專利名稱：海藻酸裂解酶生物合成基因簇的制作方法
海藻酸裂解酶生物合成基因簇技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于海藻酸裂解酶的生物合成基因簇。
背景技術(shù)：
海藻酸(Alginate)，又稱褐藻膠，是褐藻細胞壁的主要成分之一。某些細菌家族如固氮菌屬(Azotobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等也產(chǎn)海藻酸,作為細菌的莢膜多糖(Gregory L, Larry HK. Characterization of theexocellular polysaccharides from Azotobacter chroococcum[J]. CarbohydrateResearch, 1988, 181 (1):143-152 ； Alferd L, Russell SJ. A polysaccharide resemblingalginic acid from a Pseudomonas microorganism [J]. Nature, 1964, 204 (10) : 187-188)0 海藻酸分子是由 α _L_ 古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)兩種殘基以1，4-鍵連接而成，研究發(fā)現(xiàn)海藻酸分子由3種模塊構(gòu)成，即均聚古洛糖醛酸片段(Poly-gulutonate，PG)、均聚甘露糖醛酸片段 (Poly-mannuronate, PM)和甘露糖醒酸_古洛糖醒酸混合嵌合片段(MG-block) (Gacesa P. Alginates[J]. Carbohydr Polymers, 1988, 8(3):161-182)。
海藻酸裂解酶，又名解藻酸裂解酶，存在于多種生物體中，如海藻、軟體動物、真菌、細菌、噬菌體、病毒等。根據(jù)不同的底物特異性，海藻酸裂解酶可分為特異性降解古洛糖醒酸片段的聚古洛糖醒酸裂解酶poly ( a -L-guluronate) lyase和特異性降解甘露糖醒酸偏酸的聚甘露糖醒酸裂解酶poly ( β -D-mannuronate) lyase (Wong TY, Preston LA, Schiller NL. ALGINATELYASE:Review of Major Sources and Enzyme Characteris tics, Structure-FunctionAnalysis,Biological Roles, and Applications[J]. Annual Review of Microbiology, 2000，54 (I) : 289-340)。海藻酸裂解酶通過β-消除反應(yīng)將海藻酸降解為一系列不飽和的海藻寡糖，分布于多糖裂解酶(polysaccharide lyase, PL)第5,6,7,14,15,17,18 家族中(http://www. cazy. org/Polysaccharide-Lyases. html)。海藻酸裂解酶及其降解海藻酸所產(chǎn)生的海藻寡糖在醫(yī)藥、食品和生物研究領(lǐng)域都具有重要作用。
解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)是一類革蘭氏陰性的海洋細菌，按照伯杰氏細菌手冊記載，是一類不產(chǎn)海藻酸裂解酶的細菌。但Kitamikado等人研究發(fā)現(xiàn) V. alginolyticus ATCC17749 株可產(chǎn)胞外海藻酸裂解酶(Tseng C-H. , Yamaguchi K.,Nishimura M. ,Kitamikado M.Alginate Lyase from Vibrioalginolyticus ATCC17749[J], Nippon Suisan Gakkaishi, 1992, 58(11) :2063-2067)，并且分離純化到一種分子量為47kDa的專一性降解聚甘露糖醛酸片段的海藻酸裂解酶，并且發(fā)現(xiàn)該菌株中存在不止一種海藻酸裂解酶(Kitamikado M, TsengCH, Yamaguchi K, Nakamura T. Two types of alginate lyases [J]. Appl EnvironMicrobiol, 1992 ，58 (8) : 2474-2478),但此后關(guān)于 V. alginolyticus ATCC17749海藻酸裂解酶的研究一直未有報道。發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在對V. alginolyticus ATCC17749的研究過程中，從該菌株中克隆得到五個海藻酸裂解酶編碼基因，生物信息學(xué)分析顯示五個基因在染色體上成簇排列。
因此，本發(fā)明的目的在于提供海藻酸裂解酶生物合成基因簇。
本發(fā)明的海藻酸裂解酶生物合成基因簇包括五個海藻酸裂解酶編碼基因，分別為 algVl、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因族來源于 Vibrio alginoIyticusATCCl7749
根據(jù)本發(fā)明，所述algVl基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 11909-12952個堿基處，長度為1044個堿基對，編碼347個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述algV2基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 6948-8513個堿基處，長度為1566個堿基對，編碼521個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述algV3基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 4747-6498個堿基處，長度為1752個堿基對，編碼583個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述algV4基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 2259-4424個堿基處，長度為2166個堿基對，編碼721個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述algV5基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第1-2256 個堿基處，長度為2256個堿基對，編碼751個氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。
