可用于分離和／或純化核酸的試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于樣品材料預(yù)處理的特定試劑。使用本發(fā)明所述試劑的預(yù)處理能夠通過統(tǒng)一方法從非常不同的樣品材料中分離核酸，尤其是不同的生物處理樣品，即使所述核酸僅以小量存在于所述樣品材料中。用于預(yù)處理的試劑包括至少一種含氨基的化合物作為關(guān)鍵組分。本發(fā)明還涉及純化核酸的方法以及合適的試劑盒，在所述方法中所述樣品材料進(jìn)行相應(yīng)地預(yù)處理。
【專利說明】可用于分離和/或純化核酸的試劑
[0001]本發(fā)明涉及適用于分離和/或純化核酸的一種試劑以及數(shù)種方法和試劑盒，尤其是從包含低濃度待分離靶核酸的樣品中分離和/或純化核酸。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于分離核酸如DNA和RNA的大量方法，這些方法允許從各種來源的樣品材料中分離。這些包括天然來源的樣品材料，例如能夠從人、動(dòng)物、植物和環(huán)境中得到的復(fù)雜樣品，以及來自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的樣品材料，如微生物和細(xì)胞培養(yǎng)材料。
[0004]核酸分離的基本原理一般與樣品材料的類型無關(guān)并且能分成一些步驟:樣品材料的任選消化，例如采用裂解形式，實(shí)際的核酸分離以及任選地，經(jīng)分離核酸的純化。從污染的樣品組分例如細(xì)胞片段和不同于核酸的分子中分離靶標(biāo)核酸，以及所述核酸的純化能夠分為兩種類型的方法，其主要的差別在于分離步驟的數(shù)量和分離試劑:
[0005]在經(jīng)典的方法中，通常首先向樣品材料加入含有離液劑的水性緩沖液用于各細(xì)胞的裂解、樣品的消化，所述緩沖液通常含有胍鹽。這之后通常是污染蛋白質(zhì)的變性和通過與有機(jī)提取劑混合來提取核酸，該提取劑通常含有苯酚和/或氯仿。在分離含有核酸的水相與有機(jī)相之后，進(jìn)行例如醇沉淀以從水溶性污染物和苯酚/氯仿組分中純化核酸。
[0006]此提取方法的缺點(diǎn)是小部分的有機(jī)提取物可能總是殘留在水相中，從而需要多個(gè)耗時(shí)的核酸相純化步驟， 這對(duì)于靶標(biāo)核酸的產(chǎn)率具有負(fù)面影響。甚至在多個(gè)純化步驟之后，純化的核酸樣品經(jīng)常不具有后續(xù)應(yīng)用的必要純度，尤其是提取劑苯酚的殘留物。
[0007]替代性的多步驟方法通過使用固體礦物運(yùn)載體材料避免了毒性有機(jī)溶劑的使用，該固體礦物運(yùn)載體材料是基于例如二氧化硅化合物。由于核酸與運(yùn)載體材料的一般主要選擇性結(jié)合，所述核酸以核酸-運(yùn)載體材料絡(luò)合物的形式被分離。此方法中的起始步驟通常也是細(xì)胞裂解，除非待分離核酸已經(jīng)以游離形式存在。為了降解細(xì)胞組分和/或其他樣品組分，例如蛋白質(zhì)，通常向樣品材料加入含有離液劑的水性緩沖液和蛋白降解酶。然后，在合適的結(jié)合條件下，通常在醇存在的情況下，從所用樣品材料中釋放的核酸與所述運(yùn)載體材料接觸。第一個(gè)需要的分離步驟通常是基于運(yùn)載體材料對(duì)核酸的選擇性吸收，一般隨后是從周圍液體中分離所得的核酸-運(yùn)載體絡(luò)合物。如果運(yùn)載體材料功能是例如作為過濾器基質(zhì)，這能夠在過濾過程中幾乎同時(shí)發(fā)生，或者在用于從懸浮液分離所述絡(luò)合物的后續(xù)步驟中幾乎同時(shí)發(fā)生。任選地，這之后是通過一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟純化結(jié)合的核酸。通常，洗脫在之后作為分離過程的最終步驟，其中用水性試劑使結(jié)合的核酸從運(yùn)載體材料上釋放。這個(gè)步驟是任選的，因?yàn)樵谝恍┖罄m(xù)的應(yīng)用中，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，運(yùn)載體材料與靶標(biāo)核酸的結(jié)合并不干擾這些應(yīng)用。由于此多步驟分離方法的優(yōu)點(diǎn)，如與其他經(jīng)典方法相比改善的核酸產(chǎn)率和純度，該方法已得到確立。
[0008]一些基于上述多步驟方法的相似分離方法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述(參見例如US5, 234, 809.W093 / 1122UW095 / 01359 和 W02006 / 084753)，其特征在于，例如通過使用不同的運(yùn)載體材料、從樣品和/或不同試劑組合物中分離核酸-運(yùn)載體材料絡(luò)合物的不同機(jī)制。
[0009]另外，W02009 / 144182 (Fabis等)公開了用于核酸分離和純化的裂解、結(jié)合和洗滌試劑的通用組合物，其包括至少一種離液化合物、至少一種緩沖化合物和至少一種非離子型表面活性劑。這種試劑具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠湓趦?chǔ)存中比現(xiàn)有技術(shù)已知的含有吐溫的制劑更穩(wěn)定，其用于例如細(xì)胞裂解，因?yàn)槠湓黾恿撕怂岙a(chǎn)率和/或在無混濁下生產(chǎn)核酸洗脫液。
[0010]在現(xiàn)有技術(shù)中所有已知的人工或自動(dòng)方法包括前述例子，顯示從各種樣品材料中分離和純化核酸的連續(xù)進(jìn)一步發(fā)展，用于增加產(chǎn)率、純度、速度和/或樣品通量。在現(xiàn)有技術(shù)中使用的樣品材料通常有以下共同處:它們含有需要非常大量分離的核酸和/或它們?cè)谄湫再|(zhì)和/或組成方面相似，樣品材料對(duì)于核酸純化的效率影響很小(如果有)。另外，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法也通常對(duì)于一個(gè)樣品材料或相似樣品材料(例如血液和血液產(chǎn)品)優(yōu)化。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法通常并非設(shè)計(jì)用于和/或不能從非常不同的樣品材料中以高純度和高樣品通量定量純化少量的核酸，這些樣品材料例如相對(duì)于其pH、其組成、其蛋白含量并且尤其是鹽含量明顯不同。特別地，已知的方法并不意在從生物處理樣品，如具有不同組成的水性緩沖溶液中定量純化核酸。例如在生物技術(shù)產(chǎn)品尤其是生物藥物的生產(chǎn)中，這種方法會(huì)是令人感興趣的。
[0011]生物藥 物具體包括蛋白和多肽(例如抗體、抗原、生長激素)、核酸(例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA)、病毒和/或疫苗。使用現(xiàn)代生物技術(shù)的方式，尤其是通過天然或遺傳修飾生物輔助來生產(chǎn)生物藥物。生產(chǎn)通常使用真核或原核宿主細(xì)胞，其經(jīng)常通過遺傳工程修飾使得它們能夠生產(chǎn)需要的生物藥物。在現(xiàn)有技術(shù)中熟知代表性的遺傳工程技術(shù)，并且包括但不限于將編碼感興趣產(chǎn)物如蛋白的基因以重組方式引入細(xì)胞中。為此可使用載體。然后各修飾細(xì)胞能夠生產(chǎn)感興趣產(chǎn)物。具體地，為此可能使用來自哺乳動(dòng)物和昆蟲、細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物中的重組微生物、病毒以及植物分生組織和遺傳修飾植物的細(xì)胞系。生物藥物應(yīng)用于預(yù)防、診斷和治療疾病等。另外，也能夠通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品，包括生物藥物。為此，遺傳修飾或未修飾的細(xì)胞如特定的細(xì)菌或酵母細(xì)胞，與化學(xué)前體接觸并且所述細(xì)胞通過其酶機(jī)器將所述前體轉(zhuǎn)化為需要的產(chǎn)物。
[0012]在疾病的預(yù)防中，已經(jīng)建立了用于預(yù)防細(xì)菌或病毒疾病的各種免疫技術(shù)，從而生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的疫苗正變得越發(fā)重要。這些疫苗包括病毒、偶聯(lián)或非偶聯(lián)形式的病毒包膜的抗原組分、或病毒、細(xì)菌或其他生物的純DNA組分。病毒包膜或重組病毒的部分也能夠用于預(yù)防性疫苗接種以抵御由病毒感染引起的疾病。例如，這個(gè)技術(shù)應(yīng)用于HPV(人乳頭瘤病毒)疫苗接種以預(yù)防宮頸癌。單克隆抗體主要應(yīng)用于分子診斷，并且用于例如免疫表型分析、免疫組織學(xué)測(cè)定或ELISA。疾病的治療是生物藥物的另一個(gè)不斷增長的應(yīng)用領(lǐng)域。使用重組蛋白、激素、重組生物、病毒、重組免疫細(xì)胞或也使用基因進(jìn)行治療。
[0013]生物技術(shù)產(chǎn)品通常經(jīng)過多級(jí)純化過程，具體例如生物藥物。為了得到生物技術(shù)產(chǎn)品，可例如裂解生產(chǎn)宿主，或能夠從培養(yǎng)物上清中分離生物技術(shù)產(chǎn)品。一般使用色譜方法進(jìn)行從培養(yǎng)物上清和/或裂解物中純化生物技術(shù)產(chǎn)品。此純化的目的通常是從所得生物技術(shù)產(chǎn)品去除污染物并且富集該生物技術(shù)產(chǎn)品，所述污染物例如細(xì)胞片段、細(xì)胞分子、培養(yǎng)基和鹽。另外，尤其是在生物藥物的情況中，特別感興趣的是實(shí)現(xiàn)核酸污染物(尤其是宿主細(xì)胞核酸)含量的明顯降低，因?yàn)檫@些污染物可能(例如取決于濃度和宿主)賦予最終生物藥物潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)。
[0014]通常，為了純化生物技術(shù)產(chǎn)品，具體例如生物藥物，通過標(biāo)準(zhǔn)色譜技術(shù)的方式實(shí)施純化步驟，例如離子交換色譜、蛋白A / G親和色譜、疏水性相互作用色譜和/或親水性相互作用色譜，這些一般根據(jù)每個(gè)情況中需要純化的生物藥物制劑特定選擇。從這些純化方法中得到的洗脫液在此優(yōu)選由術(shù)語生物處理樣品涵蓋，對(duì)應(yīng)于這些純化方法，所述洗脫液通常作為水性純化部分。根據(jù)所選的色譜技術(shù)，它們通常表征為成分的廣泛不同組成，例如涉及使用的純化緩沖液(例如醋酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和馬來酸鹽緩沖液)、鹽濃度、PH值、磷酸鹽成分和/或蛋白含量。連續(xù)純化步驟的生物處理樣品通常呈現(xiàn)出純度增加的生物技術(shù)產(chǎn)品，例如生物藥物，其作為純化過程的最終產(chǎn)物必須達(dá)到管理當(dāng)局的純度標(biāo)準(zhǔn)，從而其能夠被批準(zhǔn)例如作為藥物產(chǎn)品或診斷產(chǎn)品。
[0015]一些用于人類的醫(yī)藥產(chǎn)品測(cè)試和批準(zhǔn)的質(zhì)量指南由國家和國際機(jī)構(gòu)發(fā)布。這些包括ICH指導(dǎo)原則(歐盟、美國、日本)、EMEA指導(dǎo)原則(歐盟)和FDA指導(dǎo)原則(美國)和WHO指導(dǎo)原則。這些指導(dǎo)原則就藥物產(chǎn)品限定了源自宿主生物的各種分子的最大允許殘留量等，包括內(nèi)毒素的量、蛋白的量和原核或真核DNA的允許量。對(duì)于宿主生物的DNA，按照1987年的WHO決定，必須不超過每劑量待給予藥物產(chǎn)品IOOpg的量。理想上并且FDA建議，需要達(dá)到低得多的宿主DNA殘留量，最多僅IOpg /待給予劑量，以保證就患者而言更高的安全性。
[0016]相似的規(guī)定也用于其他生物技術(shù)產(chǎn)品，對(duì)于這些產(chǎn)品，核酸污染物例如帶有病毒核酸能夠代表一種問題。
[0017]在確定這些核酸污染物中看到的趨勢(shì)是使用非常敏感的分子檢測(cè)技術(shù)，例如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)。在現(xiàn)有技術(shù)中已知相應(yīng)的方法并且形成了各個(gè)專利申請(qǐng)的主題(參見例如US2009 / 325175)。然而，為了實(shí)施所述檢測(cè)，首先必需從生物處理樣品中(例如從宿主中)有效分離少量的污染核酸。此應(yīng)用不僅對(duì)于最終純化的終產(chǎn)品的核酸分析而言是令人感興趣的，其對(duì)于在純化過程中接連不斷出現(xiàn)的純化部分也是非常重要的，因?yàn)檫@些純化部分的分析能夠監(jiān)測(cè)和評(píng)估純化的成功結(jié)果。用這種方式，還能更快地檢測(cè)純化過程中的錯(cuò)誤。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，在純化過程的各個(gè)點(diǎn)并且優(yōu)選在純化過程的每個(gè)階段，測(cè)定各純化部分中靶標(biāo)核`酸的量(例如污染物，尤其是宿主DNA)是常見的。此應(yīng)用對(duì)于待使用的核酸純化方法產(chǎn)生了特定挑戰(zhàn)，因?yàn)槿缰敖忉尩?，各個(gè)純化部分在其化學(xué)組成和pH方面通常彼此顯著不同。在此，由于樣品通量高，盡管有非常不同的樣品材料，需要能夠使用統(tǒng)一的核酸純化方法，理想上可以是自動(dòng)化的，并且甚至極少量的核酸能夠通過該方法盡可能定量和一致地分離。迄今為止，市售可得用于此目的的核酸分離方法尚未令人滿意地符合這些要求，因?yàn)樗鼈兙哂懈鞣N缺點(diǎn)。
[0018]來自WAKO 公司的 DNA 提取劑試劑盒(DNA Extractor Kit) (#295-50201)是一種手動(dòng)方法，其中通過使用離液鹽(NaI)和陰離子去污劑(N-月桂基-肌氨酸鈉)使污染蛋白變性。在加入醇和糖原之后，樣品中的核酸沉淀，其中所述沉淀也可含有夾帶的污染物，其能夠在后續(xù)的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生干擾。另外，所述方法耗時(shí)并且不易于自動(dòng)化。
[0019]來自ABI公司的Pr印SEQ殘留DNA樣品制備試劑盒(Pr印SEQ Residual DNASample Preparation Kit)是使用磁性二氧化娃顆粒的方法并且適于自動(dòng)化。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是樣品材料首先需要費(fèi)力的制備，其中所述樣品必須按以下順序單獨(dú)處理:1)調(diào)整至最優(yōu)PH以及2)樣品中的NaCl的濃度調(diào)節(jié)至>0.5M。由于生物處理樣品的不同性質(zhì)和組成，此制備是必需的，否則后續(xù)的分離操作，尤其是對(duì)樣品材料中少量核酸的操作會(huì)無法有效發(fā)揮作用。所述制備耗時(shí)，因?yàn)橥ǔＦ渲荒苁謩?dòng)操作，使得此方法不允許高樣品通量。核酸分離后續(xù)步驟的自動(dòng)化不能用于這種情況下，因?yàn)槿园藛为?dú)樣品制備的步驟。
[0020]其他基于磁性顆粒的自動(dòng)化使用的方法是，例如使用來自恰根公司(QIAGENGmBH)的相應(yīng)QIAsymphony試劑盒通過實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化QIAsymphony的核酸分離方法。這些應(yīng)用能夠從一些不同樣品類型如組織、全血、血漿、血清、尿、法醫(yī)學(xué)樣品材料等中定量地分離和純化核酸，但是這些應(yīng)用最初未設(shè)計(jì)用于滿足對(duì)樣品材料的特定要求，所述樣品材料例如生物處理樣品和尤其是純化部分。如之前所解釋，這些樣品的特殊性質(zhì)從大量特定色譜技術(shù)的使用中產(chǎn)生，其通常造成水性生物處理樣品具有非常不同的化學(xué)組成和不同的PH值，這還包括已知核酸分離和純化方法的抑制劑。另外，它們一般僅僅含有少量的靶標(biāo)核酸(例如宿主DNA)。
[0021]市售可得的核酸分離的方法(包括上述作為例子提供的方法)的缺點(diǎn)突出了藥物和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中對(duì)于合適核酸分離方法的現(xiàn)有需求，其甚至允許少量的核酸如污染核酸(其源自例如宿主生物或宿主細(xì)胞)被純化，其中所述方法應(yīng)該優(yōu)選代表能夠自動(dòng)化的定量、恒定解決方法。
[0022]除了藥物和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)以外，還有其他應(yīng)用領(lǐng)域，其中檢測(cè)各種樣品材料內(nèi)以極低濃度存在的核酸是非常令人感興趣的。這些包括分子醫(yī)藥診斷，其中例如令人感興趣的是從身體材料中檢測(cè)少量存在的外來核酸如胎兒、病毒和微生物核酸。從母體血液樣品中得到游離循環(huán)的胎兒核酸通常對(duì)于產(chǎn)前診斷是至關(guān)重要的，因?yàn)槠浯砹朔治鎏旱倪z傳方法，該方法不需要穿刺并且因此對(duì)于未出生的后代沒有風(fēng)險(xiǎn)。在感染的診斷中，少量存在的微生物核酸的分離提供了關(guān)于感染的早期證據(jù)并且能夠?qū)颊哌M(jìn)行早期治療。另外，如果存在感染的風(fēng)險(xiǎn)，能夠及早理解守則，例如患者的暫時(shí)隔離，從而限制或者甚至預(yù)防感染的傳播。尤其在侵襲性、高感染性病原的情況下，極早期病原檢測(cè)是非常重要的，甚至極少數(shù)目會(huì)引起有嚴(yán)重和幾乎無法治療的病程的感染。這應(yīng)用于例如產(chǎn)生志賀菌毒素的大腸桿菌(Escherichia coli) (STEC)中，由于不能使用經(jīng)典的抗生素療法,感染這種菌經(jīng)常導(dǎo)致患者死亡。該感染的早期識(shí)別以及患者的治療和早期隔離，能夠拯救生命。少量出現(xiàn)的內(nèi)源性核酸在分子診斷中也是`令人感興趣的。這些包括例如非編碼小RNA，尤其是例如微小RNA(miRNA)分子，其在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)芐基因表達(dá)。在腫瘤診斷的領(lǐng)域中，其用作例如標(biāo)記分子。
[0023]法醫(yī)學(xué)是該應(yīng)用的另一個(gè)領(lǐng)域，其中核酸診斷起到重要作用，因?yàn)榻?jīng)常只有那種方式能夠提供澄清法醫(yī)學(xué)問題的決定性證據(jù)。法醫(yī)學(xué)樣品材料一般表征為特別廣泛的變化，原則上其包括所有能夠載有或包含人核酸的物質(zhì)和液體。然而，具體地，它們是通常僅含有極少痕量的待檢測(cè)核酸的樣品材料。因此，分子檢測(cè)系統(tǒng)需要一種非常高效和有效的分離核酸的方法，其中只有最少或理想地沒有核酸損失以完成后續(xù)的全部檢測(cè)，所述核酸僅僅以少量存在。
[0024]在食物和環(huán)境診斷中，分子核酸檢測(cè)也是非常重要的，例如為了在食品生產(chǎn)、食品檢查、育種和植物發(fā)育監(jiān)測(cè)的領(lǐng)域，和/或也在水、土壤和空氣質(zhì)量的分析中檢測(cè)由細(xì)菌、病毒、真菌和/或原生動(dòng)物造成的污染。在這種情況下，樣品材料也能夠具有非常不同的組成并且可僅僅含有極少量的感興趣核酸?；谖⑸锖怂岬姆肿訖z測(cè)而不是通過微生物培養(yǎng)方式的檢測(cè)方法，是令人信服地更節(jié)約時(shí)間和更具特異性的方法。[0025]在基礎(chǔ)研究中，合成產(chǎn)生的核酸例如小干擾RNA (siRNa)用于基因組分析。核酸的化學(xué)生成需要純化過程，所述純化過程一般通過色譜技術(shù)的方式進(jìn)行。同樣在這種情況下，核酸分離和/或純化的分子方法會(huì)是令人感興趣的，其允許所述核酸的定量分離并且能得到低鹽溶液中的產(chǎn)物。也因此，純化部分的組成必須對(duì)于核酸分離和/或純化的方法沒有任何干擾影響。
