專利名稱：一株柴油降解酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株柴油降解酵母菌株一解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica) KML,及其在降解柴油中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石油是目前環(huán)境中廣泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、潤滑油、石蠟和浙青等，是多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳烴)和少量其他有機(jī)物。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對(duì)能源的需求不斷擴(kuò)大，石油已成為人類最主要的能源之一。隨著石油產(chǎn)量和需求的不斷提高，冶煉、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)泄漏所造成的水體、土壤和大氣等環(huán)境污染相應(yīng)突出。石油進(jìn)入土壤后與土粒粘連，土壤結(jié)構(gòu)被破壞，降低土壤的透氣性和滲水性。目前，國內(nèi)外石油污染土壤修復(fù)技術(shù)按其性質(zhì)可分為3種:物理方法、化學(xué)方法和生物方法。石油污染的生物修復(fù)，是指利用處理系統(tǒng)中生物(主要是微生物)的代謝活動(dòng)來減少污染現(xiàn)場(chǎng)污染物的濃度或使其無害化的過程，其最終產(chǎn)物是C02、H2O等物質(zhì)。與物理、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，具有多種優(yōu)點(diǎn):成本低；對(duì)人和環(huán)境造成的影響小；污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受許多因素的影響，如溫度，PH值，營養(yǎng)物，氧，培養(yǎng)基組成，污染物的濃度和生物利用度等。關(guān)于石油類降解微生物已有一些報(bào)道，但符合實(shí)際應(yīng)用要求的菌株還有待不斷的開發(fā)和研究。為研究適合非洲本土環(huán)境的石油類降解微生物，本發(fā)明從來自喀麥隆未受柴油污染土壤中，篩選分離出高效柴油降解酵母，分析了影響其降解能力的幾種因素，為進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株高效柴油降解酵母一解脂耶羅維亞酵母(Yairowialipolytica) KML 及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一株柴油降解酵母菌株-解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)KML,保藏
于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2013年I月10日，保藏編號(hào)為 CCTCC No:M2013011o該菌株從喀麥隆未被柴油污染的土壤樣品中分離獲得，經(jīng)形態(tài)和生理生化特征鑒定及5.8S rDNA-1TS序列分析，該酵母菌株屬于解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)。GC-MS分析可知,該菌種對(duì)柴油有很好的降解能力。本發(fā)明還涉及所述的解脂耶羅維亞酵母KML在降解柴油中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述降解在20 37°C、pH6.(Tl0.0條件下進(jìn)行。更為優(yōu)選的，所述降解在30°C、pH9.0條件下進(jìn)行。具體的，所述降解可在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行，添加適量營養(yǎng)物和表面活性劑可以促進(jìn)生物降解，優(yōu)選在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加lg/L酵母膏和10g/L鼠李糖脂。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一株可高效降解柴油的酵母菌，為柴油的生物降解提供了基礎(chǔ)。


圖1為基于5.8S rDNA-1TS構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖2為初始pH (A)和培養(yǎng)溫度(B)對(duì)柴油降解率的影響；圖3為氮源(A)和鼠李糖脂(B)對(duì)降解率的影響；圖4為柴油組分及其降解產(chǎn)物氣相色譜-質(zhì)譜圖；A、對(duì)照；B、培養(yǎng)5天；C、培養(yǎng) 9 天。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:柴油降解菌株的篩選與鑒定材料與方法:1.菌株的來源降解柴油的菌株從來自喀麥隆的土壤中分離得到。2.培養(yǎng)基的配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS M)=NH4Cl lg，K2HPO4Ig, Na2S042g，MgSO4.7H201g，CaCl2.6H200.0lg,蒸懼水1L, pH=6.0。121°C高壓蒸汽滅菌20min。無機(jī)鹽含柴油固體培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基，瓊脂15 20g,柴油lmL。查氏固體培養(yǎng)基(Czapek agar medium):K2HPO4Ig;KCL0.5g,蔗糖 30g, FeSO40.0lg;MgSO40.5g, NaN032g,蒸餾水 1L，ρΗ6.8，瓊月旨15 20g, 121°C高壓蒸汽滅菌20min。3.儀器UV-1000紫外分光光度計(jì)；雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床；AgilentTechnologies6890-5975氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用儀等。4.柴油降解菌株的篩選吸取ImL 土壤懸液涂布于查氏固體培養(yǎng)基,30°C倒置培養(yǎng)72h。在培養(yǎng)后,將菌株在40%甘油-20°C保存為進(jìn)一步利用。將甘油保藏菌重新轉(zhuǎn)接到以柴油為唯一碳源的無機(jī)培養(yǎng)基中，30°C，180rpm搖床培養(yǎng)5d，待培養(yǎng)基變混濁后，用無機(jī)鹽含柴油固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將純化菌株于試管斜面培養(yǎng)后4°C保藏。5.柴油降解菌株的鑒定:對(duì)分離得到的柴油降解菌株應(yīng)用5.8S rDNA-1TS序列分析進(jìn)行酵母的分子鑒定，結(jié)合傳統(tǒng)的鑒定方法，根據(jù)微生物的形態(tài)特征和生理生化特征，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》及相關(guān)文獻(xiàn)，最終將菌株鑒定到屬。酵母總DNA提取，用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母的DNA。用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，體系總體積為50 μ I。采用通用引物(ITS1:5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增供試菌株的ITS1-5.8S rDNA-1TS片段，送至上海英俊生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并用軟件MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果:
分別采用常規(guī)的土壤稀釋法和平板涂布法從來自喀麥隆地區(qū)的土壤中分離出一高效柴油降解菌株，在含柴油平板和搖瓶中都能很好的生長。將菌接入液體柴油無機(jī)鹽培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)2天后，培養(yǎng)基開始逐漸變成乳白色，浮在液面上的柴油逐漸減少。通過稀釋涂平板，最終得到一株能利用石油烴的酵母菌，命名為KML。將篩選出的進(jìn)行菌體形態(tài)特征，菌落圓形，乳白色，大小為1.7^4.2X2.3 7.7 μ m。菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表I。表1:柴油降解菌株KML的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株柴油降解酵母菌株-解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)KML,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2013年I月10日，保藏編號(hào)為 CCTCC No:M2013011o
2.權(quán)利要求1所述的解脂耶羅維亞酵母KML在降解柴油中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在2(T37°C、pH6.(Tl0.0條件下進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在30°C、pH9.0條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株柴油降解酵母菌株——解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)KML，及其在降解柴油中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2013年1月10日，保藏編號(hào)為CCTCC NoM2013011。GC-MS分析可知，該菌種對(duì)柴油有很好的降解能力。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一株可高效降解柴油的酵母菌，為柴油的生物降解提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103114061SQ20131003171
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者鐘衛(wèi)鴻, 李烜楨, 邱樂泉, 瑪麗, 謝觀蓮 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)