作為疾病信號的同種型譜的檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測和定量包含多種不同細(xì)胞群的生物學(xué)樣品中的免疫球蛋白同種型的非侵入性技術(shù)。采用測序技術(shù)執(zhí)行該方法，以檢測并例舉異種生物學(xué)樣品中的免疫球蛋白同種型譜。
【專利說明】作為疾病信號的同種型譜的檢測
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)的規(guī)定，要求2011年9月22日提交的美國臨時申請?zhí)?1/537，878的優(yōu)先權(quán)，該申請內(nèi)容通過引用全文納入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及核酸定量分析領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供用于檢測和定量生物學(xué)樣品中存在的免疫球蛋白同種型和產(chǎn)生作為疾病信號的特定同種型譜的非侵入性技術(shù)。
[0004]背景
[0005]免疫系統(tǒng)包括先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。先天免疫系統(tǒng)包括利用一般方法來識別外來病原體的細(xì)胞和機(jī)制。先天免疫中涉及的細(xì)胞包括中性白細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜伊紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突細(xì)胞。這些細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用，并釋放殺滅入侵病原體的多種化學(xué)物質(zhì)。此外，這些細(xì)胞還與先天免疫防御機(jī)制(包括補(bǔ)體級聯(lián)和炎癥)有關(guān)。最后，這些細(xì)胞中的一些參與在獲得性免疫系統(tǒng)中起作用的抗原呈遞過程。
[0006]獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)進(jìn)化以攻擊其靶標(biāo)上的特定特征。針對特定靶標(biāo)發(fā)生過某種應(yīng)答，將為宿主提供關(guān)于其的“記憶”，導(dǎo)致其再次發(fā)生時引起更強(qiáng)的應(yīng)答。通常，任何蛋白質(zhì)或多糖都能成為所述獲得性免疫應(yīng)答細(xì)胞的一些亞組或其產(chǎn)物的靶標(biāo)，所述亞組或其產(chǎn)物識別所述靶標(biāo)上特定表位。將獲得性免疫應(yīng)答分為兩類:體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，B細(xì)胞和T細(xì)胞分別在這些應(yīng)答中起著特定作用。
[0007]由于自體免疫疾病涉及獲得性免疫系統(tǒng)的一些元件對自身靶標(biāo)的識別，已驗(yàn)證獲得性免疫系統(tǒng)的一些方面以協(xié)助診斷和預(yù)后。已采用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)，通過尋找循環(huán)自身抗體來研究體液免疫系統(tǒng)。已鑒定針對若干疾病的自身抗體，例如抗核抗體、抗dsDNA抗體和類風(fēng)濕因子。這些抗體可能本身不是病理性的，并且其在身體中識別的靶標(biāo)也不必然同于體外測試的靶標(biāo)；但是，對其水平的檢測協(xié)助診斷，并且在一些情況下具有一些預(yù)后和治療指示。
[0008]研究自體免疫疾病中的獲得性免疫系統(tǒng)的其它方法基于對獲得性免疫細(xì)胞的多樣性分析。獲得性免疫細(xì)胞的激活導(dǎo)致其克隆擴(kuò)張。該克隆擴(kuò)張的證據(jù)通常通過從血液RNA或DNA擴(kuò)增編碼所述抗原識別區(qū)域的部分核酸序列來獲得。例如，用以擴(kuò)增具有T細(xì)胞受體中β鏈的特定V區(qū)段(類似于抗體重鏈)的序列的PCR引物被用于擴(kuò)增連接至該特定V區(qū)段的J區(qū)段或J和D區(qū)段。當(dāng)存在不同細(xì)胞群時，希望擴(kuò)增具有擴(kuò)增子大小略不同的分布的片段，但克隆擴(kuò)張導(dǎo)致特定大小被富集，并因而導(dǎo)致凝膠上呈現(xiàn)更強(qiáng)的條帶。在稱作譜型分析的技術(shù)中，擴(kuò)增帶有J和D區(qū)段的各V區(qū)段，以評估這些擴(kuò)增子中是否顯示克隆擴(kuò)張。