[0026]因此，本發(fā)明是基于提供一種分離和/或純化在各種組成的樣品材料中少量存在的核酸的方法，該方法特定允許經(jīng)分離核酸的定量檢測(cè)。另外，具體地，本發(fā)明所解決的特定問題是提供一種相應(yīng)的方法，其優(yōu)選能夠從各種生物處理樣品中定量分離核酸，尤其是色譜純化過程中得到的各純化部分，即使這些樣品僅僅含有少量的待分離核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027]本發(fā)明是基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，用特定試劑對(duì)樣品材料進(jìn)行意外簡(jiǎn)單預(yù)處理能夠通過統(tǒng)一方法從非常不同的樣品材料分離核酸，即使樣品材料中核酸僅僅以極少量存在。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的預(yù)處理因此能夠省去樣品材料(例如PH或鹽濃度)或后續(xù)純化方法的單獨(dú)調(diào)整或調(diào)節(jié)，即使正在加工非常不同的樣品材料。按照本發(fā)明，用特定的試劑預(yù)處理樣品材料；之后能夠發(fā)生所含核酸的實(shí)際分離。為此，由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，甚至能夠使用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)方法。如果用特定的試劑按照本發(fā)明預(yù)處理樣品材料，不同樣品材料之間的差異能夠令人驚訝地被分別彌補(bǔ)或克服，并且因此能通過統(tǒng)一的分離方法分離樣品材料所含的核酸。沒有本發(fā)明所述預(yù)處理的情況下，這是不可能的，并且不會(huì)是足夠高效或效率較低。因此，本發(fā)明對(duì)于所述根本問題提供了一種有效而且意外簡(jiǎn)單的解決方法。按照本發(fā)明的解決方法也提供了可自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟軌蚴∪悠凡牧虾?或后續(xù)分離方法的單獨(dú)調(diào)整或調(diào)節(jié)步驟 。
[0028]由于這些重要的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明特別適于從生物處理樣品中分離核酸，具體例如從生物藥物的純化過程得到的純化部分中分離核酸。這些特定樣品材料的組成(例如所包括的緩沖液和蛋白和/或鹽含量)和PH通常差異顯著，這明顯阻礙了通過統(tǒng)一方法分離核酸。有時(shí)，在沒有特別措施的情況下，從生物處理樣品分離核酸甚至是不可能的。然而，令人驚訝的是，單獨(dú)生物處理樣品之間的現(xiàn)有差異能夠通過本發(fā)明所述預(yù)處理來有效彌補(bǔ)。即使所述生物處理樣品的組成不同，能使用統(tǒng)一的核酸分離方法并用本發(fā)明所述方法高效、有效和可靠地純化甚至少量的所含核酸。使用本發(fā)明所述方法達(dá)到的檢測(cè)下限對(duì)于生物處理樣品特別重要，因?yàn)閷?duì)于這些樣品材料，需要純化的核酸經(jīng)常代表污染物(例如宿主DNA或病毒核酸)，其在樣品材料中相應(yīng)地僅僅少量存在。由于樣品材料通常性質(zhì)非常不同，在本領(lǐng)域的應(yīng)用中，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)要求嚴(yán)格并且還通過實(shí)施例得到明顯證明。它們證明了有時(shí)僅僅本發(fā)明所述預(yù)處理能夠使得全部核酸分離，并且提供了一種從各種生物處理樣品中分離非常少量核酸的高效、有效和可靠方法。另外，本發(fā)明所述方法提供了定量分離并且此外其可自動(dòng)化，這些在此特定應(yīng)用領(lǐng)域中也是有價(jià)值的優(yōu)點(diǎn)。
[0029]然而，除了在生物處理樣品并且尤其是生物藥物的領(lǐng)域中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了從其他樣品材料中純化核酸的決定性優(yōu)點(diǎn)，所述樣品材料例如僅含有少量的核酸和/或是具有非常不同的性質(zhì)。應(yīng)用的相應(yīng)領(lǐng)域也如下解釋。
[0030]因此，本發(fā)明還提供了用于從各種樣品材料中分離和/或純化核酸的各種方法、一種用于預(yù)處理所述樣品材料的特定試劑和一種用于完成本發(fā)明所述方法的試劑盒。隨后解釋本發(fā)明這些方面的細(xì)節(jié)。
[0031]發(fā)明詳述
[0032]按照本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于從樣品材料中分離和/或純化核酸的方法，所述方法包括下列步驟:
[0033]a.向所述樣品材料加入試劑，其中所述試劑包括至少一種或多種含氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0034]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0035]i1.非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0036]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0037]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0038]V.氨基羧酸聚合物，包括至少一種在(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，優(yōu)選具有0.5kDa-300kDa的尺寸，優(yōu)選形成自相同、兩種或多種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成的氨基羧酸聚合物，`
[0039]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成的肽，
[0040]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。通式(I)的化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0041]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。化合物(II)優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0042]b.優(yōu)選混合該試劑與所述樣品材料，
[0043]c.從所述樣品材料中分離和/或純化核酸，所述樣品材料已經(jīng)與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合，
[0044]d.任選定量和/或定性地檢測(cè)至少一部分的所述經(jīng)分離核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)，
[0045]其中，所述方法優(yōu)選也包括下列特征之一:
[0046]1.按照步驟(a.)加入所述樣品材料的試劑不含離液試劑或[0047]I1.如果在步驟(c.)中加入了至少一種含有離液試劑的試劑，含有離液試劑的試劑的加入在具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇不存在的情況下第一次發(fā)生。
[0048]在上述和后續(xù)提及的所有情況中，除非另外說明，進(jìn)一步定義的“烷基成分”指在純烷基基團(tuán)中和在氣基烷基、硫代烷基、羥基烷基、二(羥基烷基)和/或二(羥基烷基)中，其中在每個(gè)情況下，這些能夠具有互相獨(dú)立的陳述說明。在“烷基成分”中合適的飽和、支鏈或直鏈C1-C5烷基基團(tuán)示例是甲基、乙基、1-丙基(=正丙基)、1_甲基乙基(=異丙基)、1_ 丁基(=正丁基)、1_甲基丙基(=仲丁基)、1，1_ 二甲基乙基(=叔丁基)、2_甲基丙基(=異丁基)、1_戍基(=正戍基)、2-戍基(=仲戍基)、3_戍基、2-甲基丁基、3-甲基丁基(=異戍基)、3-甲基丁 -2-基、2-甲基丁 -2-基和2, 2- 二甲基丙基(=新戍基)。特別優(yōu)選甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。
[0049]在“烷基成分”中合適的不飽和、支鏈或直鏈C3-C5烷基基團(tuán)示例是2-丙烯基、3- 丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、順_2_ 丁烯基、反-2- 丁烯基、2_甲基-2-丙烯基、正戍烯基、1-甲基-3- 丁烯基、1-乙基-2-丙烯基、反_2_戍烯基、順_2_戍烯基、1-甲基_反_2_ 丁烯基、1-甲基_順_2_ 丁烯基、反-3-戍烯基、順-3-戍烯基、3_甲基-3- 丁烯基、I, 2_ 二甲基_2_丙烯基、2_乙基_2_丙烯基、2_甲基-反-2- 丁烯基、2_甲基-順-2- 丁烯基、3-甲基-反-2- 丁烯基、3_甲基-順-2- 丁烯基、2_甲基-3- 丁烯基、I, 1- 二甲基_2_丙烯基和2_甲基_3_ 丁烯基。
[0050]按照實(shí)施方式III，在核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之前，在步驟(c.)中將至少一種裂解劑加入按照步驟(a.)預(yù)處理的樣品材料。所述裂解劑確實(shí)能夠帶來裂解，但是并不必定總是如此,這取決于起始材料的要求。下面描述優(yōu)選的實(shí)施方式。
[0051]按照實(shí)施方式I V，用于在步驟(a.)中預(yù)處理的試劑沒有任何裂解性質(zhì)。
[0052]在按照本發(fā)明的方法中，實(shí)施方式1-1V的特征也能夠互相組合。
[0053]按照實(shí)施方式1-1V，以及由組合這些實(shí)施方式的特征所得的實(shí)施方式，包括待分離和/或純化核酸的樣品材料在步驟(a.)中與按照本發(fā)明的試劑接觸，所述材料選自下組之一:
[0054]A.水性組合物，優(yōu)選來自純化過程中的純化部分，所述組合物包括生物分子和/或生物體，其中所述生物分子和/或生物體具有至少一種下列特征:
[0055]1.所述生物分子和/或生物體選自下組:蛋白、核酸(優(yōu)選DNA、RNA、質(zhì)粒、小干擾RNA(siRNA))、病毒和/或疫苗，
[0056]i1.所述生物分子和/或生物體是藥學(xué)上活性物質(zhì)，
[0057]ii1.所述生物分子是合成或生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的，和/或
[0058]iv.所述生物分子是生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的分子，其通過遺傳修飾或未修飾的生物產(chǎn)生，
[0059]B.人或動(dòng)物體組分選自體液、體細(xì)胞和/或體組織，優(yōu)選血液、血液組分、血清、腦脊液、液體粘膜涂片(liquor mucosal smear)、痰液、尿、糞便、精液和組織樣品,其中所述身體組分包括下列分子和/或生物體中的一種或多種:
[0060]1.游離循環(huán)的人或動(dòng)物核酸，優(yōu)選游離循環(huán)的胎兒核酸、來自惡性和/或非惡性腫瘤的核酸、來自凋亡細(xì)胞的核酸、非編碼小RNA、微小RNA(miRNA)和siRNA，
[0061]i1.來自微生物的游離循環(huán)核酸，優(yōu)選來自病原體，尤其優(yōu)選來自細(xì)菌和病毒，和/或
[0062]ii1.微生物，優(yōu)選病原體，尤其優(yōu)選細(xì)菌和病毒，
[0063]C.含有細(xì)胞和/或核酸和/或生物體的法醫(yī)學(xué)樣品材料，其中所述細(xì)胞和/或核酸和/或生物體以液體樣品材料或從所述樣品材料提取的液體形式存在，
[0064]和/ 或
[0065]D.一種包括樣品組分和任選生物體的組合物，其中，所述樣品組分選自食物或其組分，以及環(huán)境成分，優(yōu)選土壤、水和植物，并且任選進(jìn)行重懸。
[0066]由于在步驟(a.)中按照本發(fā)明的預(yù)處理，所述方法具有上述優(yōu)點(diǎn)。作為使用特定試劑預(yù)處理樣品材料的的結(jié)果，顯著改善了步驟(c.)中核酸的分離和/或純化或者對(duì)于一些樣品材料，甚至變得完全可能。此外，例如能夠高效、有效并且甚至定量地分離在樣品材料中僅以極小量存在的核酸。因此，使用按照本發(fā)明的方法，即使在樣品材料中含有僅僅Ipg或更少量的核酸，它們也能被分離(甚至0.1pg或0.01pg量的分離也是可能的)。另外，按照本發(fā)明的預(yù)處理具有所述效果，即非常不同的樣品材料也能夠以相同的方式進(jìn)行加工，而對(duì)于核酸分離的效率沒有任何顯著差異。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示，即使核酸在非常不同的樣品材料中存在，例如具有3-9范圍內(nèi)的不同pH值，具有非常不同的化學(xué)組成和/或具有不同的鹽濃度時(shí)，按照本發(fā)明的方法能夠高效、有效和可靠地分離核酸。即使按照本發(fā)明的方法使用這類不同的樣品材料，由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，所述方法提供可靠地良好的分離結(jié)果。因此，按照本發(fā)明的方法開辟了迄今為止現(xiàn)有技術(shù)尚未令人滿意地起作用的應(yīng)用領(lǐng)域。具體地，核酸的定 量分離也變得可能，即使它們?cè)跇悠凡牧现袃H以少量存在。另外，按照本發(fā)明的方法適用于手動(dòng)和自動(dòng)化操作，尤其是當(dāng)處理大量樣品時(shí)這是有優(yōu)勢(shì)的。
[0067]所述方法的一個(gè)重要特征是在實(shí)施核酸分離和/或純化的步驟之前特定試劑在步驟(a.)中的應(yīng)用，這在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。該預(yù)處理具有所述效果，即樣品材料中存在的核酸隨后能高效和有效地純化，即使它們僅在多個(gè)樣品材料中少量存在和/或從樣品材料中分離，該樣品材料由于它們的組成而不能在沒有進(jìn)一步處理的情況下進(jìn)行分離，例如生物處理樣品就是如此。令人驚訝的是，在步驟(a.)中使用的試劑彌補(bǔ)了樣品材料中的差異并且因此能夠通過使用統(tǒng)一方法可靠分離核酸。此外，其使得核酸甚至能從沒有本發(fā)明所述預(yù)處理情況下無法進(jìn)行分離的樣品材料中分離。
[0068]用于預(yù)處理樣品材料的本發(fā)明所述方法步驟(a.)中使用的試劑包括至少一種或多種含選自上述(1.)-(vii1.)的氨基的化合物。如果在所述試劑中存在一種或多種具有氨基的化合物，例如，能夠存在(1.)-(vii1.)各組之內(nèi)或之間的組分的混合物。對(duì)于步驟(a.)中的預(yù)處理，所述化合物也能互相分開加入。從本發(fā)明的意義上說，此實(shí)施方式也應(yīng)代表用本發(fā)明所述試劑按照步驟(a.)的預(yù)處理。
[0069]步驟(a.)中按照本發(fā)明使用的試劑因此在用于后續(xù)核酸分離和/或純化的樣品制備的多個(gè)實(shí)施方式中合適:例如，能夠包括一種或多種極性-中性蛋白性a-氨基羧酸，如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或蘇氨酸和/或絲氨酸。此外，一種或多種非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或異亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或纈氨酸，以及一種或多種堿性a -氨基羧酸如精氨酸和/或賴氨酸和/或鳥氨酸也能包括在所述試劑中。也能包括一種或多種非蛋白性氨基羧酸，例如P -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高絲氨酸和/或D-纈氨酸。所述試劑還能包括氨基羧酸聚合物，所述氨基羧酸聚合物可優(yōu)選從相同、或兩種或多種不同的氨基羧酸單體中形成，所述氨基羧酸單體具有極性-中性蛋白性a -氨基羧酸組和/或非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸組和/或堿性a-氨基羧酸組和/或非蛋白性氨基羧酸組。所述試劑還能包括來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，所述肽優(yōu)選選自相同或不同的氨基羧酸，所述氨基羧酸具有極性-中性蛋白性a-氨基羧酸組和/或非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸組和/或堿性a-氨基羧酸組和/或非蛋白性氨基羧酸組。所述試劑中也能包括一種或多種通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基和羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2、R3和R4的殘基中的至少一個(gè)不是氫。該化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和/或N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine)。另外，所述試劑中也能包括一種或多種通式R3R4N-CR5R6R7 (II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R的7殘基中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的。對(duì)應(yīng)此通式的一個(gè)優(yōu)選化合物是三(羥基甲基)-氨基甲烷(Tris)化合物。
[0070]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,所述試劑的pH在pH3_pH9的范圍內(nèi)。如所述示例所示，按照本發(fā)明的試劑能夠具有酸性和堿性pH。
[0071]按照本發(fā)明所述試劑的一個(gè)實(shí)施方式，所述試劑包括優(yōu)選大小為0.5kDa-300kDa的氨基羧酸聚合物。所述氨基羧酸聚合物能夠以來自相同氨基羧酸單體的均聚物或來自兩種或多種不同氨基羧酸單體的共聚物形式存在，其中所述單體在聚合物鏈中排列，從而其是交替、隨機(jī)分布的，采用梯度或塊狀形式。兩種聚合物類型都優(yōu)選從下組的氨基羧酸單體中形成:(1.)極性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸和/或(ii1.)堿性a-氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸，優(yōu)選與氫鹵化物如溴化氫或氯化氫聯(lián)合。優(yōu)選選擇的化合物是聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸。此外，聚合物也包括從非蛋白性對(duì)映體化合物形式，如聚-D-賴氨酸、聚-D-賴氨酸氫溴酸鹽、聚(D-谷胺酰`胺，D-賴氨酸)氫溴酸鹽形成的聚合物。
