用于室溫原位檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的原位雜交方法，包括在室溫下進行一個或多個方法步驟(例如，預(yù)處理、變性、雜交、洗滌)。本發(fā)明進一步涉及用于進行這種方法的試劑盒。
【專利說明】用于室溫原位檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法和試劑盒
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2011年12月12日提交的美國臨時申請?zhí)?1/569, 656的權(quán)益。
[0003] 上述申請的全部教導(dǎo)通過引用并入本文中。

【背景技術(shù)】
[0004] 20多年來，熒光原位雜交（FISH)已用作檢測人類染色體上DNA序列的分子技術(shù) (Bauman 1985 ;Pinkel 1986)。在過去的二十年，F(xiàn)ISH技術(shù)各個方面的改進已促進人類細(xì) 胞遺傳學(xué)和分子診斷領(lǐng)域，使得能夠鑒定與實性腫瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)的染色體 異常以及診斷感染性疾病。（Heim 和 Mitelman 1995 ;Klinger 1995 ;Timm，Podniesinski 等· 1995 ;Heselmeyer, Macville 等· 1997 ;Sauer, Wiedswang 等· 2003) ·
[0005] 當(dāng)前的FISH程序是勞動密集型和費時的，要求多個手動處理步驟和遵守精確的 溫度和時間要求。標(biāo)準(zhǔn)FISH技術(shù)通常要求十多個處理玻片樣品的步驟，其中幾個步驟在不 同溫度下進行，需要使用許多通常昂貴的溫度設(shè)備如水浴器、加熱板和孵育箱。這些及其它 技術(shù)上的限制妨礙其在研究和臨床實驗室中更廣泛地使用。
[0006] 目前，需要要求更少處理步驟、更少時間和更少設(shè)備的進行FISH的更簡化且成本 有效的方法。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步 驟：在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下用包含蛋白酶的溶液預(yù)處理包含目標(biāo)核酸的生 物樣品；使所述樣品變性；使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其中所述探針 包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記；和 檢測與所述目標(biāo)核酸雜交后的寡核苷酸探針上的至少一個可檢測標(biāo)記，由此檢測所述樣品 中的目標(biāo)核酸。
[0009] 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步 驟：在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下，使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜 交，其中所述探針存在于包含約Ι-lOmM堿且pH為約10至約13的雜交緩沖液中，并且包含 與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記；和檢測 與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交后的探針上的至少一個可檢測標(biāo)記，由此檢測所述樣品中的 目標(biāo)核酸。
[0010] 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步 驟：使包含目標(biāo)核酸的生物樣品變性；使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其 中所述探針包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可 檢測標(biāo)記；在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下，在pH為約10至約13的洗滌緩沖液中 洗滌所述樣品，所述洗滌緩沖液包含約Ι-lOmM的堿和最終濃度為約0. 03M至約0. 09M的一 種或多種鹽；和檢測已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的探針上的至少一個可檢測標(biāo)記，由 此檢測所述樣品中的目標(biāo)核酸。 toon] 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步 驟：通過將所述樣品與包含堿和約50%至約80%醇的溶液接觸，使包含目標(biāo)核酸的生物 樣品變性；使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其中所述探針存在于包含約 Ι-lOmM的堿且pH為約10至約13的雜交緩沖液中，并且包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸 序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記；在pH為約10至約13的洗滌緩沖液 中洗滌所述樣品，所述洗滌緩沖液包含約Ι-lOmM的堿和最終濃度為約0. 03M至約0. 09M的 一種或多種鹽；和檢測已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的探針上的至少一個可檢測標(biāo)記， 由此檢測所述樣品中的目標(biāo)核酸，其中步驟a)、b)和c)的每一步均在約19攝氏度至約25 攝氏度的溫度下進行。