[0009]譜型分析法的一個問題是，多種不同序列可能具有相同長度并因此無法區(qū)分。因此，通過該技術(shù)僅能辨別明顯的克隆擴(kuò)張。需要用于自體免疫疾病和自體免疫疾病狀態(tài)以及免疫系統(tǒng)起中心作用的其它疾病的診斷和預(yù)后協(xié)助的改進(jìn)方法。免疫系統(tǒng)的廣泛多樣性使其具有潛在有用細(xì)胞的極大儲備，但也顯示出對于嘗試采用該庫以達(dá)推測目的的研究者的挑戰(zhàn)。靶向抗原的任何單一序列均是可能涉及和/或關(guān)聯(lián)指定個體中疾病過程的為數(shù)眾多的序列之一。能夠鑒定給定個體的多種細(xì)胞中有哪些涉及疾病過程的方法對人類健康而言將極具價值。
[0010]概述
[0011]本發(fā)明涉及用于監(jiān)測免疫庫和分析免疫系統(tǒng)概況的方法。與先前描述的明確需要特定免疫細(xì)胞群(例如，T細(xì)胞或B細(xì)胞)和對個體細(xì)胞和/或源自此類細(xì)胞的個體核酸分子的空間分離的方法不同，本發(fā)明方法采用異種細(xì)胞群及其衍生的異種核酸混合物來進(jìn)行。
[0012]一方面，本發(fā)明提供測定全血樣品中免疫球蛋白同種型的方法，所述方法通過如下方式進(jìn)行:從獲自對象的包含多種細(xì)胞類型的生物學(xué)樣品分離多種核酸，并檢測所述多種核酸中免疫球蛋白的恒定區(qū)特異的序列；由此測定免疫球蛋白同種型。
[0013]所述方法通常涉及如下步驟:從來自對象的包含多種不同細(xì)胞類型的生物學(xué)樣品獲得核酸，從所述生物學(xué)樣品分離核酸，檢測免疫球蛋白的一個或多個區(qū)域特異的序列，和測定序列的不同水平以產(chǎn)生免疫球蛋白同種型譜。
[0014]具有多種不同細(xì)胞類型的生物學(xué)樣品包括但不限于:血液、血液成分、唾液、痰、尿、精液、陰道液體、腦脊髓液、糞、細(xì)胞和組織活檢物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品是全血且樣品小于100 μ Lo
[0015]分離自此類生物學(xué)樣品的核酸可以是DNA(例如，cDNA)或RNA。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)分離的核酸是總RNA。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)分離的核酸是由總RNA生成的cDNA。在一些實(shí)施方式中，采用免疫球蛋白的一個或多個區(qū)域(例如免疫球蛋白VDJ區(qū)和/或Ig恒定區(qū))特異的多種引物擴(kuò)增cDNA。
[0016]所述檢測步驟可采用雜交捕獲或測序技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)的示例包括但不限于:合成測序技術(shù)，例如大規(guī)模平行測序、單分子測序、True單分子測序、焦磷酸測序等?？捎糜诒景l(fā)明方法的合適的測序平臺包括但不限于=True單分子測序(tSMS?)技術(shù)，例如螺旋公司(Helicos Inc)提供的HeliScope?測序儀，單分子實(shí)時(SMRT?)技術(shù)，例如太平洋生物科學(xué)公司(Pacific B1sciences)提供的PacB1RSV F系統(tǒng)，大規(guī)模平行測序技術(shù)，例如牛米納公司(niumina，Inc.)提供的HiSEQ11^PMiSEQ?系統(tǒng)，氧化鋁公司(Alumina, Inc.)提供的Solexa?測序儀，生命技術(shù)公司(LifeTechnologies, Inc.)提供的SOLiD?測序系統(tǒng),和生命技術(shù)公司提供的1n Torrent系統(tǒng)。
[0017]在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供采用測序技術(shù)對直接來自外周全血或其成份衍生的核酸的免疫球蛋白同種型測序以分析免疫系統(tǒng)概況的方法。在其它【具體實(shí)施方式】中，通過對外周血單核細(xì)胞衍生的核酸直接測序獲得免疫球蛋白同種型譜。如本文所用，術(shù)語“外周全血”指其中諸如血紅細(xì)胞、血白細(xì)胞、血漿或血小板的組分未經(jīng)去除的血液，而術(shù)語“外周血單核細(xì)胞”或“PBMC”指具有圓細(xì)胞核的血細(xì)胞混合物，且包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
[0018]通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的譜可用于診斷疾病和病癥，和用于診斷疾病和病癥的狀態(tài)。本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測疾病和病癥，和評估對疾病和病癥的治療。本發(fā)明方法可應(yīng)用的疾病和病癥包括自體免疫疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和強(qiáng)直性脊柱炎。本發(fā)明的方法還可應(yīng)用于診斷、監(jiān)測和治療移植物排斥和免疫老化(immune aging)。此外,本發(fā)明的用于免疫概況分析的方法可用于診斷、監(jiān)測和治療于免疫系統(tǒng)相關(guān)的其它疾病，包括癌癥和傳染病。