[0072]如果本發(fā)明所述試劑的一個(gè)實(shí)施方式包含來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，這些氨基羧酸優(yōu)選選自下組的相同或不同的氨基羧酸:(1.)極性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸和/或(ii1.)堿性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸。優(yōu)選地，肽化合物從以下優(yōu)選描述的分子形成:天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，其中這些分子任意組合作為二聚體、三聚體或四聚體是可能的。下列例子包括來自2氨基羧酸的肽化合物:天冬酰胺-天冬酰胺、天冬酰胺-半胱氨酸、天冬酰胺-谷胺酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、天冬酰胺-蘇氨酸、天冬酰胺-絲氨酸、天冬酰胺-丙氨酸、天冬酰胺-亮氨酸、天冬酰胺-異亮氨酸、天冬酰胺-甲硫氨酸、天冬酰胺-脯氨酸、天冬酰胺-纈氨酸、天冬酰胺-精氨酸、天冬酰胺-賴氨酸、天冬酰胺-鳥氨酸、天冬酰胺-3 -丙氨酸、天冬酰胺-D-丙氨酸、天冬酰胺-L-高絲氨酸、天冬酰胺-D-纈氨酸、半胱氨酸-天冬酰胺、半胱氨酸-半胱氨酸、半胱氨酸-谷胺酰胺、半胱氨酸-甘氨酸、半胱氨酸-蘇氨酸、半胱氨酸-絲氨酸、半胱氨酸-丙氨酸、半胱氨酸-亮氨酸、半胱氨酸-異亮氨酸、半胱氨酸-甲硫氨酸、半胱氨酸-脯氨酸、半胱氨酸-纈氨酸、半胱氨酸-精氨酸、半胱氨酸-賴氨酸、半胱氨酸-鳥氨酸、半胱氨酸-3 -丙氨酸、半胱氨酸-D-丙氨酸、半胱氨酸-L-高絲氨酸、半胱氨酸-D-纈氨酸、谷胺酰胺-天冬酰胺、谷胺酰胺-半胱氨酸、谷胺酰胺-谷胺酰胺、谷胺酰胺-甘氨酸、谷胺酰胺-蘇氨酸、谷胺酰胺-絲氨酸、谷胺酰胺-丙氨酸、谷胺酰胺-亮氨酸、谷胺酰胺-異亮氨酸、谷胺酰胺-甲硫氨酸、谷胺酰胺-脯氨酸、谷胺酰胺-纈氨酸、谷胺酰胺-精氨酸、谷胺酰胺-賴氨酸、谷胺酰胺-鳥氨酸、谷胺酰胺-3 -丙氨酸、谷胺酰胺-D-丙氨酸、谷胺酰胺-L-高絲氨酸、谷胺酰胺-D-纈氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、甘氨酸-半胱氨酸、甘氨酸-谷胺酰胺、甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-蘇氨酸、甘氨酸-絲氨酸、甘氨酸-丙氨酸、甘氨酸-亮氨酸、甘氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-甲硫氨酸、甘氨酸-脯氨酸、甘氨酸-纈氨酸、甘氨酸-精氨酸、甘氨酸-賴氨酸、甘氨酸-鳥氨酸、甘氨酸-P -丙氨酸、甘氨酸-D-丙氨酸、甘氨酸-L-高絲氨酸、甘氨酸-D-纈氨酸、蘇氨酸-天冬酰胺、蘇氨酸-半胱氨酸、蘇氨酸-谷胺酰胺、蘇氨酸-甘氨酸、蘇氨酸-蘇氨酸、蘇氨酸-絲氨酸、蘇氨酸-丙氨酸、蘇氨酸-亮氨酸、蘇氨酸-異亮氨酸、蘇氨酸-甲硫氨酸、蘇氨酸-脯氨酸、蘇氨酸-纈氨酸、蘇氨酸-精氨酸、蘇氨酸-賴氨酸、蘇氨酸-鳥氨酸、蘇氨酸-(6-丙氨酸、蘇氨酸-D-丙氨酸、蘇氨酸-L-高絲氨酸、蘇氨酸-D-纈氨酸、絲氨酸-天冬酰胺、絲氨酸-半胱氨酸、絲氨酸-谷胺酰胺、絲氨酸-甘氨酸、絲氨酸-蘇氨酸、絲氨酸-絲氨酸、絲氨酸-丙氨酸、絲氨酸-亮氨酸、絲氨酸-異亮氨酸、絲氨酸-甲硫氨酸、絲氨酸-脯氨酸、絲氨酸-纈氨酸、絲氨酸-精氨酸、絲氨酸-賴氨酸、絲氨酸-鳥氨酸、絲氨酸-P -丙氨酸、絲氨酸-D-丙氨酸、絲氨酸-L-高絲氨酸、絲氨酸-D-纈氨酸、丙氨酸-天冬酰胺、丙氨酸-半胱氨酸、丙氨酸-谷胺酰胺、丙氨酸-甘氨酸、丙氨酸-蘇氨酸、丙氨酸-絲氨酸、丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-亮氨酸、丙氨酸-異亮氨酸、丙氨酸-甲硫氨酸、丙氨酸-脯氨酸、丙氨酸-纈氨酸、丙氨酸-精氨酸、精氨酸-賴氨酸、精氨酸-鳥氨酸、丙氨酸-P -丙氨酸、丙氨酸-D-丙氨酸、丙氨酸-L-高絲氨酸、丙氨酸-D-纈氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、亮氨酸-半胱氨酸、亮氨酸-谷胺酰胺、亮氨酸-甘氨酸、亮氨酸-蘇氨酸、亮氨酸-絲氨酸、亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-異亮氨酸、亮氨酸-甲硫氨`酸、亮氨酸-脯氨酸、亮氨酸-纈氨酸、亮氨酸-精氨酸、亮氨酸-賴氨酸、亮氨酸-鳥氨酸、亮氨酸-P -丙氨酸、亮氨酸-D-丙氨酸、亮氨酸-L-高絲氨酸、亮氨酸-D-纈氨酸、異亮氨酸-天冬酰胺、異亮氨酸-半胱氨酸、異亮氨酸-谷胺酰胺、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-蘇氨酸、異亮氨酸-絲氨酸、異亮氨酸-丙氨酸、異亮氨酸-亮氨酸、異亮氨酸-異亮氨酸、異亮氨酸-甲硫氨酸、異亮氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-纈氨酸、異亮氨酸-精氨酸、異亮氨酸-賴氨酸、異亮氨酸-鳥氨酸、異亮氨酸-3 -丙氨酸、異亮氨酸-D-丙氨酸、異亮氨酸-L-高絲氨酸、異亮氨酸-D-纈氨酸、甲硫氨酸-天冬酰胺、甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-谷胺酰胺、甲硫氨酸-甘氨酸、甲硫氨酸-蘇氨酸、甲硫氨酸-絲氨酸、甲硫氨酸-丙氨酸、甲硫氨酸-亮氨酸、甲硫氨酸-異亮氨酸、甲硫氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-脯氨酸、甲硫氨酸-纈氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、甲硫氨酸-賴氨酸、甲硫氨酸-鳥氨酸、甲硫氨酸-P -丙氨酸、甲硫氨酸-D-丙氨酸、甲硫氨酸-L-高絲氨酸、甲硫氨酸-D-纈氨酸、脯氨酸-天冬酰胺、脯氨酸-半胱氨酸、脯氨酸-谷胺酰胺、脯氨酸-甘氨酸、脯氨酸-蘇氨酸、脯氨酸-絲氨酸、脯氨酸-丙氨酸、脯氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、脯氨酸-甲硫氨酸、脯氨酸-脯氨酸、脯氨酸-纈氨酸、脯氨酸-精氨酸、脯氨酸-賴氨酸、脯氨酸-鳥氨酸、脯氨酸-3 -丙氨酸、脯氨酸-D-丙氨酸、脯氨酸-L-高絲氨酸、脯氨酸-D-纈氨酸、纈氨酸-天冬酰胺、纈氨酸-半胱氨酸、纈氨酸-谷胺酰胺、纈氨酸-甘氨酸、纈氨酸-蘇氨酸、纈氨酸-絲氨酸、纈氨酸-丙氨酸、纈氨酸-亮氨酸、纈氨酸-異亮氨酸、纈氨酸-甲硫氨酸、纈氨酸-脯氨酸、纈氨酸-纈氨酸、纈氨酸-精氨酸、纈氨酸-賴氨酸、纈氨酸-鳥氨酸、纈氨酸-3 -丙氨酸、纈氨酸-D-丙氨酸、纈氨酸-L-高絲氨酸、纈氨酸-D-纈氨酸、精氨酸-天冬酰胺、精氨酸-半胱氨酸、精氨酸-谷胺酰胺、精氨酸-甘氨酸、精氨酸-蘇氨酸、精氨酸-絲氨酸、精氨酸-丙氨酸、精氨酸-亮氨酸、精氨酸-異亮氨酸、精氨酸-甲硫氨酸、精氨酸-脯氨酸、精氨酸-纈氨酸、精氨酸-精氨酸、精氨酸-賴氨酸、精氨酸-鳥氨酸、精氨酸-3 -丙氨酸、精氨酸-D-丙氨酸、精氨酸-L-高絲氨酸、精氨酸-D-纈氨酸、賴氨酸-天冬酰胺、賴氨酸-半胱氨酸、賴氨酸-谷胺酰胺、賴氨酸-甘氨酸、賴氨酸-蘇氨酸、賴氨酸-絲氨酸、賴氨酸-丙氨酸、賴氨酸-亮氨酸、賴氨酸-異亮氨酸、賴氨酸-甲硫氨酸、賴氨酸-脯氨酸、賴氨酸-纈氨酸、賴氨酸-精氨酸、賴氨酸-賴氨酸、賴氨酸-鳥氨酸、賴氨酸-P -丙氨酸、賴氨酸-D-丙氨酸、賴氨酸-L-高絲氨酸、賴氨酸-D-纈氨酸、鳥氨酸-天冬酰胺、鳥氨酸-半胱氨酸、鳥氨酸-谷胺酰胺、鳥氨酸-甘氨酸、鳥氨酸-蘇氨酸、鳥氨酸-絲氨酸、鳥氨酸-丙氨酸、鳥氨酸-亮氨酸、鳥氨酸-異亮氨酸、鳥氨酸-甲硫氨酸、鳥氨酸-脯氨酸、鳥氨酸-纈氨酸、鳥氨酸-精氨酸、鳥氨酸-賴氨酸、鳥氨酸-鳥氨酸、鳥氨酸-P -丙氨酸、鳥氨酸-D-丙氨酸、鳥氨酸-L-高絲氨酸、鳥氨酸-D-纈氨酸、^ -丙氨酸-天冬酰胺、^ -丙氨酸-半胱氨酸、^ -丙氨酸-谷胺酰胺、^ -丙氨酸-甘氨酸、^ -丙氨酸-蘇氨酸、3 -丙氨酸-絲氨酸、(6-丙氨酸-丙氨酸、(6-丙氨酸-亮氨酸、(6-丙氨酸-異亮氨酸、3 -丙氨酸-甲硫氨酸、(6-丙氨酸-脯氨酸、(6-丙氨酸-纈氨酸、(6-丙氨酸-精氨酸、3 _丙氨酸_賴氨酸、丙氨酸_鳥氨酸、丙氨酸丙氨酸、丙氨酸_D_丙氨酸、P -丙氨酸-L-高絲氨酸、^ -丙氨酸-D-纈氨酸、D-丙氨酸-天冬酰胺、D-丙氨酸-半胱氨酸、D-丙氨酸-谷胺酰胺、D-丙氨酸-甘氨酸、D-丙氨酸-蘇氨酸、D-丙氨酸-絲氨酸、D-丙氨酸-丙氨酸、D-丙氨酸-亮氨酸、D-丙氨酸-異亮氨酸、D-丙氨酸-甲硫氨酸、D-丙氨酸_ 脯氨酸、D-丙氨酸-纟顏氨酸、D-丙氨酸-精氨酸、D-丙氨酸-賴氨酸、D-丙氨酸_鳥氨酸、D-丙氨酸-P -丙氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸、D-丙氨酸-L-聞絲氨酸、D-丙氨酸-D-纈氨酸、L-高絲氨酸-天冬酰胺、L-高絲氨酸-半胱氨酸、L-高絲氨酸-谷胺酰胺、L-高絲氨酸-甘氨酸、L-高絲氨酸-蘇氨酸、L-高絲氨酸-絲氨酸、L-高絲氨酸-丙氨酸、L-高絲氨酸-亮氨酸、L-高絲氨酸-異亮氨酸、L-高絲氨酸-甲硫氨酸、L-高絲氨酸-脯氨酸、L-高絲氨酸-纈氨酸、L-高絲氨酸-精氨酸、L-高絲氨酸-賴氨酸、L-高絲氨酸-鳥氨酸、L-高絲氨酸-P -丙氨酸、L-高絲氨酸-D-丙氨酸、L-高絲氨酸-L-高絲氨酸、L-高絲氨酸-D-纈氨酸、D-纈氨酸-天冬酰胺、D-纈氨酸-半胱氨酸、D-纈氨酸-谷胺酰胺、D-纈氨酸-甘氨酸、D-纈氨酸-蘇氨酸、D-纈氨酸-絲氨酸、D-纈氨酸-丙氨酸、D-纈氨酸-亮氨酸、D-纈氨酸-異亮氨酸、D-纈氨酸-甲硫氨酸、D-纈氨酸-脯氨酸、D-纈氨酸-纈氨酸、D-纈氨酸-精氨酸、D-纈氨酸-賴氨酸、D-纈氨酸-鳥氨酸、D-纈氨酸-P -丙氨酸、D-纈氨酸-D-丙氨酸、D-纈氨酸-L-高絲氨酸、D-纈氨酸-D-纈氨酸。與組合自2氨基羧酸的所述肽化合物類似，具有3-4個(gè)氨基羧酸的肽化合物也是可能的。
[0073]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽大概是甘氨酸-甘氨酸二聚體，并且優(yōu)選是甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三聚體和/或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸四聚體。
[0074]當(dāng)在本發(fā)明所述用于分離和/純化核酸的方法中使用所述試劑，按照一個(gè)實(shí)施方式在樣品材料與步驟(a.)中用于預(yù)處理的試劑的反應(yīng)混合物中時(shí)，包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合的總濃度是2.5mM-400mM,優(yōu)選12.5mM-280mM,特別優(yōu)選25mM-200mM。已證明這些濃度對(duì)于200 U 1-1000 U I大小的樣品材料與試劑的反應(yīng)混合物特別有利。在此，所述核酸的定量分離是可能的，即使本發(fā)明所述試劑與樣品材料的反應(yīng)混合物僅含有Ipg核酸數(shù)量級(jí)的少量核酸。達(dá)到了超過50%的回收率。按照本發(fā)明在步驟(a.)中使用的試劑優(yōu)選包括含氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合，其總濃度為5mM-500mM，優(yōu)選 25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM。
[0075]按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑還包括至少一種或多種下列組分:
[0076]-至少一種去污劑或去污劑的混合物，
[0077]-至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，和/或
[0078]-至少一種蛋白或蛋白的混合物。
[0079]如果所述試劑含有幾種組分或成分，這些組分或成分能夠以均勻試劑的形式添加，例如溶液，或者，所述試劑能通過混合兩種或多種制劑形成，例如這些制劑與樣品材料一起接觸或任選地互相分開接觸，以按照步驟(a.)預(yù)處理所述樣品材料。按照本發(fā)明，術(shù)語向樣品材料加入試劑包括單獨(dú)組分的分開加入。然而，優(yōu)選地，所述組分或成分以一種均勻試劑的形式加入。
[0080]在用于預(yù)處理的試劑中可能含有的去污劑或去污劑的混合物優(yōu)選選自非離子型表面活性劑并且特別優(yōu)選選自烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷組具體包括聚山梨酯組，優(yōu)選聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80,并且特別優(yōu)選聚山梨酯20 (吐溫20)。聚氧乙烯烷基苯基醚組優(yōu)選包括辛苯聚醇9 (曲通X-100)和諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40。步驟(a.)中存在去污劑或去污劑的混合物能夠?qū)︻A(yù)處理產(chǎn)生有益影響。因此，待純化核酸的回收率以及因此核酸分離的效率能夠優(yōu)選通過加入至少一種去污劑而增加，其也通過實(shí)施例明確證明。所述去污劑優(yōu)選是本發(fā)明所述試劑的組成部分；然而，如前述，其還能分別添加用于預(yù)處理所述樣品材料。優(yōu)選地，在所述試劑中，所述去污劑或去污劑的混合物尤其是一種或多種非離子型表面活性劑的總濃度是0.1% (v / v)-5% (v /v),優(yōu)選 0.2% (v / v)-4% (v / v),并且優(yōu)選 0.5% (v / v)-3% (v / v)并且也優(yōu)選 I %(v / v)-3% (v / v)。0.2% (v / v)-0.5% (v / v)尤其優(yōu)選用于聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100，并且1% (v / v)-5% (v / v)尤其優(yōu)選用于烷基葡糖苷，尤其是聚山梨酯，例如吐溫20。
[0081]按照一個(gè)實(shí)施方式，在樣品材料與本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中，所述試劑包含的去污劑或去污劑混合物尤其是一種或多種非離子型表面活性劑的總濃度是0.05%(V / v) -4% (v / v),優(yōu)選 0.1 % (v / v) -3 % (v / v)并且優(yōu)選 0.25% (v / v) -2.5 %(v / v)并且也優(yōu)選 0.5% (v / v) -2.5% (v / v)。優(yōu)選已證明 0.1% (v / v) -0.4% (v /v)的值對(duì)具體用于聚氧乙烯烷基苯基醚特別有利，例如曲通X-100。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述濃度優(yōu)選是0.5% (V / v) -4% (v / V)。此濃度尤其優(yōu)選用于聚山梨酯,例如吐溫20。已經(jīng)證明前述濃度對(duì)于2ooia-1oooia大小范圍的樣品材料與試劑的反應(yīng)混合物特別有利。因此，核酸的定量分離是可能的，即使所述反應(yīng)混合物僅僅含有ipg或更少的核酸。能達(dá)到超過50%和甚至75%以上的回收率，在很多情況下甚至高于85%。優(yōu)選地，用于樣品材料預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑含有至少兩種去污劑。按照一個(gè)實(shí)施方式，一種去污劑選自烷基葡糖苷組，優(yōu)選聚山梨酯，尤其優(yōu)選聚山梨酯20，并且另一種去污劑選自聚氧乙烯烷基苯基醚的組，優(yōu)選曲通X-100。
[0082]按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑含有一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物。如前述，所述試劑也能由幾種組合物組成，所述組合物首先組合或混合用于預(yù)處理，從而絡(luò)合劑也能在步驟(a.)中單獨(dú)加入用于預(yù)處理樣品材料。然而，優(yōu)選地，所述絡(luò)合劑是均勻試劑的組成部分，例如用于所述樣品材料預(yù)處理的溶液。所述絡(luò)合劑優(yōu)選選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)。特別優(yōu)選使用EDTA。
[0083]按照一個(gè)實(shí)施方式，所述試劑中絡(luò)合劑的總濃度是10mM-500mM，優(yōu)選10mM-300mM, 10mM-200mM并且更優(yōu)選10mM-100mM。按照一個(gè)實(shí)施方式，對(duì)于包括在試劑中的絡(luò)合物，樣品和本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中的總濃度是5mM-400mM，優(yōu)選5mM-80mM。如果本發(fā)明所述試劑與樣品材料的反應(yīng)混合物具有200 iU-lOOOia的尺寸并且僅含有Ipg的核酸，這些濃度顯示在按照本發(fā)明的方法中特別有利。因此，達(dá)到了超過75%并且有時(shí)甚至在85%以上的回收率。
[0084]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑含有化合物三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，但不含有EDTA和/或EGTA。
[0085]按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑含有至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白或球狀蛋白的混合物。如前述，所述試劑也能由幾種組合物組成，所述組合物首先組合或混合用于預(yù)處理，從而所述蛋白也能在步驟(a.)中單獨(dú)加入用于預(yù)處理樣品材料。然而，優(yōu)選`地，所述蛋白是均勻試劑的組成部分，例如用于所述樣品材料預(yù)處理的溶液。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述蛋白沒有任何酶活性。優(yōu)選地，該蛋白不是酶。球狀蛋白優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白。所述白蛋白選自動(dòng)物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。所述球蛋白選自動(dòng)物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白，優(yōu)選它們是免疫球蛋白，如優(yōu)選使用Y-球蛋白。令人驚訝的是，如果用于預(yù)處理樣品材料的步驟(a.)所用試劑含有相應(yīng)的蛋白，其顯示有利。因此，再次可提高核酸純化的效率，尤其是當(dāng)樣品材料僅含有低蛋白濃度時(shí)。因此相應(yīng)蛋白在步驟(a.)所用試劑中的應(yīng)用改善了核酸純化，尤其是當(dāng)待處理樣品材料僅包含少量的蛋白和/或在蛋白濃度方面顯不差異時(shí)。
[0086]按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，步驟(a.)所用試劑中一種或多種蛋白的總濃度是 Img / mL-100mg / mL,優(yōu)選 2mg / mL_25mg / mL, 2mg / ml-10mg / ml 并且還更優(yōu)選 4mg / ml-10mg / ml。2mg / mL_25mg / mL、2mg / ml-10mg / ml 和優(yōu)選 4mg /ml-10mg / ml的濃度特別適于球狀蛋白，特別是例如IgG和BSA。
[0087]按照一個(gè)實(shí)施方式，就包含于試劑中的一種或多種蛋白而言，在樣品和本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中的總濃度是0.5mg / mL-80mg / mL、lmg / mL-20mg / mL,優(yōu)選Img / mL-8mg / mL,優(yōu)選2mg / mL-8mg / mL。如果本發(fā)明所述試劑與樣品材料的反應(yīng)混合物具有2ooia-1oooia的尺寸，這些濃度顯示在按照本發(fā)明的方法中特別有利。因此，核酸的定量分離是可能的，即使所述反應(yīng)混合物僅僅含有ipg或更少的核酸。在這種情況下，達(dá)到了超過75%有時(shí)甚至在85%以上的回收率。所述蛋白的濃度特別適于球狀蛋白，尤其是例如IgG和BSA。
[0088]按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑不含總濃度≥5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽，其中尤其不含游離的磷酸鹽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，尤其是過量的磷酸鹽濃度可對(duì)核酸分離和/或純化產(chǎn)生抑制效果，特別是從生物處理樣品中純化核酸時(shí)。