[0012] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于測定生物樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方 法，包括步驟：
[0013] 使包含目標(biāo)核酸的生物樣品變性；用所述樣品孵育至少一個探針，其中所述探針 包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記；在 洗滌緩沖液中洗滌所述樣品；和通過檢測一個或多個已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的探 針來測定所述樣品中是否存在所述目標(biāo)核酸，其中步驟a)、b)和c)的至少一步在約19攝 氏度至約25攝氏度的溫度下進行。
[0014] 本文描述的所述方法中的任何步驟均可有效地在室溫下進行。因此，在室溫下進 行全部方法步驟避免了對昂貴溫度設(shè)備和遵守精確且可變的溫度要求的需求。與標(biāo)準(zhǔn)的升 溫FISH技術(shù)相比，這種方法要求更少的步驟和更少的時間來完成。
[0015] 附圖簡要說明
[0016] 本專利或申請文件包含至少一個以彩色制作的圖。將按要求通過辦事處提供具有 彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本和支付必要的費用。
[0017] 圖1為描述在使用常規(guī)變性條件（藍(lán)色）或室溫變性條件（灰色）的FISH后，由 標(biāo)記的Y和X染色體寡核苷酸探針?biāo)a(chǎn)生的信噪比（SNR)的對比的圖。
[0018] 圖2為示出使用室溫變性和雜交步驟以及標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件的FISH后， Oligo HSmii X(紅色）和Y染色體（綠色）（箭頭）探針?biāo)a(chǎn)生的信號的來自外周血 液的中期染色體涂片和間期核的圖像。
[0019] 圖3為描述未處理的外周血細(xì)胞上的室溫（Iso Hyb(3. OmM NaOH緩沖液））或 37°C (對照）下雜交后的染色體3 (金色）、染色體6 (淺綠色）、染色體7 (綠色）和染色體 20(紅色）探針的信噪比的圖。
[0020] 圖4為描述膀胱上皮細(xì)胞上的室溫（Iso Hyb (3. OmM NaOH緩沖液））或37°C (對 照）下雜交后的染色體3 (金色）、染色體6 (淺綠色）、染色體7 (綠色）和染色體20 (紅 色）探針的信噪比的圖。
[0021] 圖5為根據(jù)本文實施例5中描述的FISH方案已用由BAC制備的單一序列染色體 13探針在室溫下雜交的外周血液玻片的圖像。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 定義
[0024] 除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0025] 如本文所使用，術(shù)語〃室溫〃和〃RT〃是指約19攝氏度至約25攝氏度的溫度。
[0026] 如本文所使用，〃室溫方法〃或〃室溫程序〃（例如，〃室溫FISH")是指在標(biāo)準(zhǔn)的 現(xiàn)有技術(shù)原位檢測方法中通常在高溫（例如，大于25攝氏度的溫度）下進行的至少一個方 法步驟（例如，變性、雜交、雜交后洗滌）在約19攝氏度至約25攝氏度的范圍內(nèi)進行的方 法。在本文中描述的室溫方法中，優(yōu)選至少兩個、更優(yōu)選至少三個、甚至更優(yōu)選所有這種方 法步驟在約19攝氏度至約25攝氏度的范圍內(nèi)進行。如果"室溫方法"中的兩個或更多個 步驟在室溫下進行，則那些步驟中每一個進行的溫度不需要相同，只要所述溫度在約19攝 氏度至約25攝氏度的范圍內(nèi)。
[0027] 術(shù)語"核苷酸"是指天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體，以及非天然 存在的其衍生物和類似物。因此，核苷酸可包括，例如，包含天然存在的堿基（例如，A、G、C 或T)的核苷酸和包含修飾的堿基（例如，7_去氮雜鳥苷（7-deazaguanosine)或肌苷）的 核苷酸。
[0028] 關(guān)于核酸的術(shù)語〃序列〃是指通過共價鍵（例如磷酸二酯鍵）連接的連續(xù)系列的 核苷酸。