[0019]附圖簡要說明
[0020]圖1顯示的餅圖說明在三個不同測序運(yùn)行中獲得的三個樣品(#1、#2和#3)的同種型分布圖。
[0021]發(fā)明詳述
[0022]本文所述的方法和材料應(yīng)用測序技術(shù)用于分析獲自對象的生物學(xué)樣品中的免疫受體基因群和免疫球蛋白同種型分布。免疫受體基因群的測序提供特定和詳細(xì)的分子表征以及對感興趣的序列檢測的高靈敏度，以協(xié)助疾病診斷和監(jiān)測。
[0023]用于采用微芯片陣列(例如，ImmunArray)免疫庫概況分析的方法或測序技術(shù)已經(jīng)描述。
[0024]然而，此類基于序列的方法需要分離特定的免疫細(xì)胞(例如，T細(xì)胞或B細(xì)胞)群，并將此類細(xì)胞空間分離成個體細(xì)胞和/或源自此類細(xì)胞的個體核酸分子以形成克隆(參見，例如US2010/0151471)。相反，本發(fā)明提供的用于免疫球蛋白同種型譜分析的方法采用敏感的、高通量的測序技術(shù)對來自異種細(xì)胞群衍生的異種核酸混合物的免疫球蛋白同種型直接測序。在本發(fā)明之前，從未實(shí)現(xiàn)對異種細(xì)胞群及其衍生的異種核酸混合物的“噪音”或“背景”中的特定免疫球蛋白同種型進(jìn)行檢測和定量。具體而言，可測定很小樣品大小(例如一滴血)的同種型。因此，本發(fā)明方法與常規(guī)方法的不同之處在于，本方法是非侵入性的，并且不需要受過訓(xùn)練的抽血醫(yī)師從患者抽血。此外，與常規(guī)方法不同，本發(fā)明方法不需要血液分級分離。本發(fā)明方法通常涉及如下步驟:從對象獲得外周全血樣品，從所述外周全血樣品或其分級分離部分(例如，外周血單核細(xì)胞)分離RNA，采用靶標(biāo)特異性引物使所述經(jīng)分離的RNA逆轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生免疫球蛋白cDNA轉(zhuǎn)錄本，采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增免疫球蛋白VDJ至Ig恒定區(qū)，對擴(kuò)增子測序，以及分析序列數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析包括如下步驟:提取各同種型的Ig恒定區(qū)序列，并比較給定樣品的全部Ig同種型序列的總數(shù)。
[0025]通過對源自外周血的細(xì)胞(例如，外周血細(xì)胞，或外周血單核細(xì)胞)制樣來監(jiān)測健康者和患病者的免疫庫能夠在免疫球蛋白同種型水平揭示疾病信號。通過比較通過對源自外周血的經(jīng)擴(kuò)增cDNA測序顯示的各同種型的量，能夠檢測水平從而區(qū)分患病個體和健康個體。
[0026]對象
[0027]本發(fā)明方法采用來自對象或個體的生物學(xué)樣品。對象可以是患者，例如，患有自體免疫疾病、傳染病或癌癥的患者，或移植受者。對象可以是人或非人哺乳動物。對象可以是任何年齡(例如，胎兒、嬰兒、兒童或成人)的男性或女性對象。
[0028]樣品
[0029]本發(fā)明方法采用的樣品可包括，例如，來自對象的體液，包括圍繞胎兒的羊水、水狀體、膽汁、血液和血漿、耳垢(耳蠟)、考珀液或射精前分泌物、乳糜、食糜、女性噴射物、間質(zhì)液、淋巴、經(jīng)液、母乳、黏液(包括鼻涕和痰)、胸膜液、膿、唾液、皮脂(皮油)、精液、血清、汗液、淚液、尿、陰道分泌物、嘔吐物、糞、體內(nèi)液體包括圍繞腦的腦脊髓液、圍繞骨關(guān)節(jié)的滑液、胞內(nèi)液(細(xì)胞內(nèi)的液體)和玻璃狀液(眼球內(nèi)的液體)。
[0030]在一個實(shí)施方式中，所述樣品是血液樣品，例如外周全血樣品或其分級分離部分。優(yōu)選地，所述樣品是未經(jīng)分離分級的全血。
[0031]所述血液樣品可以是約0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 或 5.0mL。優(yōu)選地，所述樣品是100 μ L或更少。最優(yōu)選地,所述樣品是50 μ L或更少。
[0032]在某些實(shí)施方式中，所述樣品是腦脊液(CSF)(例如，當(dāng)對象患有多發(fā)性硬化時)、滑液(例如，當(dāng)對象患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時)，或皮膚(或其它器官)活檢物(例如，當(dāng)對象患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡時)。