[0089]按照一個(gè)實(shí)施方式，所述試劑包括至少一個(gè)或多個(gè)含有氨基的化合物，所述氨基選自以下1-viii組中的一種或多種:
[0090]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0091]i1.丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0092]ii1.精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0093]iv.P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0094]V.聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0095]v1.甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體、甘氨酸四聚體和二肽(Ala-Glu)，
[0096]vi1.N-(三(羥基 甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N- 二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0097]和/ 或
[0098]vii1.三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
[0099]下面描述了所述試劑的特別優(yōu)選的實(shí)施方式。在這些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑的單獨(dú)組分優(yōu)選以上面就單獨(dú)組成部分描述的濃度存在，在此方面參考上述公開內(nèi)容。如所述，還能夠在樣品材料的預(yù)處理期間分開加入所述試劑的單獨(dú)組分，然而，其中優(yōu)選以均勻試劑形式加入，例如溶液。
[0100]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少甘氨酸、Gly-Gly,N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸作為含氨基的化合物、至少一種絡(luò)合劑(優(yōu)選EDTA)以及至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，例如優(yōu)選吐溫20。特別優(yōu)選地，所述試劑還包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0101]按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的本發(fā)明所述試劑包括一個(gè)或多個(gè)選自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的極性-中性和/或堿性a-氨基羧酸。因此，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示用相應(yīng)的試劑預(yù)處理還能夠改善分離和/或純化，尤其是當(dāng)這個(gè)/這些a -氨基羧酸與緩沖液組合時(shí)，具體例如Tris或磺酸緩沖液，如HEPES或HEPPS緩沖液。另外，所述試劑優(yōu)選包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0102]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-賴氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如諾乃洗滌劑-P40和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。更優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白，優(yōu)選IgG和一種或多種緩沖液，優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或 HEPPS。
[0103]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少一種、優(yōu)選兩種以下氨基羧酸化合物即(6-丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯,優(yōu)選例如聚山梨酯40。優(yōu)選地,所述試劑也包括球狀蛋白和一種或多種緩沖液，所述球狀蛋白優(yōu)選IgG，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和 / 或 HEPPS。
[0104]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽和三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)。此外，該試劑優(yōu)選包括球狀蛋白，尤其是IgG。
[0105]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即絲氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、D-纈氨酸和聚-L-鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或 聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白，優(yōu)選 BSA。
[0106]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDDSJP至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。優(yōu)選地，所述試劑還包括蛋白和優(yōu)選一種或多種緩沖液，所述蛋白優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0107]本發(fā)明所述用于分離和/或純化核酸的方法的特征是通過連續(xù)幾個(gè)步驟，從提供的樣品材料到任選的、優(yōu)選至少一部分經(jīng)分離核酸的定量檢測(cè)。單獨(dú)的步驟和優(yōu)選的實(shí)施方式如下文詳細(xì)解釋。所述實(shí)施方式也能夠互相組合。
[0108]在所述方法的一個(gè)基本實(shí)施方式中，步驟(a)中出現(xiàn)按照本發(fā)明制備樣品材料用于分離/純化樣品材料中含有的核酸。這通過向樣品材料加入特定試劑來實(shí)現(xiàn)，其已經(jīng)在前文中詳細(xì)描述。如果所述試劑包括幾種組分，從構(gòu)建模塊系統(tǒng)的意義上說，這些組分也能夠互相分開加入，用于使用本發(fā)明所述試劑預(yù)處理步驟(a.)中的樣品材料。然而，優(yōu)選地，所述組分以均勻試劑如溶液的形式加入。在任選的混合步驟(b.)之后是核酸的實(shí)際分離和/或純化(步驟c.)，然后是任選地，至少一部分經(jīng)分離核酸的檢測(cè)(步驟d.)。
[0109]按照本發(fā)明的方法能夠具有下列一種或多種特征:
[0110]按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中向樣品材料加入的本發(fā)明所述試劑不含離液劑。按照一個(gè)實(shí)施方式，術(shù)語“離液劑”指離液化合物以及因此對(duì)于蛋白具有變性效果的化合物，并且其特定破壞基于氫鍵形成的液態(tài)水常規(guī)結(jié)構(gòu)。具體地，術(shù)語“離液劑”是指離液鹽，尤其是例如鈉鹽或胍鹽，優(yōu)選選自:碘化鈉、高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍和/或其兩種或更多種鹽的混合物。不含離液劑的這個(gè)實(shí)施方式是有利的，因?yàn)闇y(cè)試已經(jīng)顯示用于預(yù)處理的步驟(a)所用試劑中的離液化合物尤其在較高濃度下能對(duì)后續(xù)核酸純化產(chǎn)生不利影響，所述離液化合物具體例如離液鹽，。因此在步驟(a.)中用于預(yù)處理的試劑優(yōu)選不含一定濃度的離液鹽，該濃度會(huì)干擾后續(xù)的核酸分離，并且尤其是使得本發(fā)明所述預(yù)處理效果更差的濃度。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述方法的步驟(a.)中使用的試劑完全不含任何離液劑或在步驟(a.)中完全不添加離液劑。
[0111]按照第二個(gè)實(shí)施方式，如果在步驟(c.)中加入至少一種含有離液劑的試劑，含有離液劑的試劑是在具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇不存在的情況下第一次加入步驟(C)中。能夠在步驟(c.)中加入含有離液劑的試劑，例如用于消化預(yù)處理的樣品材料。然而，在步驟(c.)中第一次加入含有離液劑的試劑之后，按照此實(shí)施方式這在沒有支鏈或直鏈醇的情況下發(fā)生，隨后具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇能再次使用，例如用于調(diào)節(jié)結(jié)合條件和/或在任選的洗滌步驟中使用。這些后續(xù)的步驟能夠另外在有或沒有離液化合物的情況下發(fā)生。
[0112]按照第三個(gè)實(shí)施方式，在核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之前，在步驟(c.)中將至少一種裂解劑加入已經(jīng)按照步驟(a.)預(yù)處理的樣品材料。能用于這個(gè)目的的經(jīng)典裂解劑是例如酶，尤其是蛋白水解酶，優(yōu)選蛋白酶例如蛋白酶K，和含有離液化合物優(yōu)選例如離液鹽和/或去污劑，優(yōu)選非離子型去污劑的裂解劑。從而，發(fā)生按照步驟(a.)預(yù)處理的樣品材料的消化。按照一個(gè)實(shí)施方式，在核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之前，按照步驟(a.)預(yù)處理的樣品材料在步驟(c.)中與至少一種蛋白水解酶和至少另一種裂解劑接觸并且孵育，該裂解劑優(yōu)選含有離液鹽。按照一個(gè)實(shí)施方式，孵育步驟的持續(xù)時(shí)間是至少3分鐘，優(yōu)選至少5分鐘，優(yōu)選至少10分鐘，特別優(yōu)選至少15分鐘，并且優(yōu)選在使用的蛋白水解酶活動(dòng)增加的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C下進(jìn)行所述孵育步驟。優(yōu)選地，在35°C -70°C，優(yōu)選40°C -65°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行所述孵育。特別優(yōu)選地，使用蛋白水解酶和含有離液劑的裂解劑的組合。此消化步驟的細(xì)節(jié)也在下文中解釋。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，下列孵育中加入至少一種醇和/或至少一種離液劑用于調(diào)節(jié)結(jié)合條件。此實(shí)施方式在下文中更詳細(xì)解釋(具體參見部分步驟c.1)和c.2))。
[0113]按照第四個(gè)實(shí)施方 式，在步驟(a.)中用于樣品材料預(yù)處理的試劑沒有任何裂解性質(zhì)并且因此不能裂解所述樣品材料。
[0114]如所述，上述實(shí)施方式也能夠互相組合。
[0115]按照本發(fā)明，步驟(a.)中樣品材料的制備能夠以多種方式發(fā)生，例如，通過向提供的樣品材料加入本發(fā)明所述試劑或以相反的順序，通過向提供的試劑加入樣品材料。在步驟(a.)中試劑和樣品材料優(yōu)選以下列比例一起加入:1+4(V至4+1 (Vwfl^V樣品材料 )，優(yōu)選 1+2 (Vwflj+V

樣品材料 )至2+1 (V試劑+V

樣品材料 )并且特別優(yōu)選1+1 (V試劑+V
樣品材料)。
應(yīng)優(yōu)選進(jìn)行后續(xù)的混合步驟(b.)。
[0116]本發(fā)明所述步驟(a.)中的預(yù)處理以及任選的步驟(b.)之后是分離和/或純化的步驟(c.)。任選地，本發(fā)明所述試劑和從步驟(a.)或步驟(a.)及步驟(b.)得到的樣品材料的組合物在步驟(c.)之前能夠進(jìn)一步加工和/或處理，例如通過加入另外的制劑或通過分離單獨(dú)組分。為簡(jiǎn)明起見，從相應(yīng)的中間步驟得到的組合物也能在本申請(qǐng)內(nèi)容中表示為本發(fā)明所述試劑和從步驟(a.)或步驟(a.)及步驟(b.)得到的樣品材料的組合物。
[0117]取決于實(shí)施方式的步驟(c.)能夠具有幾個(gè)子步驟，基本上與任意類型的用于分離核酸的方法一起發(fā)揮功能。按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(c.)中核酸的分離和/或純化包括至少一個(gè)下列子步驟C.1)和C.2)，優(yōu)選包括這兩個(gè)子步驟:
[0118]c.1)本發(fā)明所述試劑與從步驟(a.)或步驟(a.)和步驟(b.)得到的樣品材料的組合物的消化。該消化特別用于樣品材料中可能存在的任意蛋白和可能存在的任意其他污染樣品組分的變性和/或降解。此外，取決于樣品材料，這個(gè)步驟也用于從例如絡(luò)合物質(zhì)中釋放樣品材料中所含核酸的目的。在這個(gè)消化步驟C.1)中，可使用經(jīng)典裂解劑，例如蛋白水解酶，尤其是蛋白酶，優(yōu)選例如蛋白酶K和含有至少一種離液化合物優(yōu)選例如離液鹽和/或至少一種去污劑優(yōu)選非離子型去污劑的的裂解劑。合適裂解劑的優(yōu)選實(shí)施方式也如下所述(參見例如下述步驟(c.)的優(yōu)選實(shí)施方式的子步驟ii中使用的制劑)。例如，能夠優(yōu)選用于步驟c.1)的其他裂解劑也在W02009 / 144182中描述，其通過引用納入。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，使用至少一種蛋白水解酶和至少一種額外裂解劑進(jìn)行步驟c.1)中的消化，所述裂解劑包括至少一種離液化合物和/或至少一種去污劑，優(yōu)選至少一種非離子型去污劑。對(duì)于消化步驟，按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟c.1)中，按照步驟(a.)預(yù)處理的樣品材料與至少一種蛋白水解酶和至少一種額外裂解劑接觸并且孵育，所述裂解劑優(yōu)選含有至少一種離液化合物。孵育步驟的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選至少3分鐘，優(yōu)選至少5分鐘且特別優(yōu)選至少10分鐘，并優(yōu)選在蛋白水解酶活性提高的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，在至少30°C，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C下進(jìn)行所述孵育步驟。優(yōu)選地，在35°C -70°C,優(yōu)選40°C _65°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行所述孵育。特別優(yōu)選地，使用蛋白水解酶和含有離液劑的裂解劑的組合。
[0119]c.2)優(yōu)選通過結(jié)合到運(yùn)載體材料來分離核酸。核酸結(jié)合運(yùn)載體材料優(yōu)選是核酸結(jié)合固相，其能夠例如選自含有二氧化硅的材料、硅膠、二氧化硅、玻璃、沸石、氧化鋁、二氧化鈦、二氧化鋯、高嶺土、陶瓷、聚合運(yùn)載體材料例如聚亞烷基(polyalkylene)，例如PE、PP或PE / PP和聚苯乙烯珠。最終，起決定性作用的是所述運(yùn)載體材料能夠在選定結(jié)合條件下結(jié)合到核酸上。能夠用官能團(tuán)例如陰離子交換基團(tuán)修飾所述運(yùn)載體材料，或者其能是未修飾的并且因此在表面不含額外的官能團(tuán)。其他合適的運(yùn)載體材料也如下描述。按照一個(gè)實(shí)施方式，能夠通過步驟c.1)中使用的裂解劑調(diào)節(jié)或預(yù)定義結(jié)合條件，例如如果后者包括合適濃度的離液化合物。相應(yīng)的 結(jié)合步驟在現(xiàn)有技術(shù)中描述，例如US5，234，809。然而，優(yōu)選地，為了調(diào)節(jié)結(jié)合條件，加入結(jié)合劑，其包括至少一種醇，優(yōu)選具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇，尤其優(yōu)選異丙醇。所述結(jié)合劑還能夠包括至少一種離液化合物，優(yōu)選離液鹽和/或至少一種去污劑。所述去污劑優(yōu)選是非離子型去污劑。優(yōu)選實(shí)施方式也如下描述(參見例如下述步驟(c.)的優(yōu)選實(shí)施方式的子步驟iv中使用的制劑)。能用于步驟c.2)的其他結(jié)合劑描述于例如W02009 / 144182，其通過引用納入。核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之后優(yōu)選是從剩余樣品中分離核酸。如果使用磁性二氧化硅顆粒，這通常在磁場(chǎng)協(xié)助下一般通過從剩余樣品中分離結(jié)合到所述運(yùn)載體材料的核酸來發(fā)生。任選地，所述核酸隨后能進(jìn)行洗滌和洗脫。
[0120]按照一個(gè)特別合適的實(shí)施方式，步驟(c.)中核酸的分離和/或純化包括下列子步驟:
[0121]1.任選地，優(yōu)選在沒有支鏈或直鏈烷醇的情況下，通過向樣品材料和試劑的組合物(其任選混合)加入一種或多種酶，優(yōu)選蛋白水解酶如蛋白酶K，任選與含有離液劑的試劑組合來降解蛋白和/或污染樣品組分。
[0122]i1.加入制劑，所述制劑包括至少一種離液化合物和/或至少一種選自非離子型去污劑的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，優(yōu)選用于調(diào)節(jié)或預(yù)定義用于核酸結(jié)合的結(jié)合條件。
[0123]ii1.優(yōu)選在按照i加入的酶活性提高的溫度下，優(yōu)選35°C以上的溫度(蛋白水解酶的合適溫度也如上述)，任選混合和/或孵育。
[0124]iv.加入制劑，所述制劑包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇，和任選地額外離液化合物和/或任選地選自非離子型去污劑的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括一個(gè)具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并包括一個(gè)含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，以調(diào)節(jié)用于結(jié)合核酸的結(jié)合條件。
[0125]V.核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料上，優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維、聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述運(yùn)載體材料以顆粒形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)或膜使用，優(yōu)選作為柱填充材料，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，優(yōu)選磁性顆粒，并且優(yōu)選作為磁性珠；其他合適的運(yùn)載體材料的實(shí)施方式如上述或下述。
