專利名稱：利用高通量組織芯片檢測golph3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測 G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中惡性程度最高、最頑固的腫瘤，大多數(shù)病人的生存期低于2年。其快速浸潤性生長使得大多數(shù)腫瘤在診斷時已無法完全切除。治療方案包括外科手術(shù)、放射治療和輔助性化療。手術(shù)切除是治療過程中非常重要的一個部分，可以達(dá)到明確診斷、縮小腫瘤體積、減少細(xì)胞數(shù)目并提高患者生存期的目的。然而，盡管經(jīng)過目前最有效的治療，GBM患者在明確診斷后的預(yù)后生存期仍只有14個月。為了達(dá)到早期診斷和更好的療效，已經(jīng)付出了許多努力來尋找新的分子標(biāo)記物和靶向療法。在GBM基因和分子異常方面的最新發(fā)現(xiàn)使得治療方向分子靶向藥物和更多合理的靶向分子治療轉(zhuǎn)移。幾個新的基因，如EGFR、RDA51、S0X2和VEGF，被發(fā)現(xiàn)參與了 GBM的腫瘤形成和進(jìn)展過程。新的抗上述靶點的治療藥物(如貝伐單抗)已在臨床試驗中深度研究。最近FDA已批準(zhǔn)了貝伐單抗用于復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的治療。高爾基磷酸化蛋白3 (G0LPH3),也稱為GPP34/GMx33/MIDAS，是一種具有34kDa分子重量的高度保守的蛋白質(zhì)。它被發(fā)現(xiàn)橫穿在從酵母菌到人類的全部真核生物系中。這個蛋白質(zhì)位于反面高爾基網(wǎng)，由人類染色體5pl3的一個基因編碼。G0LPH3參與了蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、受體的循環(huán)和從高爾基體到質(zhì)粒膜的糖基化過程。最新的研究發(fā)現(xiàn)G0LPH3可以促進(jìn)細(xì)胞性狀轉(zhuǎn)化和腫瘤生長。尤其是，G0LPH3在多種實體腫瘤中都高表達(dá)，包括黑色素瘤、結(jié)腸腺癌和非小細(xì)胞肺癌。G0LPH3提高了人類癌細(xì)胞中雷帕霉素(mTOR)信號對哺乳動物的靶向性，并調(diào)節(jié)了分子對mTOR抑制劑的反應(yīng)。mTOR，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是雷帕霉素的靶向，作為蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長的初級調(diào)控者，是受體酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶通路(RTK-P13K)的關(guān)鍵整合分子，而RTK-PI3K通路則是GBM超激活通路中最常見的一條。在一項對76例膠質(zhì)瘤患者的研究中，Li等人發(fā)現(xiàn)在高級別膠質(zhì)瘤中G0LPH3表達(dá)更高。理解G0LPH3是如何失調(diào)的以及異常表達(dá)的G0LPH3對GBM的腫瘤發(fā)生和藥物反應(yīng)有何作用可有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后標(biāo)記物和新的介入治療途徑。組織芯片(TMA)技術(shù)的發(fā)展，得益于生物芯片技術(shù)等的延伸。TMA具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點，目前主要應(yīng)用在腫瘤病理學(xué)、實驗室檢測、藥物研究等。利用組織芯片技術(shù)可以在細(xì)胞水平定位和蛋白水平檢測相應(yīng)靶標(biāo)，從而實現(xiàn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物與組織形態(tài)學(xué)研究以及臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，同時還可以與原位雜交技術(shù)等相結(jié)合，因此TMA被廣泛應(yīng)用在腫瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的關(guān)系，AlphaB-Crystallin與乳癌的關(guān)系，TMPRSS2和ETS轉(zhuǎn)移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常見類型有演化TM、預(yù)后TMA等。演化TMA指將某一腫瘤疾病發(fā)展的各個階段的標(biāo)本(諸如原發(fā)間變和繼發(fā)膠母、原發(fā)膠母和復(fù)發(fā)膠母等)集中在一塊TMA中，能在一張切片上同時看到腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不同進(jìn)展階段的變化情況，可用以檢測特定腫瘤在不同發(fā)展階段的分子病理改變，有助于對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移等過程的研究。