[0033]不希望受任何理論限制，免疫球蛋白同種型可由最可能反映病理學(xué)的可獲得的體液/組織來鑒定，隨后從不同體液(例如，血液)監(jiān)測同種型水平和具體疾病的克隆型信號。
[0034]在疾病停止或發(fā)病時均可根據(jù)本發(fā)明方法分析樣品，以協(xié)助鑒定與特定疾病相關(guān)聯(lián)的克隆型信號。
[0035]所述樣品可由健康護(hù)理提供者獲得，例如，醫(yī)師、醫(yī)師助理、護(hù)士、獸醫(yī)、皮膚學(xué)家、風(fēng)濕病學(xué)家、牙醫(yī)、軍醫(yī)或外科醫(yī)生。所述樣品可由研究技術(shù)人員獲得。可從對象獲得多于一個樣品。
[0036]所述樣品可以是活檢物，例如，皮膚活檢物。所述活檢物可來自，例如，腦、肝、肺、心、結(jié)腸、腎或骨髓?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所用的任何活檢技術(shù)來從對象分離樣品。例如，活檢可以是開放式活檢，其中采用全身麻醉?；顧z可以是封閉式活檢，其中采取比開放式活檢中規(guī)模較小的切割。所述活檢可以是核心活檢或切入式活檢，其中移出組織的部分。所述活檢可以是切除式活檢，其中嘗試移出完整損害。所述活檢可以是細(xì)針吸活檢，其中組織或液體樣品用針移出。
[0037]所述樣品可包括免疫細(xì)胞。所述免疫細(xì)胞可包括T細(xì)胞和/或IB-細(xì)胞。T細(xì)胞(Τ淋巴細(xì)胞)包括，例如，表達(dá)T細(xì)胞受體的細(xì)胞。T細(xì)胞包括輔助T細(xì)胞(效應(yīng)物T細(xì)胞或Th細(xì)胞)、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)、記憶T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一些應(yīng)用中(例如，用于確定相關(guān)T細(xì)胞的校準(zhǔn)試驗(yàn))，所述樣品可包括單一細(xì)胞，或者更一般地包括至少1，000個、至少10，000個、至少100，000個、至少250，000個、至少500，000個、至少750，000個或至少1，000，000個T細(xì)胞。
[0038]B細(xì)胞包括，例如，血漿B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、BI細(xì)胞、Β2細(xì)胞、邊緣區(qū)B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞。B細(xì)胞能表達(dá)免疫球蛋白(抗體、B細(xì)胞受體)。在一些應(yīng)用中(例如，用于確定相關(guān)B細(xì)胞的校準(zhǔn)試驗(yàn))，所述樣品可包括單一細(xì)胞，或者更一般地包括至少1，000個、至少10，000個、至少100，000個、至少250，000個、至少500，000個、至少750，000個或至少1,000，000 個 B 細(xì)胞。
[0039]所述樣品可包含核酸，例如，DNA(例如，染色體DNA或線粒體DNA)或RNA(例如，信使RNA或微小RNA)。所述核酸可以是無細(xì)胞DNA或RNA。本發(fā)明方法中，來自對象的可分析的RNA或DNA的量包括，例如，在一些應(yīng)用(例如，校準(zhǔn)試驗(yàn))中，低至單一細(xì)胞，且多至I千萬個細(xì)胞或更多，經(jīng)轉(zhuǎn)換即為6pg?60 μ g DNA,和約Ipg?10 μ g RNA。
[0040]擴(kuò)增反應(yīng)
[0041]可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增細(xì)胞收集物中的有關(guān)區(qū)域。可采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)來從靶核酸產(chǎn)生RNA擴(kuò)增子?？煞珠_分析(例如，通過測序分析)來自各細(xì)胞的核酸，因?yàn)楦骷?xì)胞將攜帶其自身獨(dú)特的免疫球蛋白同種型信息。
[0042]在一些實(shí)施方式中，采用多重PCR從異種核酸擴(kuò)增免疫球蛋白序列的VDJ至Ig恒定區(qū)。
[0043]在一些實(shí)施方式中，在多重反應(yīng)中采用退火至C區(qū)的至少一個引物和可退火至一個或多個V區(qū)段的一個或多個引物從異種核酸擴(kuò)增免疫球蛋白序列。在多重反應(yīng)中，退火至V區(qū)段的引物的數(shù)目可以是，例如，10?60、20?50、30?50、40?50、20?40、30?40或35?40。所述引物可退火至不同V區(qū)段。就IgH基因而言，因?yàn)閂區(qū)段中可能的體細(xì)胞突變，可采用退火至各V區(qū)段的多重引物，例如，1、2、3、4或5個引物/V區(qū)段。在多重反應(yīng)中，退火至丫區(qū)段的引物的數(shù)目可包括，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。多重反應(yīng)中，退火至C區(qū)段的引物的數(shù)目可以是I?10、2?9、3?8、4?7、3?8或3?6。
