺傳分化較小。種群間Fst為0.01057, (Fst=0.05，群體相似，高的基因流動；Fst=0.25完全不`同的亞群體，低的基因流動)。
權利要求
1.一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的互花米草遺傳分型方法，其特征在于， 步驟如下: 1)種群調查及取樣； 2)DNA提??； 3)測序； 4)篩選種群的目標基因R59; 5)根據目標基因R59設計引物，正向引物如序列表中SEQID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示； 6)PCR擴增； 7)測序； 8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點。
2.根據權利要求1所述的鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特征在于，所述目標基因R59是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。
3.根據權利要求1所述的鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應條件為:941:預變性31^11，941: 30s、54°C 30s,72°C 1.5min，38個循環(huán)，72°C延伸IOmin。
4.根據權利要求1所 述的鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特征在于，所述目標基因R59在互花米草種群中有7個單核苷酸多態(tài)性位點，目標基因R59基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中7個單核苷酸多態(tài)性位點分別位于93、347、436、536、555、683、684。
5.根據權利要求2所述的鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特征在于，高通量轉錄組測序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在illumina HiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于單核苷酸多態(tài)性標記的互花米草遺傳分型方法，本方法根據高通量轉錄組測序篩選得到目標基因，通過PCR反應、PCR產物測序得到多個單核苷酸多態(tài)性位點。再由所有有效的單核苷酸多態(tài)性位點組成單倍體型用于分子標記以達到遺傳分型。本發(fā)明操作簡便、通量靈活、單核苷酸多態(tài)性標記遺傳穩(wěn)定可靠，可在生物學、遺傳學研究中推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK103114144SQ20131004813
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權日2013年2月5日
發(fā)明者王強, 許穎, 陳建群, 丁靜, 吳娟子 申請人:南京大學