[0126]v1.任選地，用一種或多種制劑洗滌結(jié)合的核酸，所述制劑作用作洗滌劑，優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，和此外任選的離液化合物，和/或任選來自非離子型表面活性劑的去污劑。
[0127]vi1.任選用一種或多種制劑洗脫，其用作洗脫劑，優(yōu)選包括在緩沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑。
[0128]如果樣品材料和本發(fā)明所述試劑的組合物含有蛋白和/或污染樣品組分，其可能干擾后續(xù)的核酸分離和/或純化，則任選地，在步驟i中能夠發(fā)生蛋白和/或其他樣品污染組分的降解(指代下文的裂解，無論樣品材料是否含有細(xì)胞)。樣品材料和本發(fā)明所述試劑的組合物能夠混合或不混合即用于該步驟，其中例如通過加入一種或多種酶，例如蛋白水解酶如裂解酶和/或蛋白酶，并且優(yōu)選蛋白酶K進(jìn)行所述降解。任選地，通過向反應(yīng)混合物加入變性化合物例如離液劑可促進(jìn)所述降解，其中在所得裂解反應(yīng)混合物中優(yōu)選沒有支鏈或直鏈烷醇。通常，這也造成`樣品的進(jìn)一步消化。因此優(yōu)選實(shí)施步驟i。
[0129]在步驟ii中向樣品材料和本發(fā)明所述試劑的裂解反應(yīng)混合物的組合物，或樣品材料、本發(fā)明所述試劑和蛋白降解酶的裂解反應(yīng)混合物的組合物，或樣品材料、本發(fā)明所述試劑、蛋白降解酶和含有離液劑的試劑的裂解反應(yīng)混合物的組合物中加入優(yōu)選用作調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義用于結(jié)合核酸與運(yùn)載體材料的結(jié)合條件的制劑。該制劑包括至少一種離液化合物和/或至少一種選自非離子型去污劑的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚的組。該組的分子包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，以及含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分。所述制劑能夠優(yōu)選用作所有組分的優(yōu)選混合物，或能夠以任意順序或任意組合的預(yù)先混合形式連續(xù)加入單獨(dú)組分。所述制劑通常也支持蛋白的降解和/或樣品的進(jìn)一步消化。相應(yīng)的裂解劑通常能夠優(yōu)選在本發(fā)明所述方法的范圍內(nèi)用作裂解劑(例如，在上述子步驟c.1)中)。
[0130]也能夠通過以可變的順序一起加入單獨(dú)組分或通過加入兩種或多種組分的混合物，得到所述樣品材料、本發(fā)明所述試劑的組合物、蛋白水解酶和任選地離液劑以及包括用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或至少一種去污劑的制劑:
[0131]a)向樣品材料與本發(fā)明所述試劑的混合或未混合的組合物中加入1.)蛋白水解酶，2.)制劑(優(yōu)選按照ii)，其包括優(yōu)選用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑，[0132]b)向樣品材料與本發(fā)明所述試劑的混合或未混合的組合物中加入1.)蛋白水解酶，2.)離液劑，3.)制劑(優(yōu)選按照ii)，其包括優(yōu)選用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑，
[0133]c)向樣品材料與本發(fā)明所述試劑的混合或未混合的組合物中加入1.)離液劑，
2.)蛋白水解酶，3.)制劑(優(yōu)選按照ii)，其包括優(yōu)選用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑，
[0134]d)向樣品材料與本發(fā)明所述試劑的混合或未混合的組合物中加入1.)蛋白水解酶和離液劑的混合物，2.)制劑(優(yōu)選按照ii)，其包括優(yōu)選用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑，和/或
[0135]e)向樣品材料與本發(fā)明所述試劑的混合或未混合的組合物中加入蛋白水解酶、任選離液劑和制劑(優(yōu)選按照ii)的混合物，其包括優(yōu)選用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑。
[0136]如前所解釋，單獨(dú)組分的共同加入能夠以兩種方式發(fā)生:樣品材料和本發(fā)明所述試劑的組合物能如下加入:1.加入用于分離和/或純化(例如按照步驟i和ii)的試劑或
2.通過加入可得到這些試劑。樣品材料和本發(fā)明所述試劑的組合物也包括額外的組分，例如其在步驟(a.)中的預(yù)處理之后但在步驟(c.)的分離之前加入。
[0137]加入單獨(dú)制劑之后任選是混合或孵育(例如按照步驟iii)。
[0138]按照一個(gè)實(shí)施方式，為了調(diào)節(jié)結(jié)合條件，向從樣品材料中得到的組合物、本發(fā)明所述試劑、任選的蛋白水解酶、任選的離液裂解劑和包括用于調(diào)節(jié)和/或預(yù)定義結(jié)合條件的離液化合物和/或去污劑，但優(yōu)選不含支鏈或直鏈烷醇的制劑中加入按照步驟iv的另一種制劑。前述制劑是含有烷醇的并且用作調(diào)節(jié)用于結(jié)合核酸與運(yùn)載體材料的結(jié)合條件。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述制劑包括至`少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇，以及還任選包括離液化合物和/或任選來自非離子型去污劑的去污劑。所述非離子型去污劑優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分。例如，能夠通過兩種不同的方式向優(yōu)選不含支鏈或直鏈烷醇的所述組合物加入含有烷醇的制劑:a)向制備的反應(yīng)混合物中加入含有烷醇的制劑，b)向制備的含有烷醇的制劑加入反應(yīng)混合物。含有烷醇的相應(yīng)制劑通常能夠優(yōu)選在本發(fā)明所述方法的范圍內(nèi)用于調(diào)節(jié)結(jié)合條件(例如，在上述子步驟c.2)中)。
[0139]優(yōu)選在此之后，在下一個(gè)步驟中，通過結(jié)合到運(yùn)載體材料上來調(diào)節(jié)結(jié)合條件，所述材料優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維、聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE。能用于本發(fā)明所述方法的其他合適運(yùn)載體材料也已經(jīng)如上所述。所述運(yùn)載體材料能夠以顆粒的形式，作為非織造織物、作為纖維、作為凝膠基質(zhì)、作為膜和優(yōu)選作為柱填充材料使用。所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，并且從而優(yōu)選作為磁性顆粒，優(yōu)選作為磁性珠。特別優(yōu)選地，使用二氧化硅材料。然后優(yōu)選使用具有二氧化硅或玻璃表面的磁性顆粒。這些本質(zhì)上能是珠狀或球形的并且優(yōu)選具有0.02-30 u m,優(yōu)選0.05-15 u m并且特別優(yōu)選0.1-10 y m范圍內(nèi)的粒度。優(yōu)選用于本發(fā)明所述方法的磁性二氧化硅顆粒描述于例如國際專利申請(qǐng)WOOl / 71732，其在此通過引用全文納入。磁性二氧化硅顆粒優(yōu)選使本發(fā)明所述方法易于自動(dòng)化。例如能夠以兩種不同的方式實(shí)現(xiàn)向制備用于結(jié)合的反應(yīng)混合物加入運(yùn)載體材料:a)向制備的反應(yīng)混合物中加入運(yùn)載體材料，b)向制備的運(yùn)載體材料加入反應(yīng)混合物。[0140]在來自樣品材料的核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之后，任選用一種或多種制劑在一個(gè)或多個(gè)步驟中洗滌已結(jié)合的核酸(例如按照步驟vi)，所述制劑用作洗滌劑。優(yōu)選地，這些制劑包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，以及還任選包括離液化合物和/或任選來自非離子型表面活性劑的去污劑。
[0141]任選地，在這之后(例如在步驟vii中)是洗脫已結(jié)合核酸和任選用一種或多種用作洗脫劑的制劑洗滌的核酸。洗脫劑在現(xiàn)有技術(shù)中熟知。優(yōu)選地，它們包括至少一種在緩沖環(huán)境中的絡(luò)合劑。對(duì)于一些方法，例如一些基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，其即使在核酸與運(yùn)載體材料結(jié)合的情況下也能檢測(cè)核酸，在這種情況下能夠省略用洗脫劑的洗脫。
[0142]上述特別優(yōu)選的步驟(c.)的實(shí)施方式-分離和/或純化，是基于核酸與運(yùn)載體材料的結(jié)合。也能夠使用與該方法不同的核酸分離和/或純化方法，例如也包括其中污染物結(jié)合到運(yùn)載體材料的方法和基于核酸沉淀的核酸分離方法。
[0143]本發(fā)明所述用于核酸分離和/或純化的方法包括一個(gè)任選步驟用于至少一部分經(jīng)分離核酸的定量和/或定性檢測(cè)，如最后的步驟(d.)。對(duì)于檢測(cè)，通常足以檢測(cè)經(jīng)分離核酸的合適核酸片段。優(yōu)選通過特定待檢測(cè)核酸片段的核酸擴(kuò)增方法作為定量檢測(cè)完成該步驟。相應(yīng)的檢測(cè)方法在現(xiàn)有技術(shù)中熟知并且不需要額外的解釋。
[0144]按照一個(gè)實(shí)施方式，檢測(cè)了至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸，其中優(yōu)選進(jìn)行定量檢測(cè)。按照此實(shí)施方式，本發(fā)明所述方法宜具有如下LOD(檢測(cè)限):lpg，優(yōu)選0.lpg，特別優(yōu)選0.01pg的樣品中靶標(biāo)核酸，從所述樣品中檢測(cè)靶標(biāo)核酸。
[0145]由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，從非常不同的樣品材料中高效、有效和可靠地分離甚至如此少量的核酸，并且因此允許定量確定所研究樣品中的靶標(biāo)核酸量是可能的。當(dāng)然，所述樣品也能含有量大得多的靶標(biāo)核酸。本發(fā)明所述方法的檢測(cè)下限的優(yōu)點(diǎn)具體是能夠檢測(cè)到甚至如此小的量并且因此能確保所述方法得到在Pg范圍(或更高)內(nèi)的可靠結(jié)果，即使樣品材料差異顯著。
[0146]在經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的后續(xù)檢測(cè)中，所分離靶標(biāo)核酸的回收率優(yōu)選是至少50%，優(yōu)選至少75 %，尤其優(yōu)選至少85 %。
[0147]按照本發(fā)明，除了上述的基本步驟(a.)_(d.)，也可能在上述步驟(a.)_(d.)之前或之后實(shí)施額外的步驟(并且例如在已經(jīng)描述的步驟(c.)部分步驟之前或之后)。按照一個(gè)實(shí)施方式，能夠在按照本發(fā)明的方法中額外完成后續(xù)方法步驟中的至少一個(gè)。如果待分離樣品材料的核酸封閉在細(xì)胞中，通常需要從細(xì)胞裂解開始作為第一步驟，用于釋放核酸并且因此能在步驟(a.)中使用本發(fā)明所述試劑進(jìn)行有效預(yù)處理。能夠通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法進(jìn)行細(xì)胞裂解。一般的方法考慮向樣品材料中加入含有離液劑的水性制劑和/或蛋白裂解酶，以用于細(xì)胞污染物的降解。然而，也能夠使用其他方法以從細(xì)胞中釋放核酸，包括機(jī)械方法。按照一個(gè)實(shí)施方式，由此完成樣品材料中所含細(xì)胞的裂解。在此，優(yōu)選在向樣品材料加入本發(fā)明所述試劑之前并且因此在步驟(a.)之前進(jìn)行所述裂解。
[0148]在細(xì)胞裂解之后，在步驟(a.)中向包括釋放核酸的相應(yīng)預(yù)處理樣品材料加入本發(fā)明所述試劑之前，能夠?qū)嵤┮粋€(gè)或多個(gè)后續(xù)的純化步驟，特定用于去除細(xì)胞碎片。例如，能夠通過過濾進(jìn)行細(xì)胞片段的粗分離。按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中向樣品材料加入本發(fā)明所述試劑之前，樣品材料不含細(xì)胞片段和/或一個(gè)或多個(gè)連續(xù)步驟中樣品材料的分子和/或離子組分。[0149]向樣品材料加入本發(fā)明所述試劑后，優(yōu)選進(jìn)行孵育步驟，以確保所述試劑對(duì)于樣品材料的適當(dāng)影響。優(yōu)選地，在孵育之前混合所述試劑與樣品材料。
[0150]本發(fā)明所述方法的一個(gè)具體應(yīng)用是從產(chǎn)品，尤其是生物藥物的生物技術(shù)生產(chǎn)過程得到的樣品材料中純化核酸。如開始所述，生物技術(shù)產(chǎn)品具體例如生物藥物的純化需要例如一個(gè)或者多個(gè)連續(xù)的純化步驟，其通常是色譜步驟，通過這些步驟分離了例如細(xì)胞片段、分子和/或離子組分和其他污染物，以得到盡可能純的生物藥物。特別重要的是顯著減少宿主生物的殘留污染物和/或其他污染物，例如為了符合醫(yī)藥產(chǎn)品的規(guī)定。出于這個(gè)原因，分析在純化過程中得到的生物處理樣品，尤其是最終純化的生物藥物，例如宿主細(xì)胞的污染核酸，該宿主細(xì)胞用于生物藥物的生產(chǎn)。成功純化的評(píng)價(jià)需要定量檢測(cè)可能仍含有的核酸污染物，例如宿主細(xì)胞核酸的殘留量。本發(fā)明所述方法能夠例如有效和可靠純化宿主核酸或其他核酸污染物，即使這些核酸必須從非常不同的生物處理樣品中分離，具體例如來自用于生物技術(shù)產(chǎn)品的純化過程中得到的各種純化部分，和/或這些核酸在樣品材料中僅以少量存在。按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，在完成本發(fā)明所述后續(xù)步驟(b.)(任選的)、(c.)和(d.)(任選的)之前，在步驟(a.)中向純化部分加入本發(fā)明所述試劑。純化部分也能包括最終的、純化的終產(chǎn)品。
[0151]按照本發(fā)明的方法能夠從各種樣品材料分離核酸，尤其例如DNA和RNA，其中所述核酸特定以少量存在。在上述說明書中提及合適的樣品材料，并且在下文中詳述實(shí)施例。按照本發(fā)明，已經(jīng)加工的樣品材料也能夠用作樣品材料，例如已經(jīng)以一些其他方式裂解、過濾和/或預(yù)處理的樣品材料，尤其是純化前的樣品，其中待純化核酸優(yōu)選不包封在細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明所述方法的步驟(a.)中用特定試劑預(yù)處理這些加工的樣品材料，從而如前解釋，顯著改善了后續(xù)的核酸分離和/或純化，尤其是在不同樣品材料的情況中。
[0152]包括大多數(shù)情況下在樣品材料中少量存在的待分離核酸的優(yōu)選樣品材料具體包括下組:
[0153]第一組的合適樣品材料包括具有水性組合物的樣品材料并且優(yōu)選是來自純化過程的純化部分。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述純化部分是水性樣品材料，除了待純化核酸以外其還包括一種或多種緩沖物質(zhì)和/或鹽。在純化部分中經(jīng)常含有的緩沖劑示例是乙酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液。在純化緩沖液中通常使用的生物緩沖劑是ACES、ADA、BES、BICINE、BIS-TRIS、CHES、檸檬酸鹽、甘氨酸、Gly-Gly、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、磷酸鹽、TAPS、TES、TRICINE 和 TRIS。尤其在純化部分中出現(xiàn)的常見鹽是堿金屬和堿土金屬的金屬離子以及銨作為陽離子的氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽，以及任選Zn、Cu、N1、Fe鹽(如果IMAC如N1-NTA用作純化步驟)。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述樣品材料是色譜洗脫液，其任選也以進(jìn)一步加工的形式提供。優(yōu)選地，所述樣品材料是在生物技術(shù)產(chǎn)品具體例如生物藥物的純化過程中得到的純化部分。因此，樣品材料能夠含有例如生物分子和/或生物體，其中在本申請(qǐng)的意義上，生物分子指活生物體中出現(xiàn)的分子。在樣品材料中含有的生物分子和/或生物體能夠具有至少一種下列性質(zhì):
[0154]1.所述生物分子和/或生物體選自肽、多肽、蛋白、核酸、病毒和/或疫苗。所述核酸優(yōu)選是DNA、RNA、質(zhì)粒和非編碼小RNA，尤其是例如小干擾RNA(siRNA)，
[0155]i1.所述生物分子和/或生物體是藥學(xué)上活性物質(zhì)，[0156]ii1.所述生物分子是合成或生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的，和/或
[0157]iv.所述生物分子和/或生物體是生物藥物。
[0158]這組樣品材料尤其包括在藥物和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中出現(xiàn)的樣品材料。該組特定包括生物處理樣品，具體例如在生產(chǎn)過程中得到的生物技術(shù)產(chǎn)品和樣品材料，尤其是在生物技術(shù)產(chǎn)品的純化過程中得到的純化部分。典型示例是從柱-色譜純化過程中得到的純化部分。相應(yīng)的生物處理樣品特定出現(xiàn)在產(chǎn)品尤其例如生物藥物的生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)中。對(duì)作為診斷助劑或治療藥劑的生物藥物是特別感興趣的，具體例如治療性肽、寡肽、多肽和蛋白，尤其是重組產(chǎn)生的生長因子、激素、細(xì)胞因子和治療性抗體，這僅僅列舉了生物藥物的一些典型示例。然而，按照一個(gè)實(shí)施方式，所述生物藥物也包括病毒、疫苗和核酸，如DNA、RNA和質(zhì)粒。在前序部分中也提及了其他示例，并且在此通過引用納入相應(yīng)的公開文件。
[0159]由于所述生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)過程，生物處理樣品通常含有兩種生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品，例如生物藥物以及所用培養(yǎng)基和/或宿主生物各自宿主細(xì)胞的污染物，如待分離的宿主核酸等。此外，生物處理樣品也可能由其他核酸污染，例如病毒核酸。例如，通常在純化過程中采用特定措施以降低在生物產(chǎn)品中病毒核酸的比例。在純化工藝的過程中，通常生物處理樣品中生物技術(shù)產(chǎn)品的純度增加，并且在純化工藝中追求的目標(biāo)之一是使污染核酸的量減少至最低。用于生物藥物的剩余宿主核酸和或其他核酸污染物例如病毒核酸代表純化終產(chǎn)物中的潛在危險(xiǎn)污染物，并且因此優(yōu)選在純化的終產(chǎn)物和/或在一個(gè)或多個(gè)純化過程所得生物處理樣品中得到定量檢測(cè)，例如為了能夠向管理當(dāng)局證明沒有超過污染核酸的最大允許限度或最大推薦限度?；谄涮囟`敏度、可靠性和實(shí)施簡(jiǎn)易性，本發(fā)明所述方法是特別適合此目的的核酸分離方法。