[0044]在一些實(shí)施方式中，待擴(kuò)增的區(qū)域包括全長克隆序列或克隆序列的子集，包括免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因的V-D接合處、D-J接合處，免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因的全長可變區(qū)、抗原識別區(qū)或CDR(例如，互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3))。
[0045]在一些實(shí)施方式中，采用一級和二級擴(kuò)增步驟擴(kuò)增免疫球蛋白序列。不同擴(kuò)增步驟各自可包括不同引物。所述不同引物可引入免疫基因序列中原始不存在的序列。例如，擴(kuò)增程序可添加一個或多個標(biāo)簽至經(jīng)擴(kuò)增免疫球蛋白序列的5'和/或3'端。所述標(biāo)簽可以是便于經(jīng)擴(kuò)增DNA的后續(xù)測序的序列。所述標(biāo)簽可以是便于使經(jīng)擴(kuò)增序列結(jié)合至固體支持物的序列。所述標(biāo)簽可以是便于鑒別經(jīng)擴(kuò)增免疫球蛋白序列的條形碼或標(biāo)記物。
[0046]用于擴(kuò)增的其它方法可在V區(qū)內(nèi)不采用任何引物。或者，可從C區(qū)段采用特異性引物，并在另一側(cè)(5')設(shè)置通用引物?？稍谕ㄟ^不同方法(包括詳細(xì)描述的鏈轉(zhuǎn)換方法)的cDNA合成中附加通用引物。類似地，可在通過不同方法(包括連接)制備cDNA之后附加通用引物。
[0047]擴(kuò)增可用于本發(fā)明方法的核酸的其它方法包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄-PCR、實(shí)時PCR、定量實(shí)時PCR、數(shù)字PCR (dPCR)、數(shù)字乳液PCR (dePCR)、克隆PCR、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性PCR(AFLP PCR)、等位基因特異性PCR、組裝PCR、不對稱PCR(其中采用針對選定鏈的大幅過量的引物)、集落PCR、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、熱啟動PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR、長PCR(DNA延伸超過約5千堿基)、多重PCR、巢式PCR(采用多于一個引物對)、單細(xì)胞PCR、降落PCR、環(huán)介導(dǎo)的等溫PCR(LAMP)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。其它擴(kuò)增方案包括:連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分支DNA擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)-環(huán)擴(kuò)增、SPIA擴(kuò)增、通過捕獲和連接(TACL)擴(kuò)增的靶標(biāo)擴(kuò)增，和RACE擴(kuò)增。
[0048]可通過采用反轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，將樣品中RNA的中信息轉(zhuǎn)變成 cDNA(參見，例如，Sambrook, Fritsch 和 Maniatis, MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊》)，第二版(1989))。可在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中采用多聚A引物、隨機(jī)引物和/或基因特異性引物。
[0049]可用于本發(fā)明方法中的擴(kuò)增的聚合酶包括，例如，Taq聚合酶、AccuPrime聚合酶或Pfu。可根據(jù)保真度和效率是否優(yōu)選來選擇待用的聚合酶。
[0050]在從基因組擴(kuò)增DNA之后(或通過反轉(zhuǎn)錄RNA擴(kuò)增cDNA形式的核酸之后)，直接對擴(kuò)增子測序。
[0051]測序
