專利名稱：一種dna分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌。
背景技術(shù)：
L-蘇氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等，目前L-蘇氨酸主要以微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)，多種細(xì)菌可用于L-蘇氨酸生產(chǎn)，如谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌等。由于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸具有繁殖迅速、發(fā)酵溫度高、生理生化基礎(chǔ)研究較深入的優(yōu)勢，逐漸成為L-蘇氨酸生產(chǎn)的常用菌株。隨著世界對L-蘇氨酸需求量的不斷增加，L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株的研究越來越受到重視。其中，影響大腸桿菌高產(chǎn)的最關(guān)鍵的一個(gè)因素就是其耐受L-蘇氨酸的能力，只有解除L-蘇氨酸對代謝途徑的抑制，才能進(jìn)而增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。雖然野生型的大腸桿菌具有表達(dá)L-蘇氨酸耐受蛋白的基因，但該基因所表達(dá)的蛋白量較低，僅為大腸桿菌正常生長所需，并不能耐受大于0.1M濃度的L-蘇氨酸，使得野生型的大腸桿菌的產(chǎn)酸能力較低。因此，利用生物技術(shù)手段對野生型大腸桿菌進(jìn)行改造，使其能夠具有較高L-蘇氨酸耐受能力，對L-蘇氨酸的生產(chǎn)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌，使得所述大腸桿菌對L-蘇氨酸具有較高的耐受活性。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8081菌株的一段蛋白質(zhì)序列，長度為206個(gè)氨基酸,其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，NCBI蛋白序號為G1:123440599，該蛋白具體功能尚未得到公開確認(rèn)，而經(jīng)申請人研究其具有耐受L-蘇氨酸的活性，但是表達(dá)該蛋白的基因(Gene bank中的編號為FR718698.l，621bp，DNA序列3775-4395)來源于同大腸桿菌種屬差異較大的耶爾森氏菌屬，其在大腸桿菌中并不能正確表達(dá)該蛋白。故本發(fā)明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性,優(yōu)化密碼子,通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，測序驗(yàn)證該序列的正確性，合成基因酶切位點(diǎn)為Smal/Hindlll，其中優(yōu)化、合成工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒pKR-E，由質(zhì)粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位點(diǎn)間插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子獲得，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223-3中Sma I和HindIII酶切位點(diǎn)間，其質(zhì)粒圖譜見圖1。

本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒PKTR-E，其由以下方法制備:以重組質(zhì)粒pKR-E為模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物擴(kuò)增，BamHI/SphI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得由Tac啟動(dòng)子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的DNA分子、rrnB TlTerminator 終止子、rrnB Terminator終止子組成的片段，然后與經(jīng)過BamHI/SphI雙酶切的質(zhì)粒pKK223_3_ThrA’ BC連接即得；其中，所述Tac啟動(dòng)子、rrnB TlTerminator終止子位于片段兩端,SEQ ID N0:1所不核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動(dòng)子、rrnB Terminator終止子之間，rrnB Terminator終止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator終止子之間。經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明所述片段已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC中BamHI和SphI酶切位點(diǎn)間，其質(zhì)粒圖譜見圖2。質(zhì)粒pKK223_3和pKK223_3_ThrA，BC已在文獻(xiàn)“Kwang Ho Lee,Molecular SystemsBiOlOgy3:149，2007”中公開，并可通過市售獲得，兩者皆為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒，以兩者為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒PKR-E和pKTR-E 有助于本發(fā)明所述DNA分子在大腸桿菌中的表達(dá)。其中，pKR-E帶有基礎(chǔ)質(zhì)粒PKK223-3的Tac強(qiáng)啟動(dòng)子，能增加大腸桿菌中所述DNA分子的拷貝數(shù)和表達(dá)量，并通過基礎(chǔ)質(zhì)粒PKK223-3原有的具有強(qiáng)終止結(jié)構(gòu)的rrnB TlTerminator終止子和rrnB Terminator終止子終止該基因的表達(dá)，以防所述DNA分子中TAG終止密碼子不能終止基因表達(dá)造成的通讀。pKTR-E是以pKR-E為模板,將上述帶有Tac啟動(dòng)子、rrnB TlTerminator終止子和rrnB Terminator終止子的所述DNA分子克隆到質(zhì)粒pKK223_3_ThrA’ BC中BamHI和SphI酶切位點(diǎn)間，同樣具有上述優(yōu)勢。此外，pKTR-E帶有基礎(chǔ)質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC的定點(diǎn)突變蘇氨酸操縱子-ThrA’BC，該操縱子與引入的強(qiáng)Tac啟動(dòng)子可以共同增強(qiáng)所述DNA分子的表達(dá)量，有利于改造后的大腸桿菌的L-蘇氨酸耐受能力的提高。本發(fā)明將重組質(zhì)粒pKR-E按照本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到經(jīng)氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態(tài)細(xì)胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0212-1，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKR-E已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。