[0029] 術(shù)語"核酸"是指具有多個核苷酸單體的聚合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的，可以 是DNA(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA或雜化聚合物（例如，DNA/RNA)。核酸可以是化學(xué) 或生物化學(xué)修飾的和/或可包含非天然的或衍生的核苷酸堿基。核酸修飾包括，例如，甲基 化，用類似物取代一種或多種天然存在的核苷酸，核苷酸間修飾如不帶電的連接（例如，膦 酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）、帶電的連接（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等）、懸掛部分（例如，多肽）、嵌入劑（例如，吖啶、補骨脂素等）、螯合劑、烷基化劑和 修飾的連接（例如，α異頭核酸等）。核酸還包括在其通過氫鍵鍵合和其它化學(xué)相互作用 結(jié)合至指定序列的能力上模擬核酸的合成分子。通常，核苷酸單體通過磷酸二酯鍵連接，盡 管核酸的合成形式可包含其它連接（例如，肽核酸（本文中也稱為"ΡΝΑ")，如Nielsen等， Science 254,1497-1500,1991中所描述）。核酸還可以包括，例如，構(gòu)象限制的核酸（例如， 〃鎖核酸〃或〃LNA〃，如 Nielsen 等，J. Biomol. Struct. Dyn. 17:175-91，1999 中所描述）、嗎 啉代、乙二醇核酸（GNA)和蘇糖核酸（TNA)。〃核酸〃不限于任何特定長度的聚合物，因此 基本上可以是任何長度，通常約6個核苷酸至約109個核苷酸或更長。在雙鏈聚合物情況 下，"核酸〃可以指任一條或兩條鏈。
[0030] 術(shù)語〃寡核苷酸〃是指通過共價鍵如磷鍵（例如，磷酸二酯、膦酸烷基和芳基酯、 硫代磷酸酯、磷酸三酯）和/或非磷鍵（例如，肽、氨基磺酸酯等）連接的長度通常為約6 至100個核苷酸堿基的短核酸。
[0031] 如本文所使用，術(shù)語〃基因組片段〃是指從基因組DNA制備的片段，包括但不限 于，克隆的基因組片段和擴增的基因組片段（例如，通過PCR擴增制備的基因組片段）。
[0032] 術(shù)語〃目標(biāo)核酸〃是指期望檢測其是否存在于樣品中的核酸。
[0033] 術(shù)語〃目標(biāo)序列〃是指能夠與寡核苷酸探針上的互補序列（例如，基本上互補的 序列）形成氫鍵鍵合的雙鏈體（duplex)的目標(biāo)核酸中的核苷酸序列。
[0034] 如本文所使用，〃互補的〃是指兩個不同的核酸鏈之間或相同核酸鏈的兩個區(qū)域 之間的序列互補性。如果當(dāng)以反平行方式排列兩個區(qū)域時，第一區(qū)域的至少一個核苷酸殘 基能夠與第二區(qū)域的殘基堿基配對（即，氫鍵鍵合），從而形成氫鍵鍵合的雙鏈體，則核酸 的第一區(qū)域與相同或不同的核酸的第二區(qū)域是互補的。
[0035] 術(shù)語〃基本上互補的〃是指能夠在嚴(yán)格的雜交條件下彼此堿基配對以形成穩(wěn)定 的氫鍵鍵合的雙鏈體的兩個核酸鏈（例如，目標(biāo)核酸鏈和互補的單鏈寡核苷酸探針），所述 嚴(yán)格的雜交條件包括本文中描述的室溫雜交條件。通常，"基本上互補的"是指具有至少 70%、例如約 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%互補性的兩個核酸。
[0036] 〃重復(fù)序列〃或〃重復(fù)的序列〃是指人類基因組中非編碼的串聯(lián)重復(fù)的核 苷酸序列，其包括，例如，來自α隨體、隨體1、隨體2、隨體3、β隨體、γ隨體和端粒 的重復(fù)序列。重復(fù)序列是本領(lǐng)域已知的，例如在（Allshire等，Nucleic Acids Res 17(12):4611-27(1989) ;Cho 等，Nucleic Acids Res 19(6):1179-82(1991) ;Fowler 等， Nucleic Acids Res 15(9):3929(1987) ;Haaf 等，Cell 70(4):681-96(1992) ;Lee 等， Chromosoma 109(6):381-9(2000) ;Maeda和Smithies,Annu Rev Genet 20:81-108(1986); Meyne 和 Goodwin, Chromosoma 103 (2):99-103 (1994) ;Miklos(1985) .Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate genomes. Molecular evolutionary genetics. I. J. R. Macintyre. NY, Plenum Publishing Corp. : 241-321 (1985) ;Tagarro 等， Hum Genet 93(2):125-8(1994) ;Waye 和 Willard，PNAS USA 86(16):6250-4(1989);以及 Willard和Waye，J Mol Evol25(3) :207-14(1987)中描述。重復(fù)序列位于例如染色體的 著絲粒區(qū)域、近著絲粒（pericentromeric)區(qū)域、異染色質(zhì)區(qū)域和端粒區(qū)域。一致性重復(fù) 序列在例如 Willard 和 Waye，J Mol Evol 25(3):207-14(1987) ;Tagarro 等，Hum Genet 93(2):125-8(1994) ;Vissel 和 Choo, Nucleic Acids Res. 15(16):6751-6752(1987) ;Cho 等，Nucleic Acids Res 19(6):1179-82(1991)中描述。