預(yù)后TMA是將帶有可利用的臨床隨訪數(shù)據(jù)的腫瘤標(biāo)本集中在一張TMA中。使用預(yù)后TMA可以研究已知的分子靶標(biāo)的改變或信號傳導(dǎo)通路的變化對腫瘤患者預(yù)后的影響[2]。TMA陣列中每個組織片段都對應(yīng)于相應(yīng)患者，因此利用TMA，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和隨訪資料，可以對腫瘤患者進(jìn)行大規(guī)模的回顧性數(shù)據(jù)分析，為疾病的早期診斷、早期治療等提供指導(dǎo)。文獻(xiàn)報道利用預(yù)后TMA發(fā)現(xiàn)Cyclooxygenase-2對鼻咽癌患者放療預(yù)后有預(yù)測價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，該方法使得檢測G0LPH3的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；檢測G0LPH3的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價值。本發(fā)明的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括:(I)首先構(gòu)建人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色；(2)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列兩條候選序列對G0LPH3進(jìn)行siRNA的敲減:5， -CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5， -GCCAACACCAATGAGGTT-3，；(4)使用Trizol試劑進(jìn)行總細(xì)胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增；(5)檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并分析數(shù)據(jù)。步驟(3)中設(shè)計了一個shRNA序列，同時包含siRNA序列的正鏈和反鏈，采用一個環(huán)形序列來分離互補(bǔ)域。步驟(4)中所述的工具箱為ReverTra Ace qPCR RT工具箱。步驟(4)中所述的擴(kuò)增為在ABI PRISM7900HT序列監(jiān)測系統(tǒng)中進(jìn)行。步驟(4)中所述的擴(kuò)增條件為先在95°下進(jìn)行3分鐘，隨后95°下10秒、55°下45秒重復(fù)循環(huán)40次。在本發(fā)明中，我們使用免疫組化方案和組織芯片分析檢測了 97例原發(fā)GBM患者腫瘤中G0LPH3的表達(dá)量，并研究了 G0LPH3表達(dá)量對腫瘤預(yù)后的預(yù)測價值。G0LPH3對腫瘤生長的潛在作用則通過體外分離群進(jìn)行siRNA實驗來檢測。最近的研究顯示G0LPH3在多種類型的腫瘤中有致癌基因的作用。另外，還發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤中G0LPH3基因的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理級別密切相關(guān)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中G0LPH3的表達(dá)水平最高。本發(fā)明最近利用基因芯片在8個高級別膠質(zhì)瘤，12個低級別膠質(zhì)瘤及一個正常腦組織樣本中做了一些初步試驗，結(jié)果顯示高級別膠質(zhì)瘤中更高水平的G0LPH3表達(dá)。這項結(jié)果的發(fā)現(xiàn)提示我們推測可以用G0LPH3作為GBM預(yù)后標(biāo)志物的可能。目前的研究中41.2%的病人G0LPH3表達(dá)水平較高，58.8%的病人表達(dá)水平相對較低。G0LPH3的表達(dá)與病人總生存期及無進(jìn)展生存期相關(guān)聯(lián)，低水平表達(dá)G0LPH3的病人具有更長的總生存期或無進(jìn)展生存期。Cox回歸分析指出G0LPH3對于總生存期及無進(jìn)展生存期是作為一個獨立的影響因子。目前的相關(guān)結(jié)果提示高水平表達(dá)的G0LPH3是較差預(yù)后的一個預(yù)測標(biāo)