[0052]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于對核酸測序的任何技術(shù)均可用于本發(fā)明方法。DNA測序技術(shù)包括:采用經(jīng)標(biāo)記的終止子或引物以及平板或毛細(xì)管中的凝膠分離的經(jīng)典雙脫氧測序反應(yīng)(桑格法)、采用可逆終止的經(jīng)標(biāo)記核苷酸的合成測序法、焦磷酸測序、454測序、針對經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交、采用針對經(jīng)標(biāo)記克隆文庫的等位基因特異性雜交隨后連接的合成測序法、在聚合步驟過程中對經(jīng)標(biāo)記的核苷酸摻入的實(shí)時監(jiān)測，以及SOLiD測序。
[0053]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)產(chǎn)生至少100個讀數(shù)/運(yùn)行、至少200個讀數(shù)/運(yùn)行、至少300個讀數(shù)/運(yùn)行、至少400個讀數(shù)/運(yùn)行、至少500個讀數(shù)/運(yùn)行、至少600個讀數(shù)/運(yùn)行、至少700個讀數(shù)/運(yùn)行、至少800個讀數(shù)/運(yùn)行、至少900個讀數(shù)/運(yùn)行、至少1000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少5，000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少10，000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少50，000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少100，000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少500，000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少1，000, 000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少2，000, 000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少3，000, 000個讀數(shù)/運(yùn)行、至少4，000, 000讀數(shù)讀數(shù)/運(yùn)行、至少5000，000讀數(shù)/運(yùn)行、至少6，000, 000讀數(shù)/運(yùn)行、至少7，000, 000讀數(shù)/運(yùn)行、至少8，000, 000讀數(shù)/運(yùn)行、至少9，000, 000個讀數(shù)/運(yùn)行或至少10，000, 000讀數(shù)/運(yùn)行。
[0054]在一些實(shí)施方式中，測序讀數(shù)/制樣B細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)該是制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少2倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少3倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少5倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少6倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少7倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少8倍、制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少9倍，或制樣B細(xì)胞數(shù)目的至少10倍，但不限于5x (更少或更多均可以足夠)。如此，例如I百萬到I千萬個讀數(shù)/樣品，等。測序深度允許使制樣的B細(xì)胞精確平均化，便于誤差校正并確保對于所述文庫的測序已經(jīng)飽和。
[0055]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)每次讀數(shù)可產(chǎn)生約30bp、約40bp、約 50bp、約 60bp、約 70bp、約 80bp、約 90bp、約 10bp、約 I1bp、約 120bp,每次讀數(shù)約 150bp、約 200bp、約 250bp、約 300bp、約 350bp、約 400bp、約 450bp、約 500bp、約 550bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp或約1，OOObp。例如,本發(fā)明方法所用的測序技術(shù)每次讀數(shù)可產(chǎn)生至少 30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 I, 000。