本發(fā)明將重組質(zhì)粒pKTR-E按照本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到經(jīng)氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態(tài)細(xì)胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0212-2，經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKTR-E已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。所述大腸桿菌W3110購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫，商品貨號為ATCCaNumber:39936 。將保藏編號為CGMCC No:6689和CGMCC No:6690的大腸桿菌(以下簡稱為MHZ-0212-1 和 MHZ-0212-2)與分別轉(zhuǎn)入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的兩株大腸桿菌W3110 (以下簡稱為W3110-pKK和W3110-pKT)進(jìn)行L-蘇氨酸耐受試驗(yàn)，結(jié)果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2兩菌株均可耐受0.8-0.9M的L-蘇氨酸，而W3110_pKK和W3110-pKT兩菌株在0.1-1.0M范圍內(nèi)均不耐受，表明本發(fā)明所述的新型大腸桿菌菌殼耐受較高濃度的L-蘇氨酸。此外，將MHZ-0212-1、MHZ-0212-2、W3110-pKK 和 W3110-pKT 分別在相同環(huán)境下進(jìn)行L-蘇氨酸發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，MHZ-0212-1和MHZ-0212-2兩菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量分別為
0.51g/L、2.06g/L,而W3110-pKK和W3110-pKTL_蘇氨酸產(chǎn)量分別為0、0.9g/L，本發(fā)明所述新型大腸桿菌L-蘇氨酸產(chǎn)量均高于各自的對照菌株，表明其可以應(yīng)用于L-蘇氨酸發(fā)酵中。由以上技術(shù)方案可知,本發(fā)明以一段功能未知的蛋白序列為參照，優(yōu)化并合成一段新DNA序列，并克隆至強(qiáng)表達(dá)載體pKK223-3和pKK223_3_ThrA’ BC中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中得到兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的新型大腸桿菌，能夠應(yīng)用于L-蘇氨酸的發(fā)酵中。生物材料保藏信息說明:1、MHZ-0212-1大腸桿菌，已于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。2、MHZ-0212-2大腸桿菌，已于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。


:圖1示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKR-E質(zhì)粒圖譜；圖2示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKTR-E質(zhì)粒圖譜；圖3示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKR-E和pKTR_E的電泳鑒定圖；其中，最右側(cè)為Marker,從上之下依次為 8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;中間泳道條帶為pKTR-E雙酶切產(chǎn)物的兩條條帶，從上至下依次為5201bp、4824bp ;最左側(cè)泳道條帶為pKR-E雙酶切產(chǎn)物的兩條條帶，從上至下依次為 4296bp、893bp。
具體實(shí)施方式
:本發(fā)明公開了一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的DNA分子、重組質(zhì)粒、大腸桿菌已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。其中，實(shí)施例部分如未說明，則所有分子克隆、轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)方法均參照《分子克隆試驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社出版，第三版)。實(shí)施例1:本發(fā)明所述DNA分子的優(yōu)化和合成本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica8 081的一段蛋白質(zhì)序列，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所不，NCBI蛋白序號為G1:123440599。本發(fā)明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性，優(yōu)化密碼子，通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，測序驗(yàn)證該序列的正確性，合成基因酶切位點(diǎn)為Smal/Hindlll。以Smal/Hindlll為插入位點(diǎn)，將其克隆到高拷貝質(zhì)粒載體PUC57上，以大腸桿菌DH5 a為受體菌株進(jìn)行擴(kuò)增。
其中優(yōu)化、合成工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。實(shí)施例2:構(gòu)建重組質(zhì)粒pKR-E提取上述大腸桿菌DH5 a中pUC57質(zhì)粒，Smal/Hindlll雙酶切，50 體系，Tbuffer+BSA,酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，待合適時(shí)間取下凝膠，切膠回收目的基因片段，取3iU與已制作好的同樣用Smal/Hindlll雙酶切的pKK223_3質(zhì)粒I y I混合，力口入高效連接酶4iU制作8iU的連接體系。16°C過夜連接，次日轉(zhuǎn)化已制作好的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細(xì)胞，終濃度100 U g/ml氨芐青霉素LB平板篩選，培養(yǎng)20h后挑單菌落，提質(zhì)粒用使用HindIII和BamHI雙酶切驗(yàn)證，見圖3。結(jié)果表明，已將所述DNA分子構(gòu)建至PKK223-3，形成新重組質(zhì)粒pKR-E，質(zhì)粒圖譜見圖1。由圖3可知，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌能夠提出質(zhì)粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結(jié)果與所述DNA分子序列一致，說明該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。實(shí)施例3:構(gòu)建重組質(zhì)粒pKTR-E 提取實(shí)施例2中大腸桿菌中的質(zhì)粒pKR-E做模板，以序列表中SEQID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物，擴(kuò)增目的基因片段，該片段帶有pKTR-E上的一段源于基礎(chǔ)質(zhì)粒pKK223_3 的 Tac 啟動(dòng)子序列和 rrnB Tl Terminator>rrnB Terminator 終止子序列。BamHI/SphI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，取3 u I與已制作好的同樣用BamHI/SphI雙酶切的pKK223_3_thrA’BC質(zhì)粒Iyl混合，加入高效連接酶4 ii I制作8iU的連接體系。