O新的研究證據(jù)顯示蛋白質(zhì)的糖基化在癌癥中起到重要作用，蛋白質(zhì)糖基化的改變是許多癌癥的一個重要特征。G0LPH3是在細(xì)胞內(nèi)的反面高爾基網(wǎng)和內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)之間運(yùn)動，參與了許多細(xì)胞重要的生理過程，如物質(zhì)運(yùn)輸，受體循環(huán)及蛋白糖基化。G0LPH3的過表達(dá)可以改變生長因子受體的內(nèi)化及翻轉(zhuǎn)，可以改變蛋白的糖基化。同樣值得注意的是糖基化也介導(dǎo)了受體分選，配體結(jié)合及細(xì)胞內(nèi)吞。因此，有理由推測G0LPH3過表達(dá)可以調(diào)節(jié)多個細(xì)胞信號通路，尤其是蛋白糖基化通路，最后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。根據(jù)這個理論，我們的研究表明高水平G0LPH3表達(dá)與GBM病人較差的預(yù)后相關(guān)。在體外培養(yǎng)的GBM細(xì)胞實驗顯示RNA干擾技術(shù)下調(diào)G0LPH3的表達(dá)可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長。在人癌細(xì)胞中通過增強(qiáng)mTOR信號可以使G0LPH3產(chǎn)生致瘤作用；G0LPH3的過表達(dá)也提高了兩種通過糖基化的mTOR相關(guān)復(fù)合物的蛋白水平。mTOR即作為一個下游啟動子，也作為RTK-PI3K途徑的上游調(diào)節(jié)子。據(jù)報道88%GBM的RTK-PI3K途徑具有實質(zhì)性改變，突出了其在GBM中的重要性。G0LPH3還與VPS35相互作用，VPS35是一種retromer復(fù)合物，可以管控蛋白質(zhì)的逆向運(yùn)輸，可以改變作用在mTOR信號通路上雷帕霉素的敏感性。G0LPH3的表達(dá)水平及基因的復(fù)制數(shù)量可以作為mTOR信號通路敏感性的指示劑。G0LPH3高水平的表達(dá)相關(guān)于此通路對雷帕霉素的高度敏感。這種G0LPH3與VPS35的相互作用可能還可以管控fct信號通路，Wnt通路在腫瘤的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。幾種mTOR通路的抑制劑如西羅莫司、替西羅莫司和依維莫司等，正在進(jìn)行GBM病人的臨床評估。盡管目前有關(guān)的機(jī)理尚 未闡明，實驗數(shù)據(jù)同樣缺乏，考慮到G0LPH3在蛋白糖基化通路及mTOR通路中的重要作用，我們可以假設(shè)G0LPH3很有可能通過mTOR途徑促進(jìn)GBM的瘤形成，我們有理由推測藥物特異性靶向G0LPH3，尤其是GBM中過表達(dá)的G0LPH3，可以在GBM病人中取得良好效益?？偟膩碚f，我們證明了 G0LPH3高水平表達(dá)與GBM病人不好的預(yù)后相關(guān)。這些實驗發(fā)現(xiàn)同樣提示了 G0LPH3可以作為GBM病人預(yù)后的一個分子標(biāo)志物。且在體外培養(yǎng)的GBM細(xì)胞實驗顯示RNA干擾技術(shù)下調(diào)G0LPH3的表達(dá)可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長。有益.效果(I)本發(fā)明通過小干擾RNA下調(diào)G0LPH3后在體外抑制了膠質(zhì)母細(xì)胞的生長，通過RNAi下調(diào)G0LPH3后導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于Gl期；(2)本發(fā)明通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)G0LPH3的表達(dá)可以抑制腫瘤的增殖及克隆性生長，為抗多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物的研究開拓了新途徑；(3)本發(fā)明使得檢測G0LPH3的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；檢測G0LPH3的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價值。


圖1為OS (a)和PFS (b)的Kaplan-Meier生存曲線。以腫瘤中G0LPH3表達(dá)量分層后的0S(c)和PFS(d)的Kaplan-Meier生存曲線。圖2為將G0LPH3敲減和過表達(dá)后在mRNA和蛋白水平上的效果。U87和U251細(xì)胞分別被建立在慢病毒基礎(chǔ)上的小干擾RNA(shG0LPH3-l和shG0LPH3_2)或空質(zhì)粒(作為陰性對照，PSCN為shG0LPH3的對照，F(xiàn)UGW為G0LPH3過表達(dá)的對照)或過表達(dá)G0LPH3的病毒載體(OE)轉(zhuǎn)染，48小時后用實時RT-PCR檢測G0LPH3在mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平(a為U87，c為U251細(xì)胞)，并用免疫印跡法檢測蛋白量(b為U87，d為U251細(xì)胞)。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示。所有實驗均單獨重復(fù)3次以上。*相對空質(zhì)粒P < 0.05。圖3為G0LPH3敲減后對細(xì)胞增殖和克隆形成的影響。a, b U251細(xì)胞中CCK-8試驗和克隆形成。c，d U87細(xì)胞中CCK-8試驗和克隆形成。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示。所有實驗均單獨重復(fù)3次以上。