[0056]True單分子測序
[0057]可用于本發(fā)明方法的測序技術(shù)包括，例如，Helicos True單分子測序(tSMS)(Harris T.D.等.(2008) Science320:106-109)。在 tSMS 技術(shù)中，將 DNA 樣品切割成約100?200個核苷酸的鏈，然后向各DNA鏈的3'端添加多聚A序列。各鏈通過添加經(jīng)熒光標(biāo)記的腺嘌呤核苷酸來標(biāo)記。然后使所述DNA鏈雜交至流動室，所述流動槽包含固定在流動室表面的數(shù)百萬個寡T捕獲位點(diǎn)。所述模板的密度可以是約I億模板/cm2。然后，將所述流動室裝載至儀器(例如，HeliScope?測序儀)中，并用激光照射所述流動室表面，揭示各模板的位置。CCD照相機(jī)可繪制所述流動室表面的模板位置。然后，切割并洗去所述模板熒光標(biāo)記物。所述測序反應(yīng)由引入DNA聚合酶和經(jīng)熒光標(biāo)記的核苷酸開始。所述寡T核酸作為引物。所述聚合酶以模板定向的方式將經(jīng)標(biāo)記的核苷酸納入引物。去除所述聚合酶和未納入的核苷酸。通過對所述流動室表面成像來檢測已定向納入經(jīng)熒光標(biāo)記的核苷酸的模板。成像后，切割步驟去除熒光標(biāo)記物，并用其它經(jīng)熒光標(biāo)記的核苷酸重復(fù)該過程直至達(dá)到所需讀數(shù)長度。采用各核苷酸添加步驟收集序列信息。
[0058]454 測序
[0059]可用于本發(fā)明方法的DNA測序技術(shù)的另一個示例是454測序(羅氏(Roche))(Margulies, M 等.2005, Nature, 437, 376-380)。454 測序涉及兩個步驟。第一步驟中，將DNA剪切成約300?800堿基對的片段，并使所述片段具有鈍端。然后，使寡核苷酸銜接子連接至所述片段末端。所述銜接子起擴(kuò)增和片段測序用引物的作用?？刹捎美玢暯幼覤 (Adaptor B，其包含5,-生物素標(biāo)簽)使所述片段連接至DNA捕獲珠(例如，鏈霉親和素被覆的珠)。使連接至所述珠的片段在油-水乳液液滴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得結(jié)果是各珠上克隆擴(kuò)張的DNA片段的多重拷貝。在第二步驟中，使所述珠在孔(皮升(pico-liter)級大小)中被捕獲。在各DNA片段上平行進(jìn)行焦磷酸測序。添加一個或多個核苷酸產(chǎn)生光信號，所述光信號由測序儀器內(nèi)CCD照相機(jī)記錄。所述信號強(qiáng)度與納入的核苷酸數(shù)目成比例。
[0060]焦磷酸測序利用在添加核苷酸后釋放的焦磷酸鹽(PPi)。PPi在腺嘌呤5'磷酰硫酸存在下通過ATP硫酸化酶轉(zhuǎn)變成ATP。熒光素酶利用ATP將熒光素轉(zhuǎn)變成氧化螢光素，而該反應(yīng)產(chǎn)生光，檢測并分析所述光。
[0061]基因組測序儀FLX?
[0062]本發(fā)明方法中可用的DNA測序技術(shù)的另一個示例是基因組測序儀FLX系統(tǒng)(羅氏(Roche)/454)。所述基因組測序FLX系統(tǒng)(例如，GS FLX/FLX+，GS初級)提供多于I百萬高質(zhì)量讀數(shù)/運(yùn)行，且讀數(shù)長度為400個堿基。這些系統(tǒng)是理想上適合于對全基因組和任何大小的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行從頭測序，對復(fù)合樣品的宏基因組表征或重測序研究。
[0063]SOLiD? 測序
[0064]本發(fā)明方法中可用的DNA測序技術(shù)的另一個示例是SOLiD技術(shù)(生命技術(shù)公司(Life Technologies, Inc.))。在SOLiD測序中，基因組DNA被剪切成片段，并且使銜接子連接至所述片段的5'和3'端以生成片段文庫。或者，可通過如下方式引入內(nèi)部銜接子:將銜接子連接至所述片段的5'和3'端，使所述片段環(huán)化，消化所述環(huán)化的片段以產(chǎn)生內(nèi)部銜接子，并使銜接子連接至所得片段的5'和3'端以產(chǎn)生伴侶配對的文庫。接著，在包含珠、引物、模板和PCR組分的微型反應(yīng)器中制備克隆珠的群。PCR后，使所述模板變性，并且富集所述珠以分離帶有延伸的模板的珠。對選定珠上的模板進(jìn)行3,修飾，該修飾允許結(jié)合至載玻片。
[0065]可通過依次使部分隨機(jī)寡核苷酸與中央確定堿基(或堿基對)雜交和連接來測定序列，所述中央確定堿基(或堿基對)通過特異性熒光團(tuán)來鑒定。在記錄顏色之后，所述連接的寡核苷酸被切割并去除，然后重復(fù)該過程。
[0066]1n Torrent? 測序