本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解海藻酸裂解酶的生物合成機制，為海藻酸裂解酶的大規(guī)模應(yīng)用提供豐富的物質(zhì)和遺傳信息。


圖1為algVl-algV5基因的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖。其中，M為DNAMarker ；1為 algVl ；2 為 algV2 ；3 為 algV3 ；4 為 algV4 ；5 為 algV5。
圖2為PCR所用引物在海藻酸裂解酶生物合成基因簇上的分布位置圖。
圖3 為 AlgVl-AlgV5 重組蛋白的 SDS-PAGE 檢測圖。其中，M 為 ProteinMarker ；C 為陰性對照；1 為 AlgVl ；2 為 AlgV2 ；3 為 AlgV3 ；4 為 AlgV4 ；5 為 AlgV5。
圖4為AlgVl_AlgV5重組蛋白活性的定性測定結(jié)果圖。其中，a為陰性對照；b為 AlgVl ；c 為 AlgV2 ；d 為 AlgV3 ；e 為 AlgV4 ；f 為 AlgV5。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明中的菌株和質(zhì)粒信息如下
Vibrio alginolyticus ATCC17749購自北京微生物菌株保藏中心,菌種保藏編號1. 1833。pMD18-T載體購自Takara公司。
本發(fā)明中的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件信息如下
V. alginolyticus ATCC17749 的培養(yǎng)基配方如下
液體培養(yǎng)基蛋白胨1%、酵母提取物0. 5%、氯化鈉3%、海藻酸鈉0. 5% ；
固體培養(yǎng)基蛋白胨1%、酵母提取物O. 5%、氯化鈉3%、海藻酸鈉O. 5%、瓊脂1. 8% ；
培養(yǎng)條件為37 °C培養(yǎng)24 36h。
本發(fā)明中的主要試劑信息如下
限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶和Protein Marker均購自TaKaRa公司。 細菌基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。氯化十六烷基吡啶(CPC)和海藻酸鈉購自生工生物工程(上海)有限公司。DNAMarker 的片段大小依次為 O. 5,1. 1、1·6、2·6、3· 1、4· 1、5·4、7· 1、9·3 和 17kb。
本發(fā)明中所涉及的一般操作方法，包括大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒 DNA的抽提、聚丙烯酰胺凝膠電泳等相關(guān)的分子生物學(xué)操作參見文獻(薩姆布魯克J，弗里奇EF.分子克隆手冊(第2版)[M].北京科學(xué)出版社，1998. 1595-1595)。
實施例1、海藻酸裂解酶基因簇的克隆
1.1海藻酸裂解酶基因的克隆
設(shè)計并合成一系列引物用于從V. alginolyticus ATCC17749的基因組上擴增海藻酸裂解酶基因algVl、algV2、algV3、algV4和algV5，引物序列及特征如表I所示。
表1、用于PCR擴增algVl_algV5基因的引物特征
權(quán)利要求
1.海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括五個海藻酸裂解酶編碼基因，分別為algVl、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇來源于Vibrio alginolyticus ATCC17749。
2.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algVl基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第11909-12952個堿基處，長度為1044個堿基對，編碼347個氨基酸。
3.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV2基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第6948-8513個堿基處，長度為1566個堿基對，編碼 521個氨基酸。
4.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV3基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第4747-6498個堿基處，長度為1752個堿基對，編碼 583個氨基酸。
5.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV4基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第2259-4424個堿基處，長度為2166個堿基對，編碼 721個氨基酸。
6.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV5基因位于SEQ ID NO 23所示的核苷酸序列的第1-2256個堿基處，長度為2256個堿基對，編碼 751個氨基酸。
7.如權(quán)利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海藻酸裂解酶生物合成基因簇，所述基因簇包括五個海藻酸裂解酶編碼基因，分別為algV1、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇來源于解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)ATCC17749。本發(fā)明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解海藻酸裂解酶的生物合成機制，為海藻酸裂解酶的大規(guī)模應(yīng)用提供豐富的物質(zhì)和遺傳信息。
文檔編號C12R1/63GK103060353SQ20131000296
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者葉江, 胥晴晴, 張惠展 申請人:華東理工大學(xué)