[0037] 如本文所使用，術(shù)語〃染色體特異性核酸序列〃或〃染色體特異性核苷酸序列〃 是指對細(xì)胞基因組內(nèi)的特定染色體特異性的核酸序列。
[0038] 術(shù)語〃探針〃是指包括與目標(biāo)核酸中的目標(biāo)序列基本上互補的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域因而 能夠與目標(biāo)核酸形成氫鍵鍵合的雙鏈體的寡核苷酸。通常，所述探針為單鏈探針，具有一個 或多個可檢測標(biāo)記以允許在與其互補目標(biāo)雜交后檢測所述探針。
[0039] 如本文所使用，〃目標(biāo)結(jié)合區(qū)域〃是指能夠與互補目標(biāo)核酸形成氫鍵鍵合的雙鏈 體的寡核苷酸探針的一部分。
[0040] 如本文所使用，術(shù)語"可檢測標(biāo)記"是指表示其結(jié)合的相應(yīng)分子（例如，探針）存 在的部分。
[0041] 〃間接標(biāo)記〃是指使用特異性結(jié)合所述間接標(biāo)記的標(biāo)記的二級試劑或結(jié)合配體的 配偶體檢測的部分或配體。
[0042] 〃直接標(biāo)記〃是指不存在結(jié)合配體的配偶體的相互作用的情況下可檢測的部分。 [0043] 術(shù)語〃生物樣品〃是指生物來源（例如，細(xì)胞、組織、器官、流體）的材料。
[0044] 在兩個分子（無論是單體還是聚合分子）的連接的上下文中的〃接頭〃表示插入 在所連接的兩個分子之間且與它們相鄰的分子（無論是單體還是聚合分子）。"接頭"可 用于連接例如寡核苷酸探針序列和標(biāo)記（例如，可檢測標(biāo)記）。所述接頭可以是核苷酸接頭 (即，在非相鄰的序列之間且與它們相鄰的核酸序列）或非核苷酸接頭。
[0045] 術(shù)語〃雜合體（hybrid) 〃是指通過互補的核苷酸之間的氫鍵鍵合而形成的雙鏈核 酸分子。
[0046] 術(shù)語〃嚴(yán)格性〃是指影響雜合體的穩(wěn)定性的雜交條件，例如溫度、鹽濃度、pH、甲酰 胺濃度等。憑經(jīng)驗優(yōu)化這些條件以使探針與目標(biāo)核酸的特異性結(jié)合最大化，并使探針與目 標(biāo)核酸的非特異性結(jié)合最小化。
[0047] 術(shù)語〃熒光團〃是指具有熒光性的化學(xué)基團。
[0048] 術(shù)語〃任選〃表示可包括或不包括所列舉的步驟（例如，在本發(fā)明的方法的情況 下）或組分（例如，在本發(fā)明的試劑盒的情況下）。
[0049] 本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了簡化且有效的替代性熒光原位雜交（FISH)技術(shù)（在本文 中稱為"室溫FISH")，其中樣品變性、探針雜交、洗滌或它們的任何組合可在室溫下進行。 傳統(tǒng)FISH方法與本發(fā)明的兩種不同的室溫FISH方法之間的對比顯示于表1中。列出了完 成所述方法所需的不同步驟，以及要求的溫度、裝置和與寡核苷酸探針一起使用所需的時 間。本發(fā)明的室溫方法避免了對傳統(tǒng)FISH方法通常要求的昂貴的精確溫度設(shè)備（例如，水 浴器、加熱板、孵育箱、冷凍裝置）的需要。
[0050] 表1.傳統(tǒng)FISH與室溫FISH方法的對比
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步驟： a) 在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下用包含蛋白酶的溶液預(yù)處理包含所述目標(biāo)核 酸的生物樣品； b) 使所述樣品變性； c) 使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其中所述探針包含與所述目標(biāo)核酸 中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記； d) 洗滌所述樣品，以去除未與所述目標(biāo)核酸雜交的探針；和 e) 檢測與所述目標(biāo)核酸雜交后的寡核苷酸探針上的所述至少一個可檢測標(biāo)記，由此檢 測所述樣品中的目標(biāo)核酸。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中a)中的所述溶液包含約0. 1%至約0. 3%的胃蛋白酶。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中a)中的所述溶液具有酸性pH。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中a)中的所述溶液包含0. 01N HC1。