[0160]另外，該組也包括在化學(xué)合成領(lǐng)域中得到的樣品材料，例如含有SiRNA分子的樣品，其在合成之后經(jīng)過例如色譜純化過程，并且可以設(shè)想其通過本發(fā)明所述方法的后續(xù)定量和濃縮。
[0161]按照一個(gè)實(shí)施方式，樣品材料尤其是例如生物處理樣品，基本不含細(xì)胞。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述樣品材料不是在核酸擴(kuò)增過程中得到的樣品，特定例如PCR過程。
[0162]第二組包括少量待分離和/或純化核酸的合適樣品材料包括人或動(dòng)物體組分，選自體液、體細(xì)胞和/或體組織，優(yōu)選血液、血組分、血清、腦脊液、粘膜涂片、痰液、尿、糞便、精液和組織樣品。這些身體組分優(yōu)選含有一種或多種下列分子和/或生物體:
[0163]i.游離循環(huán)的人或動(dòng)物核酸(DNA、RNA)，例如游離循環(huán)的胎兒核酸、來自惡性和/或非惡性腫瘤的核酸、來自凋亡細(xì)胞的核酸、非編碼小RNA如微小RNA(miRNA)和siRNA,
[0164]ii.來自微生物的游離循環(huán)核酸，優(yōu)選來自病原體，尤其優(yōu)選來自原生動(dòng)物、細(xì)菌和病毒，
[0165]iii.微生物,優(yōu)選病原體,尤其優(yōu)選原生動(dòng)物、細(xì)菌和病毒。 [0166]此組特定包括在分子醫(yī)學(xué)診斷中感興趣的樣品材料，但具體僅含有少量待檢測(cè)的靶標(biāo)核酸。這包括例如下列含有核酸的樣品材料:血液產(chǎn)品，尤其是例如包括待分離短鏈游離循環(huán)胎兒核酸的母體血液、血漿或血清，包括游離循環(huán)腫瘤核酸的血液樣品，來自包括游離核酸的凋亡組織的組織樣品，以及用于檢測(cè)非編碼小RNA具體例如miRNA和SiRNA的組織樣品。另外，例如，也包括來自感染的人或動(dòng)物的血液樣品，其病原體或病原體的降解產(chǎn)物尤其是它們的核酸在血液中存在。
[0167]第三組合適的樣品材料包括在法醫(yī)學(xué)核酸診斷中分析的樣品材料。這些樣品優(yōu)選選自含有細(xì)胞和/或核酸和/或生物體的液體和固體材料。如果需要分析的材料是固體，在液體中提取該材料中或之上含有的細(xì)胞和/或核酸和/或生物體，從而它們能夠在按照本發(fā)明用于核酸分離和/或純化的方法中使用。
[0168]這組樣品材料的特征具體是潛在無限多樣的樣品材料，其包括所有可能攜帶或含有核酸的材料，但特定通常僅含有較小痕量的待檢測(cè)核酸。因此，按照本發(fā)明的方法特別有利，因?yàn)槠淠軌蛴行Ш透咝У胤蛛x在樣品中僅以極低濃度存在的核酸，其中所述樣品材料甚至非常不同的組成對(duì)于所述方法沒有負(fù)面影響。由于不需要對(duì)于各種樣品材料的特定單獨(dú)預(yù)處理，本發(fā)明所述方法能夠?qū)Ψ浅６鄻踊姆ㄡt(yī)學(xué)樣品進(jìn)行寬泛、標(biāo)準(zhǔn)、自動(dòng)化和同步的核酸篩選。由此，可設(shè)想通過本發(fā)明所述方法，樣品材料也能用作法醫(yī)學(xué)證據(jù)，由于非常低含量的核酸，用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法不能從中分離足夠量的核酸。因此，可以設(shè)想更廣泛的基于更大數(shù)量和樣品類型的分子診斷，其能產(chǎn)生新的和/或進(jìn)一步的結(jié)果并且能因此提供可靠性提高的法醫(yī)學(xué)調(diào)查結(jié)果。
[0169]第四組合適的樣品材料包括具有樣品組分和任選生物體的組合物。該組合物的樣品組分優(yōu)選選自食物或其組分和環(huán)境組分，優(yōu)選土壤、水和植物，其中該組分溶于或重懸于樣品材料。如果所述樣品組分是水，水樣品是所述組合物的組分或需要分析的樣品本身。該組的樣品材料因此包括含有核酸的樣品，其用于食物和環(huán)境診斷中的核酸分析領(lǐng)域。例如，在食物生產(chǎn)和監(jiān)測(cè)中，重要的是能夠基于微生物核酸通過分子方法檢測(cè)食物中甚至輕微的微生物污染。通過分子基礎(chǔ)上的快速檢測(cè)方法而不是經(jīng)典方法如耗時(shí)的生物培養(yǎng)，從水樣品中檢測(cè)病原體是非 常重要的。這也應(yīng)用于土壤和植物樣品的分析，就共生體而言對(duì)其分析監(jiān)測(cè)也令人感興趣。因此，可以設(shè)想檢測(cè)來自細(xì)菌、病毒、真菌和/或原生動(dòng)物的核酸。甚至輕微污染的樣品尤其在監(jiān)測(cè)診斷的領(lǐng)域中提供了重要信息，從而本發(fā)明所述方法特別合適，用該方法能在污染生物體消化之后檢測(cè)到少量的核酸。屬于該組的樣品材料也能在其組成和性質(zhì)例如其PH和/或鹽含量方面有顯著變化。因此，按照本發(fā)明的方法也特別有利，因?yàn)楸景l(fā)明所述預(yù)處理允許從非常不同的樣品中高效、有效和可靠地純化甚至極少量的核酸，而不需要事前單獨(dú)調(diào)整/調(diào)節(jié)樣品材料和/或純化過程。
[0170]在第一組樣品材料中的生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品具體例如生物藥物，優(yōu)選通過遺傳修飾或未修飾的生物體和/或細(xì)胞生產(chǎn)。在原核和真核細(xì)胞中都生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品。低等和高等真核生物的細(xì)胞用作真核細(xì)胞。這些生物體和/或細(xì)胞優(yōu)選選自來自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系、來自鳥類的細(xì)胞系、來自昆蟲的細(xì)胞系、來自魚類的細(xì)胞系、來自植物的細(xì)胞系和微生物，其中來自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系優(yōu)選包括下列細(xì)胞系:人細(xì)胞系、來自馬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自牛細(xì)胞的細(xì)胞系、來自豬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自袋鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自綿羊細(xì)胞的細(xì)胞系、來自猴細(xì)胞的細(xì)胞系、來自狗細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貓細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貂鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自兔細(xì)胞的細(xì)胞系、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系、來自倉鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自大鼠細(xì)胞的細(xì)胞系和來自小鼠細(xì)胞的細(xì)胞系，并且特別優(yōu)選細(xì)胞系Hek293(人胚胎腎細(xì)胞系)、HeLa (人宮頸癌)、Vero (正常成年非洲綠猴的腎臟)、MDCK (可卡犬腎)、CH0 (中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、SP2 (小鼠骨髓瘤)、NSO (小鼠骨髓瘤)、雜交瘤細(xì)胞系和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。按照一個(gè)實(shí)施方式,所用的宿主細(xì)胞是永生化細(xì)胞。所述微生物優(yōu)選包括細(xì)菌和酵母，并且特別優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)。如引言所述，能夠使用遺傳工程技術(shù)修飾各細(xì)胞以能夠產(chǎn)生感興趣的產(chǎn)物，例如能夠通過例如使用載體重組引入編碼感興趣產(chǎn)物如肽或蛋白的基因。然后各修飾細(xì)胞能夠生產(chǎn)感興趣產(chǎn)物。另外，能夠使用細(xì)胞尤其是細(xì)菌或酵母細(xì)胞通過細(xì)胞的酶機(jī)器從前體分子產(chǎn)生需要的產(chǎn)物。
[0171]按照另一方面，本發(fā)明提供了用于從樣品材料分離和/或純化核酸的方法的試劑，尤其是用于樣品材料的制備，其中所述試劑至少包括下列組分:
[0172]a.至少一種或多種含氨基的化學(xué)物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0173]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0174]i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0175]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0176]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0177]V.氨基羧酸聚合物，包括至少一種在(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，優(yōu)選0.5kDa-300kDa的大小，優(yōu)選形成自相同、兩種或多種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，優(yōu)選氨基羧酸聚合物由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，
[0178]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括至少一種(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，其中所述肽包括的氨基羧酸優(yōu)選選自相同或不同的(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，并且優(yōu)選所述肽由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，`
[0179]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。通式(I)的化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0180]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。化合物(II)優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0181]以及至少一種或多種下列組分:
[0182]b.至少一種去污劑或去污劑的混合物，優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0183]c.至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，
[0184]d.至少一種蛋白或蛋白的混合物，優(yōu)選所述蛋白是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白，[0185]其中，如果所述試劑含有一種或多種組(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的組分，所述試劑額外包括至少一種蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白。
[0186]因此，本發(fā)明所述試劑適合各種用以制備用于后續(xù)核酸分離和/或純化的樣品的實(shí)施方式。用所述試劑的預(yù)處理能夠從非常不同的樣品材料中有效并且甚至定量分離核酸，即使所述樣品材料僅含有極少量的核酸。對(duì)于一些樣品材料，核酸純化僅當(dāng)用本發(fā)明所述試劑進(jìn)行預(yù)處理時(shí)是可能的，如在實(shí)施例中所不。
[0187]在含有化合物三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)的本發(fā)明所述試劑的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述制劑不含有EDTA和/或EGTA。
[0188]所述試劑含有至少一種包括氨基的化合物，但也能夠含有幾種相應(yīng)的化合物。如果存在兩種或更多種包括氨基的化合物，優(yōu)選存在組(1.)之內(nèi)和/或之間的組分的混合物。
[0189]例如，能夠包括一種或多種極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或蘇氨酸和/或絲氨酸。此外，所述試劑中還能包括一種或多種非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或異亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或纈氨酸，以及一種或多種堿性a -氨基羧酸如精氨酸和/或賴氨酸和/或鳥氨酸。也能包括一種或多種非蛋白性氨基羧酸，例如P -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高絲氨酸和/或D-纈氨酸。所述試劑中還能包括氨基羧酸聚合物，所述氨基羧酸聚合物可優(yōu)選從相同或者兩種或更多種不同的氨基羧酸單體中形成，所述氨基羧酸單體選自極性-中性蛋白性a-氨基羧酸組和/或非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸組和/或堿性a-氨基羧酸組和/或非蛋白性氨基羧酸組。所述試劑中還能包括來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，所述肽可優(yōu)選從相同或不同的氨基羧酸中形成，所述氨基羧酸選自極性-中`性蛋白性a-氨基羧酸組和/或堿性a-氨基羧酸組和/或非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸組和/或非蛋白性氨基羧酸組。此外，所述試劑中也能包括一種或多種通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基和羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2、R3和R4殘基中的至少一個(gè)不是氫。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。通式(I)的化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和/或N,N_ 二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine)。另外，所述試劑中也能包括一種或多種通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R的7殘基中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，并且是飽和或不飽和的。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。對(duì)應(yīng)此通式的一個(gè)優(yōu)選化合物是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)化合物。合適的飽和或不飽和、支鏈或直鏈烷基組分示例已在上面聯(lián)合所述試劑加以描述。這些在此應(yīng)類似地使用。
[0190]除一種或多種包括一個(gè)氨基的所述化合物以外，本發(fā)明所述試劑包含至少一種或多種下列組分:至少一種去污劑和/或至少一種絡(luò)合劑和/或至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白，其中每個(gè)組分能夠以純化合物或幾種化合物的混合物的形式存在，例如，以去污劑的混合物和/或絡(luò)合劑的混合物和/或蛋白混合物的形式存在。如上述，這些額外組分對(duì)于預(yù)處理具有正面影響，因?yàn)槠涮岣叽兓怂岬幕厥章?。參考上述公開內(nèi)容。
[0191]所述試劑的pH優(yōu)選在pH3_pH9的范圍內(nèi)。
[0192]在所述試劑的實(shí)施方式中，如果所述試劑含有一種或多種組(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的組分，其還含有至少一種蛋白或蛋白的混合物。即，如果所述試劑含有例如一種或多種極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，例如天冬酰胺和/或半胱氨酸和/或谷胺酰胺和/或甘氨酸和/或蘇氨酸和/或絲氨酸，和/或一種或多種非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，例如丙氨酸和/或亮氨酸和/或異亮氨酸和/或甲硫氨酸和/或脯氨酸和/或纈氨酸，和/或一種或多種堿性a -氨基羧酸，例如精氨酸和/或賴氨酸和/或鳥氨酸，和/或來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，所述氨基羧酸優(yōu)選選自相同或不同的來自以下的氨基羧酸:極性-中性蛋白性a -氨基羧酸組(1.)和/或非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸組(i1.)和/或堿性a -氨基羧酸組(ii1.)和/或非蛋白性氨基羧酸組(iv.)，例如^ -丙氨酸和/或D-丙氨酸和/或L-高絲氨酸和/或D-纈氨酸。所述試劑中包括的蛋白優(yōu)選是球狀蛋白，其優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白。
[0193]向本發(fā)明所述試劑添加蛋白意外顯示是有利的，其中用于樣品材料預(yù)處理的所述試劑與所述樣品材料接觸。這增加了核酸純化的效率，尤其是當(dāng)所述樣品材料僅含有低濃度的蛋白時(shí)。因此相應(yīng)蛋白在本發(fā)明所述試劑中的應(yīng)用改善了核酸純化，尤其是當(dāng)待處理樣品材料僅包含少量的蛋白和/或在所含蛋白濃度方面有差異時(shí)。
[0194]按照本發(fā)明所述試劑的一個(gè)實(shí)施方式，含有組分Tris和/或N，N-二(2_羥基乙基)甘氨酸和/或N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸的實(shí)施方式中不含離液化合物。此實(shí)施方式的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)結(jié)合本發(fā) 明所述方法中相應(yīng)試劑的使用來解釋；參考上述公開內(nèi)容。
[0195]按照一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述試劑包括大小為0.5kDa-300kDa的一種或多種氨基羧酸聚合物。所述氨基羧酸聚合物能夠以來自相同氨基羧酸單體的均聚物或來自兩種或更多種不同氨基羧酸單體的共聚物存在，其中所述單體在聚合物鏈中交替排列、隨機(jī)分布，采用梯度或塊狀形式。兩種聚合物類型都優(yōu)選從下組的氨基羧酸單體中形成:(1.)極性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸和/或(ii1.)堿性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸，優(yōu)選與氫鹵化物如溴化氫或氯化氫聯(lián)合。優(yōu)選選擇的化合物是聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸。也包括從非蛋白性對(duì)映體形式形成的聚合物，例如聚-D-賴氨酸、聚-D-賴氨酸氫溴酸鹽、聚(D-谷胺酰胺，D-賴氨酸)氫溴酸鹽。