[0067]本發(fā)明方法中可用的DNA測序技術(shù)的另一個示例是1nTorrent系統(tǒng)(生命技術(shù)公司(Life Technologies, Inc.))。1n Torrent采用高密度的微型機(jī)械加工的孔陣列以大規(guī)模平行的方式進(jìn)行該生化過程。各孔含有不同的DNA模板。所述孔下是離子敏感層，且該層下是專有的離子(1n)傳感器。如果核苷酸(例如C)添加至DNA模板并且隨后納入DNA鏈，則氫離子將被釋放。所述離子的電荷將改變?nèi)芤旱膒H，這可由專有的離子傳感器來檢測。測序儀將判定(call)堿基，直接將化學(xué)信息變成數(shù)字信息。然后，離子個人基因組儀器(1n Personal Genome Machine) (PGM?)測序儀用一個接一個的核苷酸依次注滿所述芯片。如果注入所述芯片的下一個核苷酸不匹配，則不會記錄電壓變化也不會判定堿基。如果在所述DNA鏈上有兩個相同的堿基，則該電壓會加倍，并且所述芯片會記錄判定的兩個相同堿基。由于這是直接檢測(即沒有掃描、照相機(jī)或光照的檢測)，因此以秒記錄各核苷酸納入。
[0068]HiSeq? 和 MiSeq? 測序
[0069]本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)的另一個示例包括來自億明達(dá)公司(IIlumina, Inc.)的 HiSEQ? 系統(tǒng)(例如，HiSEQ2000? 和 HiSEQ100?)和 MiSEQ? 系統(tǒng)。所述HiSEQ?系統(tǒng)基于針對數(shù)百萬個片段的大規(guī)模平行測序，所述測序采用將隨機(jī)片段化的基因組DNA連接至光學(xué)透明的平表面并固相擴(kuò)增以生成含數(shù)百萬個簇的高密度測序流動室，其各包含約1，000個模板拷貝/cm2。采用四色DNA合成測序技術(shù)對這些模板測序。所述MiSEQ?系統(tǒng)采用TruSeq，億明達(dá)(Illumina)公司的基于可逆終止子的合成測序。SOLEXA?測序
[0070]本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)的另一個示例是SOLEXA測序(億明達(dá))。SOLEXA測序是基于固體表面上的DNA擴(kuò)增，采用折回(f ο I d-back) PCR和錨定引物進(jìn)行。使基因組DNA片段化，并且向所述片段的5'和3'端添加銜接子。使連接至流動室通道表面的DNA片段進(jìn)行延伸和橋擴(kuò)增。所述片段變成雙鏈，并且使所述雙鏈分子變性。多輪固相擴(kuò)增，然后變性，可在流動室的各通道內(nèi)產(chǎn)生相同模板的單鏈DNA分子的約1，000個拷貝的數(shù)百萬個簇。采用引物、DNA聚合酶和經(jīng)四種熒光團(tuán)標(biāo)記的，可逆終止的核苷酸來進(jìn)行順序測序。納入核苷酸后，采用激光來激發(fā)所述熒光團(tuán)，然后捕獲圖像，并記錄第一個堿基的鑒定信息。將來自各納入堿基的3'終止子和熒光團(tuán)去除，并重復(fù)所述納入、檢測和鑒定步驟。
[0071]SMRT? 測序
[0072]本發(fā)明方法可用的測序技術(shù)的另一個示例包括太平洋生物科學(xué)公司(PacificB1sciences)的單分子、實(shí)時(SMRT?)技術(shù)。在SMRT?中，使四種DNA堿基各自連接至四種不同的熒光染料之一。這些染料是磷連接的。單一 DNA聚合酶用單一單鏈DNA模板分子固定在零模式波導(dǎo)(ZMW)的底部。ZMW是使單核苷酸的納入能夠被觀察到的封閉結(jié)構(gòu)，通過針對在所述ZMW內(nèi)外快速(以微秒計(jì))擴(kuò)散的熒光核苷酸背景的DNA聚合酶來進(jìn)行所述觀察。需要數(shù)毫秒來將核苷酸納入生長中的鏈。在該時程中，所述熒光標(biāo)記物被激發(fā)并產(chǎn)生熒光信號，而所述熒光標(biāo)簽被切割掉。檢測所述染料的對應(yīng)熒光指示納入了哪個堿基。重復(fù)所述過程。
[0073]納米孔測序
[0074]本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)的另一個示例是納米孔測序(Soni G V和MellerA.(2007)Clin Chem53:1996-2001)。納米孔是直徑在I納米級別的小洞。將納米孔浸入傳導(dǎo)液并穿過該液體施加電壓導(dǎo)致輕微電流，這歸因于通過所述納米孔的離子傳導(dǎo)。流過的電流量對納米孔的大小敏感。由于DNA分子穿過納米孔，所述DNA分子上的各核苷酸不同程度地阻塞所述納米孔。因此，DNA分子穿過納米孔時通過納米孔的電流變化代表對DNA測序的讀數(shù)。
[0075]化學(xué)敏感性的場效應(yīng)晶體管陣列測序本發(fā)明方法中可用的測序技術(shù)的另一個示例涉及采用化學(xué)敏感性的場效應(yīng)晶體管(chemFET)陣列來對DNA測序(例如，如美國專利申請
【發(fā)明者】M·U·赫欽斯, D·賽里格森 申請人:林納格生物科學(xué)股份有限公司