5. 權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中使所述樣品與a)中的所述溶液接觸約5至約 20分鐘。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中使所述樣品與a)中的所述溶液接觸約15分鐘。
7. 權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中步驟b)-d)的一個或多個在約19攝氏度至約 25攝氏度的溫度下進行。
8. 權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其中所述探針為包含約20至約50個核苷酸的單 鏈寡核苷酸探針。
9. 權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其中所述探針由基因組片段制備。
10. 權(quán)利要求1-9所述的方法，其中所述生物樣品包含上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、 分裂球、精細(xì)胞、卵母細(xì)胞或極體，或它們的組合。
11. 一種檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步驟： a) 在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下，使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸 雜交，其中所述探針： 1) 存在于包含約Ι-lOmM堿且pH為約10至約13的雜交緩沖液中，和 2) 包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測 標(biāo)記； b) 洗滌所述樣品，以去除未與所述目標(biāo)核酸雜交的探針；和 c) 檢測與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交后的所述探針上的所述至少一個可檢測標(biāo)記，由 此檢測所述樣品中的目標(biāo)核酸。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述雜交緩沖液的pH為約11至約12。
13. 權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述雜交緩沖液包含約l-5mM堿、約20-60% 甲酰胺和約5-40%硫酸葡聚糖。
14. 權(quán)利要求11、12或13所述的方法，其中所述堿為NaOH。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述雜交緩沖液包含約1.0-3. OmM NaOH、約30-50% 甲酰胺和約10%硫酸葡聚糖。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述雜交緩沖液包含約4. 2mM NaOH、約42%甲酰胺 和約28 %硫酸葡聚糖。
17. 權(quán)利要求11-16任一項所述的方法，其中步驟a)的持續(xù)時間為約5分鐘至約15分 鐘。
18. 權(quán)利要求11-17任一項所述的方法，其中所述探針為包含約20至約50個核苷酸的 單鏈寡核苷酸探針。
19. 權(quán)利要求11-17任一項所述的方法，其中所述探針由基因組片段制備。
20. 權(quán)利要求11-19任一項所述的方法，其中所述生物樣品包含上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、 骨髓細(xì)胞、分裂球、精細(xì)胞、卵母細(xì)胞或極體，或它們的組合。
21. 權(quán)利要求11-20任一項所述的方法，其中步驟b)在約19攝氏度至約25攝氏度的 溫度下進行。
22. -種檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步驟： a) 使包含所述目標(biāo)核酸的生物樣品變性； b) 使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其中所述探針包含與所述目標(biāo)核酸 中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記； c) 在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下，在pH為約10至約13的洗滌緩沖液中洗滌 所述樣品，所述洗漆緩沖液包含約Ι-lOmM的堿；和 d) 檢測已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的探針上的所述至少一個可檢測標(biāo)記，由此檢 測所述樣品中的目標(biāo)核酸。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述洗滌緩沖液的pH為約11。