*相對PSCN P < 0.05 (shG0LPH3的空質(zhì)粒對照)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1( 1)組織樣本這項研究的方案和組織樣本的獲取是經(jīng)過第二軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)的。人體組織的獲取和使用完全遵照中國國家臨床樣本使用規(guī)范。GBM組織樣本來源于之前已收集的病人組織樣本，這些樣本是從2000年I月至2010年12月間在上海長征醫(yī)院神經(jīng)外科住院接受外科手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者身上獲得。術(shù)前已接受化療和放療的患者不納入分析。GBM的診斷由兩位富有經(jīng)驗的病理學(xué)家獨立診斷確認(rèn)。( 2)組織芯片和免疫組化高通量腦膠質(zhì)瘤組織芯片的制備:一、實驗材料(一 )組織標(biāo)本實驗所用的組織標(biāo)本選取上海長征醫(yī)院2002-2010年之間手術(shù)切除、經(jīng)病理證實為腦膠質(zhì)瘤的組織300例，正常腦組織16例(由外傷減壓性手術(shù)中獲得)，上述均經(jīng)過第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會許可和患者及其家屬同意。所有病理診斷及分級均由兩位病理醫(yī)生按照2007年WHO分級標(biāo)準(zhǔn)獨立閱片確定。( 二)主要儀器設(shè)備
權(quán)利要求
1.一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括: (O首先構(gòu)建人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色； (2)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞； (3)在G0LPH3的cDNA序列中采用下列兩條候選序列對G0LPH3進(jìn)行siRNA的敲減:5，-CAGCGCCTCATCAAGAAA-3，和 5，-GCCAACACCAATGAGGTT-3，； (4)使用Trizol試劑進(jìn)行總細(xì)胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增； (5)檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并分析數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(3)中設(shè)計了一個shRNA序列，同時包含siRNA序列的正鏈和反鏈，采用一個環(huán)形序列來分離互補(bǔ)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的工具箱為ReverTra Ace qPCR RT工具箱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的擴(kuò)增為在ABI PRISM7900HT序列監(jiān)測系統(tǒng)中進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測G0LPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的擴(kuò)增條件為先在95°下進(jìn)行3分鐘，隨后95°下10秒、55°下45秒重復(fù) 循 環(huán)40次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用高通量組織芯片檢測GOLPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括(1)首先構(gòu)建人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色；(2)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞；(3)在GOLPH3的cDNA序列中采用兩條候選序列對GOLPH3進(jìn)行siRNA的敲減；(4)使用Trizol試劑進(jìn)行總細(xì)胞RNA的分離，采用工具箱合成第一股cDNA鏈，進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增；(5)檢測GOLPH3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明的方法使得檢測GOLPH3的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；檢測GOLPH3的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價值。
文檔編號C12Q1/68GK103103263SQ20131001330
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者陳菊祥, 周勁旭, 徐濤, 盧亦成, 嚴(yán)勇, 秦榮, 王洪祥 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)