16°C過夜連接，次日轉(zhuǎn)化已制作好的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細(xì)胞，終濃度100 u g/ml氨芐青霉素LB平板篩選，培養(yǎng)20h后挑單菌落，提質(zhì)粒HindIII酶切驗(yàn)證，見圖3。結(jié)果表明，已將所述片段構(gòu)建至pKK223-3-thrA’ BC，形成新重組質(zhì)粒pKTR-E，質(zhì)粒圖譜見圖2。由圖3可知，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌能夠提出質(zhì)粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結(jié)果與所述DNA分子序列一致，說明該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。實(shí)施例4:轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pKR-E至大腸桿菌W3110氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態(tài)細(xì)胞，從實(shí)施例2中的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細(xì)胞中提取質(zhì)粒PKR-E，轉(zhuǎn)化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 u g/ml濃度平板篩選，得到MHZ-0212-1大腸桿菌。經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKR-E已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6689，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。實(shí)施例5:轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pKTR-E至大腸桿菌W3110氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態(tài)細(xì)胞，從實(shí)施例3中的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細(xì)胞中提取質(zhì)粒PKTR-E，轉(zhuǎn)化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 u g/ml濃度平板篩選，得到MHZ-0212-2大腸桿菌。經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKTR-E已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于2012年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:6690，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。實(shí)施例6:L-蘇氨酸耐受試驗(yàn)參照實(shí)施例4或?qū)嵤├?的方法，將質(zhì)粒pKK223-3和質(zhì)粒pKK223-3_thrA’ BC分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中，得到W3110-pKK和W3110-pKT大腸桿菌。
按照《分子克隆試驗(yàn)指南》配制1.5%瓊脂的M9基本培養(yǎng)基，115°C滅菌20min，分別配制成含 0、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M 的 L-蘇氨酸的培養(yǎng)基，待冷卻到60 °C左右，加入100mg/ml氨芐青霉素使終濃度100 y g/ml，IM的IPTG0.1 u 1/ml，倒平板。菌株培養(yǎng)過夜，稀釋10000倍取100 Ul涂布平板，每12h觀察生長狀況，培養(yǎng)96h菌落生長情況結(jié)果見表I。表I各菌種L-蘇氨酸耐受試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種重組質(zhì)粒pKR-E，其特征在于，由質(zhì)粒pKK223-3在其Sma I和Hindi II酶切位點(diǎn)間插入如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子獲得。
3.—種重組質(zhì)粒pKTR-E，其特征在于，由以下方法制備: 以重組質(zhì)粒PKR-E為模板，用核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的下游引物擴(kuò)增，BamHI/SphI雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得由Tac啟動(dòng)子、SEQ ID NO:1 所不核苷酸序列的 DNA 分子、rrnB TlTerminator 終止子、rrnB Terminator終止子組成的片段，然后與經(jīng)過BamHI/SphI雙酶切的質(zhì)粒pKK223_3_ThrA’ BC連接即得； 其中，所述Tac啟動(dòng)子、rrnB TlTerminator終止子位于片段兩端,SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動(dòng)子、rrnB Terminator終止子之間，rrnB Terminator終止子位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB TlTerminator終止子之間。
4.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No:6689，由重組質(zhì)粒pKR-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110獲得。
5.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No:6690,由重組質(zhì)粒pKTR-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110獲得。
6.保藏編號為CGMCCNo:6689的大腸桿菌在L-蘇氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用。
7.保藏編號為CGMCCNo:6690的大腸桿菌在L-蘇氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由質(zhì)粒pKK223-3在其SmaⅠ和HindIⅡ酶切位點(diǎn)間插入所述DNA分子獲得的重組質(zhì)粒pKR-E和由質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位點(diǎn)間插入由Tac啟動(dòng)子、所述DNA分子、rrnB T1 Terminator和rrnB Terminator終止子組成的片段獲得的重組質(zhì)粒pKTR-E。將本發(fā)明所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入W3110大腸桿菌中獲得兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的菌種，能夠應(yīng)用于L-蘇氨酸的發(fā)酵中。
文檔編號C12N15/70GK103103201SQ20131001162
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者李巖, 宮衛(wèi)波, 王秋巖, 胡炎華, 胡征宇 申請人:新疆梅花氨基酸有限責(zé)任公司