24. 權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述洗滌緩沖液包含約l-3mM堿和約2 X SSC。
25. 權(quán)利要求22、23或24所述的方法，其中所述堿為NaOH。
26. 權(quán)利要求22-25任一項所述的方法，其中所述洗滌緩沖液包含約1. 75至2mM NaOH 和約2XSSC。
27. 權(quán)利要求22-26任一項所述的方法，其中步驟c)包含一次或多次洗滌，并且每次洗 滌的持續(xù)時間為約2分鐘至約5分鐘。
28. 權(quán)利要求22-27任一項所述的方法，其中所述探針為包含約20至約50個核苷酸的 單鏈寡核苷酸探針。
29. 權(quán)利要求22-27任一項所述的方法，其中所述探針由基因組片段制備。
30. 權(quán)利要求21-29所述的方法，其中所述生物樣品包含上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨髓細(xì) 胞、分裂球、精細(xì)胞、卵母細(xì)胞或極體，或它們的組合。
31. 權(quán)利要求21-30任一項所述的方法，其中步驟a)和b)的一個或多個在約19攝氏 度至約25攝氏度的溫度下進行。
32. -種檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的方法，包括步驟： a) 通過用包含堿和約50 %至約80%的醇的溶液接觸所述樣品，使包含所述目標(biāo)核酸 的生物樣品變性； b) 使至少一個探針與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交，其中所述探針： 1) 存在于包含約Ι-lOmM堿且pH為約10至約13的雜交緩沖液中，和 2) 包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測 標(biāo)記； c) 在pH為約10至約13的洗滌緩沖液中洗滌所述樣品，所述洗滌緩沖液包含約 1-lOmM ;和 d)檢測已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的探針上的所述至少一個可檢測標(biāo)記，由此檢 測所述樣品中的目標(biāo)核酸， 其中，步驟a)、b)和c)中的每一個均在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下進行。
33. -種測定生物樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法，包括步驟： a) 使包含所述目標(biāo)核酸的生物樣品變性； b) 用所述樣品孵育至少一個探針，其中所述探針包含與所述目標(biāo)核酸中的核苷酸序列 基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記； c) 在洗滌緩沖液中洗滌所述樣品；和 d) 通過檢測已與所述樣品中的目標(biāo)核酸雜交的一個或多個探針，測定所述樣品中是否 存在所述目標(biāo)核酸， 其中，步驟a)、b)和c)中至少一個在約19攝氏度至約25攝氏度的溫度下進行。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中步驟a)、b)和c)各自在約19攝氏度至約25攝氏 度的溫度下進行。
35. -種用于檢測生物樣品中的目標(biāo)核酸的試劑盒，其包括： a) 包含約0. 03M至約0. 17M堿和約50%至約80%的醇的變性緩沖液； b) 包含約Ι-lOmM堿且pH為約10至約13的雜交緩沖液；和 c) 包含約Ι-lOmM堿的洗滌緩沖液，其中所述洗滌緩沖液的pH為約10至約13。
36. 權(quán)利要求35所述的試劑盒，進一步包含用于預(yù)處理所述樣品的一種或多種蛋白 酶。
37. 權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中所述一種或多種蛋白酶包括胃蛋白酶。
38. 權(quán)利要求35、36或37所述的試劑盒，進一步包含至少一個包含與所述目標(biāo)核酸中 的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列和至少一個可檢測標(biāo)記的探針。
39. 權(quán)利要求35-38任一項所述的試劑盒，其中所述變性緩沖液包括約0. 07M氫氧化鈉 和約70%乙醇。
40. 權(quán)利要求35-39任一項所述的試劑盒，其中所述雜交緩沖液包含約l-5mM堿、約 20-60%甲酰胺和約5-40%硫酸葡聚糖。
41. 權(quán)利要求35-40任一項所述的試劑盒，其中所述洗滌緩沖液包括約1. 75至2mM NaOH。
42. 權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述洗滌緩沖液進一步包含約2 XSSC。
【文檔編號】C12Q1/68GK104145027SQ201280069016
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】J·奧里馳-科斯塔 申請人:塞雷公司