[0196]如果本發(fā)明所述試劑的一個(gè)實(shí)施方式包含來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，這些氨基羧酸優(yōu)選選自下組的相同或不同的氨基羧酸:(1.)極性-中性蛋白性a-氨基羧酸和/或(i1.)非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸和/或(ii1.)堿性a -氨基羧酸和/或(iv.)非蛋白性氨基羧酸。肽化合物優(yōu)選在以下優(yōu)選描述的分子間形成:天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，其中這些分子任意組合作為二聚體、三聚體或四聚體是可能的。來自2個(gè)氨基羧酸的肽化合物的合適例子已經(jīng)在本發(fā)明所述方法的范圍內(nèi)，結(jié)合本發(fā)明所述試劑的使用來展示。參考上述公開內(nèi)容。與組合自2個(gè)氨基羧酸的所述肽化合物類似，具有3-4個(gè)氨基羧酸的肽化合物是可能的。
[0197]優(yōu)選地，來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽是甘氨酸-甘氨酸二聚體，優(yōu)選甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三聚體并且優(yōu)選甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸四聚體。
[0198]按照一個(gè)實(shí)施方式，在試劑中包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合的總濃度是 5mM-500mM，優(yōu)選 25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM。
[0199]具有去污劑的本發(fā)明所述試劑的一個(gè)實(shí)施方式含有去污劑或去污劑的混合物，其優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，優(yōu)選選自烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷優(yōu)選選自聚山梨酯，優(yōu)選選自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，并且特別優(yōu)選聚山梨酯20 (吐溫20)。聚氧乙烯烷基苯基醚的組優(yōu)選包括辛苯聚醇9 (曲通X-100)和諾乃洗滌劑P-40。
[0200]按照一個(gè)實(shí)施方式，在所述試劑中，所述去污劑優(yōu)選一種或多種非離子型表面活性劑的總濃度是0.1% (V / v) -5% (v / V),優(yōu)選0.2% (v / v) -4% (v / v),并且優(yōu)選0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也優(yōu)選 I % (v / v)-3% (v / v)。0.2% (v / v) -0.5%(v / v)的值已顯示特別優(yōu)選用于聚氧乙烯烷基苯基醚，例如曲通x-100。按照一個(gè)實(shí)施方式，當(dāng)使用烷基葡糖苷，特別如聚山梨酯例如吐溫20時(shí)，使用在約1% (v / v)-5% (v /v)水平的濃度。優(yōu)選使用至少兩種去污劑，其中一種去污劑優(yōu)選選自聚氧乙烯烷基苯基醚而另一種去污劑選自烷基葡糖苷，例如聚山梨酯。特別優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑含有曲通x-100和吐溫20的組合。
[0201]按照一個(gè)實(shí)施方式， 本發(fā)明所述試劑含有絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)。特別優(yōu)選使用EDTA。在這個(gè)具有絡(luò)合劑的實(shí)施方式中，在所述試劑中絡(luò)合劑的總濃度優(yōu)選是10mM-500mM，優(yōu)選10mM-300mM，10mM-200mM并且更優(yōu)選10mM-100mM。在本發(fā)明所述試劑的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑含有化合物三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，然而，所述制劑不含有EDTA和/或EGTA。
[0202]按照一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑含有蛋白或蛋白的混合物。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述蛋白沒有任何酶活性，優(yōu)選所述蛋白不是酶。優(yōu)選地，所述蛋白是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白。所述白蛋白優(yōu)選選自動(dòng)物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。所述球蛋白優(yōu)選選自動(dòng)物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白，優(yōu)選Y-球蛋白。在試劑中，所述一種或多種蛋白的總濃度優(yōu)選是Img / mL-100mg / mL,優(yōu)選 2mg / ml-25mg / ml,優(yōu)選 2mg / ml-10mg / ml 并且優(yōu)選 4mg / mL-10mg / mL。對(duì)于IgG和BSA的使用，優(yōu)選使用2mg / ml_25mg / ml,優(yōu)選2mg / ml-10mg / ml并且優(yōu)選4mg / mL-lOmg / mL。這些濃度是有利的，特別當(dāng)使用球狀蛋白，尤其是例如IgG和/或BSA 時(shí)。
[0203]按照本發(fā)明的試劑優(yōu)選不含水性制劑，所述水性制劑含有總濃度> 5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽，因?yàn)檫@些對(duì)于核酸分離和/或純化具有抑制效果。
[0204]按照一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑包括至少一個(gè)或多個(gè)含有氨基的化合物，所述氨基選自下述1-viii組中的一種或多種:
[0205]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，[0206]i1.丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0207]ii1.精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0208]iv.P -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0209]V.聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0210]v1.甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體、甘氨酸四聚體和二肽(Ala-Glu)，
[0211]vi1.N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N-二(2_羥基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0212]和/或
[0213]vin.三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris),
[0214]其中，如果所述試劑含有一種或多種組(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的化合物，所述試劑另外包含至少一種蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白。
[0215]下面描述了本發(fā)明所述試劑的特別優(yōu)選的實(shí)施方式。在這些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑的單獨(dú)組分優(yōu)選以上面就單獨(dú)組成部分描述的濃度存在，在這個(gè)方面參考上述公開內(nèi)容。
[0216]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑包括至少甘氨酸、Gly-Gly、N_(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸和/或N`，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸作為含氨基的化合物、至少一種絡(luò)合劑(優(yōu)選EDTA)以及至少一種，優(yōu)選至少兩種去污劑，優(yōu)選曲通X-100和/或吐溫20。
[0217]優(yōu)選地,所述試劑還包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0218]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述試劑包括一個(gè)或多個(gè)來自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的極性-中性和/或堿性a-氨基羧酸。添加相應(yīng)的a -氨基羧酸在樣品材料的預(yù)處理中也具有正面影響，尤其是當(dāng)這些a -氨基羧酸與緩沖液組合時(shí)，特定在Tris或磺酸緩沖液中，例如HEPES或HEPPS緩沖液。另外，所述試劑優(yōu)選包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0219]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-賴氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如諾乃洗滌劑-P40和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。所述試劑也包括球狀蛋白以及優(yōu)選一種或多種緩沖液，所述球狀蛋白優(yōu)選IgG，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES 和 / 或 HEPPS。
[0220]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述試劑包括至少一種、優(yōu)選兩種以下氨基羧酸化合物即3 -丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如聚山梨酯40。優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白和一種或多種緩沖液，所述球狀蛋白優(yōu)選IgG，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0221]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽和三(羥基甲基)-氨基甲烷(Tris)。此外，如果所述試劑中含有一種或多種氨基羧酸化合物半胱氨酸、丙氨酸和/或精氨酸，該試劑包括球狀蛋白，尤其是IgG。
[0222]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即絲氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、D-纈氨酸和聚-L-鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。，如果所述試劑中含有一種或多種氨基羧酸化合物絲氨酸、甲硫氨酸和/或賴氨酸，所述試劑也包括球狀蛋白，優(yōu)選BSA。
[0223]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDDS，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。所述試劑還包括至少一種蛋白和優(yōu)選一種或多種緩沖液，所述蛋白優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0224]按照一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明所述試劑沒有任何裂解性質(zhì)并且因此不能裂解樣品材料，使所述試劑與所述樣品材料接觸以用于制備。
[0225]就核酸純化應(yīng)用本發(fā)明所述試劑以預(yù)處理樣品材料能夠從各種樣品材料中分離和/或純化核酸，即使它們僅以少量存在于樣品材料中。另外，例如在本示例中所用，用本發(fā)明所述試劑預(yù)處理樣品材料能夠從樣品材料中純化核酸，而在不使用本發(fā)明所述試劑的情況下，用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法從這些樣品材料中分離核酸是不可能的。需要純化的核酸能選自單鏈或雙鏈的真核、原核和病毒核酸，包括RNA、DNA和質(zhì)粒。按照一個(gè)實(shí)施方式，需要純化的核酸代表至少部分樣品材料的污染。
[0226]另外，本發(fā)明提供了用于從生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸的方法，其優(yōu)選包括至少一種生物藥物,其中所述方法包括至少下列步驟:
[0227]a.用試劑預(yù)處理所述生物處`理樣品，其中所述試劑包括至少一種或多種含氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0228]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0229]i1.非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0230]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0231]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0232]V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，優(yōu)選大小為 0.5kDa-300kDa,
[0233]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括至少一種(i)-(iv)中所述的氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同的氨基羧酸，優(yōu)選是甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，[0234]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。通式(I)的化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0235]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的?；衔?II)優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0236]b.優(yōu)選混合所述試劑與生物處理樣品，
[0237]c.從所述生物處理樣品中分離和/或純化核酸，所述樣品已經(jīng)與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合，
[0238]d.任選定量和/或定性檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0239]如已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法所提到，用步驟(a)中定義的試劑預(yù)處理生物處理樣品具有以下優(yōu)勢(shì):后續(xù)的核酸純化能夠顯著改善，尤其是當(dāng)所述生物處理樣品僅含有少量的靶標(biāo)核酸時(shí)。對(duì)于一些生物處理樣品，所述核酸的分離僅由此變得可能。在步驟(a.)中進(jìn)行的預(yù)處理能通過一種令人驚訝的簡(jiǎn)單方式從甚至非常不同的生物處理樣品中以基本恒定的效率可靠分離核酸，例如在容許的變化之內(nèi)。因此，用按照本發(fā)明的方法分離靶標(biāo)核酸(例如宿主DNA或其他核酸污染物)是可能的，即使它們以僅僅Ipg或更少的量存在于所述生物處理樣品中。由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，能夠有效純化甚至0.1pg的量或甚至0.01pg的量。因此，按照本發(fā)明的方法足夠靈敏，甚至在應(yīng)用生物處理樣品的這個(gè)高要求領(lǐng)域中，能夠用統(tǒng)一的分離方法可靠分離并且甚至定量分離靶標(biāo)核酸。因此，所述方法也能夠易于自動(dòng)化，這在通常必須處理大量樣品的所述領(lǐng)域中是一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)。
[0240]本發(fā)明所述用于從生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸的方法基本上是本發(fā)明所述第一種方法的【具體實(shí)施方式】，其已經(jīng)如上詳細(xì)描述，用于從樣品材料中分離和/或純化核酸。特別合適和優(yōu)選的包括氨基基團(tuán)的化合物(其能包括在步驟(a.)使用的試劑中)以及合適和優(yōu)選濃度的預(yù)處理所用試劑單獨(dú)組分已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法詳細(xì)解釋并且也應(yīng)用于從生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸的方法。為了避免重復(fù)，因而參考上述公開內(nèi)容的全文，其在此也是適用的。然而，為了完整性目的，特別優(yōu)選的實(shí)施方式在下文中再次詳細(xì)解釋。特別優(yōu)選地，上文詳述的本發(fā)明所述試劑用于步驟(a.)中的預(yù)處理，并且也在權(quán)利要求中更為詳細(xì)地描述。
[0241]合適和優(yōu)選的包括氨基 的化合物如上詳細(xì)描述；參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。按照一個(gè)實(shí)施方式，在生物處理樣品與步驟(a.)內(nèi)用于預(yù)處理的試劑的反應(yīng)混合物中，包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合的總濃度是2.5mM-400mM,優(yōu)選12.5mM-280mM,特別優(yōu)選25mM-200mM。這些濃度已經(jīng)證明對(duì)于200 yl-1000 yl大小范圍的樣品材料與試劑的反應(yīng)混合物特別有利。在此，所述核酸的定量分離是可能的，即使本發(fā)明所述試劑與樣品材料的反應(yīng)混合物僅含有Ipg核酸數(shù)量級(jí)的少量核酸。按照本發(fā)明用于步驟(a.)的試劑中，優(yōu)選包含氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合總濃度為5mM-500mM，優(yōu)選25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM。
[0242]按照用于從生物處理樣品中分離核酸的本發(fā)明所述方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，用某一試劑完成步驟(a.)中的預(yù)處理，所述試劑也包括以下組分中的至少一種或多種:
[0243]-至少一種去污劑或去污劑的混合物，
[0244]-至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，優(yōu)選選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和/或乙二胺二琥珀酸(EDDS)，特別優(yōu)選EDTA，
[0245]和/ 或
[0246]-至少一種蛋白或蛋白的混合物。
[0247]實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示，使用額外含有一種或多種相應(yīng)組分的相應(yīng)試劑預(yù)處理，能夠進(jìn)一步改善后續(xù)的分離和/或純化。如果所述試劑包括幾種組分或成分，它們能夠以均勻試劑的形式添加，例如溶液，或者，所述試劑能通過混合兩種或多種組合物形成，例如使這些組合物與生物處理樣品一起接觸或還任選地互相分開接觸，以按照步驟(a.)進(jìn)行所述樣品的預(yù)處理。按照本發(fā)明，術(shù)語使用試劑預(yù)處理生物過程樣品也涵蓋單獨(dú)組分的分開添加。優(yōu)選使用均勻試劑。
[0248]如上所述，所述去污劑優(yōu)選是非離子型表面活性劑，優(yōu)選烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚。烷基葡糖苷的組特定包括聚山梨酯的組，優(yōu)選聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80。特別優(yōu) 選地，使用聚山梨酯20 (吐溫20)作為烷基葡糖苷。聚氧乙烯烷基苯基醚優(yōu)選是辛苯聚醇9(曲通X-100)或諾乃洗滌劑P-40。優(yōu)選地，在所述試劑中，所述去污劑或去污劑的混合物尤其是一種或多種非離子型表面活性劑的總濃度是0.1% (v /v) -5 % (v / v),優(yōu)選 0.2% (v / v)-4% (v / v),并且優(yōu)選 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也優(yōu)選I % (v / v) -3% (v / v)。0.2% (v / v) -0.5% (v / v)優(yōu)選用于聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100，并且I % (v / v)-5% (v / v)優(yōu)選用于烷基葡糖苷，尤其是聚山梨酯，例如吐溫20。
[0249]按照一個(gè)實(shí)施方式，在生物處理樣品與本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中，所述試劑所含去污劑或去污劑的混合物尤其是一種或多種非離子型表面活性劑的總濃度是0.05 % (V / v) -4 % (v / v),優(yōu)選 0.1 % (v / v) -3 % (v / v)并且優(yōu)選 0.25 % (v /v) -2.5% (v / v)以及優(yōu)選 0.5% (v / v) -2.5% (v / v)。0.1% (v / v) -0.4% (v / v)的值已經(jīng)證明特別優(yōu)選用于聚氧乙烯烷基苯基醚，例如曲通x-100。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述濃度優(yōu)選是0.5% (v / v)-4% (v / V)。這個(gè)濃度尤其優(yōu)選用于聚山梨酯，例如吐溫20。優(yōu)選地，用于預(yù)處理生物處理樣品的步驟(a.)所用試劑含有至少兩種去污劑。按照一個(gè)實(shí)施方式，一種去污劑選自烷基葡糖苷組，優(yōu)選聚山梨酯，尤其優(yōu)選聚山梨酯20，并且另一種去污劑選自聚氧乙烯烷基苯基醚的組，優(yōu)選曲通X-100。
[0250]按照一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑包括絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物。按照一個(gè)實(shí)施方式，在試劑中絡(luò)合劑的總濃度是10mM-500mM，優(yōu)選lOmM-lOOmM。按照一個(gè)實(shí)施方式，在生物處理樣品與本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中，所述試劑所含絡(luò)合劑的總濃度是5mM-400mM，優(yōu)選5mM-80mM。其優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)如上解釋。
[0251]按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白或球狀蛋白的混合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述蛋白沒有任何酶活性。優(yōu)選地，該蛋白不是酶。球狀蛋白優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白。按照本發(fā)明所述方法的一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)所用試劑中一種或多種蛋白的總濃度是Img /mL-100mg / mL,優(yōu)選 2mg / mL_25mg / mL, 2mg-10mg / ml 并且也優(yōu)選 4mg_10mg / ml。2mg / mL-25mg / mL、2mg / ml-10mg / ml 和優(yōu)選 4mg / ml-10mg / ml 的濃度特別適于球狀蛋白，具體例如IgG和BSA。按照一個(gè)實(shí)施方式，在生物處理樣品與本發(fā)明所述試劑的反應(yīng)混合物中，來自試劑的一種或多種蛋白的總濃度是0.5mg / mL-80mg / mL, Img /mL-20mg / mL,優(yōu)選 Img / mL-8mg / mL,優(yōu)選 2mg / mL-8mg / mL。對(duì)于細(xì)節(jié)和優(yōu)勢(shì)，參考上述公開內(nèi)容以及本發(fā)明所述方法。
[0252]按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑不含總濃度> 5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽。
[0253]按照一個(gè)實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑不含或僅含有少量的離液化合物。這個(gè)實(shí)施方式是有利的，因?yàn)闇y(cè)試已經(jīng)顯示用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑中的離液化合物例如離液鹽，特別是在較高濃度下能對(duì)后續(xù)核酸純化產(chǎn)生不利影響，例如其可能反映為在經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的定量檢測(cè)中的較低回收率。因此用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑優(yōu)選不含一定濃度的離液化合物，該濃度使得按照本發(fā)明的預(yù)處理效果更差，并且尤其是干擾后續(xù)核酸分離的濃度。優(yōu)選地，用于本發(fā)明所述方法步驟(a.)的試劑不含濃度超過71、611、511、411、311、211、謹(jǐn)或超過0.5M的離液鹽，尤其是胍鹽。優(yōu)選離液鹽尤其是胍鹽的量在0.1M以下。特別優(yōu)選地，在步驟(a.)中使用的試劑不含任意離液鹽或其他離液化合物。優(yōu)選地，這相應(yīng)用于步驟(a.)中的預(yù)處理，例如，在步驟(a.)中優(yōu)選沒有離液化合物加入到生物處理樣品中。
[0254]按照一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑沒有任何裂解性質(zhì)。
[0255]按照一個(gè)實(shí)施方式，用于預(yù)處理的步驟(a.)所用試劑包括至少一個(gè)或多個(gè)含有氨基的化合物，所述化合物選自下述1-viii組中的一種或多種:
[0256]1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0257]i1.丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0258]ii1.精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0259]iv.^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0260]V.聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0261]v1.甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體、甘氨酸四聚體和二肽(Ala-Glu)，
[0262]vi1.N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N- 二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine)，
[0263]和/ 或
[0264]vii1.三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
[0265]下面描述了步驟(a.)所用試劑的特別優(yōu)選的實(shí)施方式。在這些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑的單獨(dú)組分優(yōu)選以上面就單獨(dú)組成部分描述的濃度存在，在這個(gè)方面參考上述的公開內(nèi)容。如前已述，能夠在樣品材料的預(yù)處理中分開加入所述試劑的單獨(dú)組分，然而，其中優(yōu)選以均勻試劑形式加入，例如溶液。[0266]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少甘氨酸、Gly-Gly、N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸作為包含氨基的化合物、至少一種絡(luò)合劑(優(yōu)選EDTA)以及至少一種，優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，例如優(yōu)選吐溫20。特別優(yōu)選地，所述試劑還包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0267]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的本發(fā)明所述試劑包括一個(gè)或多個(gè)選自天冬酰胺、谷胺酰胺、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的極性-中性和/或堿性a -氨基羧酸。在此，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示用相應(yīng)試劑預(yù)處理還能夠改善分離和/或純化，尤其是當(dāng)所述a -氨基羧酸與緩沖液組合，具體例如Tris或磺酸緩沖液，例如HEPES或HEPPS緩沖液。另外，所述試劑優(yōu)選包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA。
[0268]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括氨基羧酸化合物谷胺酰胺、脯氨酸、聚-L-賴氨酸和/或聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)以及二肽(Ala-Glu)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如諾乃洗滌劑-P40和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白和一種或多種緩沖液，所述球狀蛋白優(yōu)選IgG，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0269]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少一種、優(yōu)選兩種以下氨基羧酸化合物即(6-丙氨酸和聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如聚山梨酯40。優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白以及一種或多種緩沖液，所述球狀蛋白優(yōu)選IgG，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES 和 / 或 HEPPS。
[0270]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽和三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)。此外，該試劑優(yōu)選包括球狀蛋白，尤其是IgG。
`[0271]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即絲氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、D-纈氨酸和聚-L-鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EGTA，和至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。優(yōu)選地，所述試劑也包括球狀蛋白，優(yōu)選 BSA。
[0272]按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在步驟(a.)中使用的試劑包括至少兩種、優(yōu)選所有的以下氨基羧酸化合物即蘇氨酸、亮氨酸和鳥氨酸。優(yōu)選地，其還包括絡(luò)合劑例如EDDSJP至少一種、優(yōu)選至少兩種去污劑，尤其優(yōu)選聚氧乙烯烷基苯基醚，如曲通X-100和/或聚山梨酯，優(yōu)選例如吐溫20。優(yōu)選地，所述試劑還包括蛋白以及優(yōu)選一種或多種緩沖液，所述蛋白優(yōu)選球狀蛋白如IgG或BSA，所述緩沖液優(yōu)選一種或兩種磺酸緩沖液，例如HEPES和/或HEPPS。
[0273]按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟(a.)所用試劑的pH在pH3_pH9的范圍內(nèi)。
[0274]優(yōu)選地，50-3000 iil，優(yōu)選100-1500 y 1，特別優(yōu)選200-1000 量的特定生物處
理樣品用于本發(fā)明所述核酸分離，并且在步驟(a.)中用本發(fā)明所述制劑相應(yīng)處理。在步驟(a.)中試劑和生物處理樣品優(yōu)選以下列比例一起加入:1+4至4+1 (Vww
+V生物處理樣品)，優(yōu)選1+2 (V試劑+V生物處理樣品)M 2+1 (V試劑+V生物處理樣品)并且特別優(yōu)選1+1 (V試劑
+V)。應(yīng)優(yōu)選進(jìn)行后續(xù)的混合步驟。
[0275]在步驟(a.)以及任選的步驟(b.)中本發(fā)明所述預(yù)處理之后是分離和/或純化核酸的步驟(C.)。任選地，本發(fā)明所述試劑與從步驟(a.)或步驟(a.)和步驟(b.)得到的生物處理樣品的組合物在步驟(c.)之前還能進(jìn)一步加工和/或處理，例如通過加入另外的制劑或通過分離單獨(dú)的組分。生物處理樣品與本發(fā)明所述試劑的組合物因此還可包括額外的組分，例如其在步驟(a.)中的預(yù)處理之后但在步驟(c.)的分離之前加入。為簡(jiǎn)明起見，從相應(yīng)中間步驟得到的組合物也能在本申請(qǐng)的內(nèi)容中表示為本發(fā)明所述試劑與從步驟(a.)或步驟(a.)和步驟(b.)得到的生物處理樣品的組合物。
[0276]取決于實(shí)施方式的步驟(c.)可能具有幾個(gè)子步驟，基本上與任意類型的核酸分離方法一起發(fā)揮功能。使用或不使用運(yùn)載體材料以結(jié)合核酸的分離方法的非詳盡示例已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法在前文中描述。參考上述公開內(nèi)容。按照一個(gè)實(shí)施方式，步驟(C.)中核酸的分離和/或純化包括至少一個(gè)下列子步驟C.1)和C.2)，優(yōu)選包括兩個(gè)子步驟:
[0277]c.1)通過添加至少一種裂解劑，消化本發(fā)明所述試劑與從步驟(a.)或步驟(a.)和步驟(b.)得到的生物處理樣品的組合物。用裂解劑的該處理特別用于生物處理樣品中可能含有的任意蛋白和可能存在的任意其他污染樣品組分的變性和/或降解。此外，取決于生物處理樣品，這個(gè)步驟也用于從例如絡(luò)合物質(zhì)中釋放生物處理樣品所含核酸的目的。由于本發(fā)明所述方法優(yōu)選能夠從非常不同的生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸，其可能因此在組成方面不同，因此使用裂解劑處理是有利的，即使生物處理樣品中的靶標(biāo)核酸一般不包含在細(xì)胞內(nèi)。在這個(gè)消化步驟中，優(yōu)選使用典型的裂解劑，例如蛋白水解酶，優(yōu)選蛋白酶如蛋白酶K，離液化合物，優(yōu)選`例如離液鹽和/或去污劑，優(yōu)選非離子型去污劑。按照一個(gè)實(shí)施方式，在此消化步驟中使用超過一種裂解劑。因此，在步驟(a.)中用試劑預(yù)處理的生物處理樣品可用至少一種蛋白水解酶以及至少一種裂解劑處理，所述蛋白水解酶優(yōu)選蛋白酶K，所述裂解劑包括至少一種離液化合物和/或去污劑。離液鹽特別例如胍鹽，優(yōu)選用作離液化合物。非離子型去污劑優(yōu)選用作去污劑。對(duì)于去污劑，優(yōu)選使用聚氧乙烯脂肪醇醚，其包括優(yōu)選具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括優(yōu)選具有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分。能優(yōu)選用于此消化步驟的裂解劑也描述于例如W02009 / 144182，其在此通過引用納入。按照一個(gè)實(shí)施方式，在消化步驟中，使按照步驟(a.)預(yù)處理的生物處理樣品與至少一種蛋白水解酶和至少一種其他裂解劑接觸并且孵育，所述裂解劑優(yōu)選含有離液化合物。孵育步驟的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選至少3分鐘，優(yōu)選至少5分鐘，優(yōu)選至少10分鐘，特別優(yōu)選至少15分鐘并且優(yōu)選在蛋白水解酶活性提高的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，在至少35°C，至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C進(jìn)行所述孵育步驟。優(yōu)選地，在35°C -70°C，優(yōu)選40°C_65°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行所述孵育。特別優(yōu)選地，使用蛋白水解酶和含有離液劑的裂解試劑的組合，其優(yōu)選也包括前述去污劑之一。
[0278]c.2)優(yōu)選通過結(jié)合到運(yùn)載體材料來分離核酸。如果所述生物處理樣品除了靶標(biāo)核酸以外也含有其他核酸，這些也能同時(shí)進(jìn)行純化。然而，如果需要，也能產(chǎn)生靶標(biāo)核酸的選擇性純化。運(yùn)載體材料優(yōu)選是核酸結(jié)合固相，其來自含二氧化硅材料、硅膠、二氧化硅、玻璃、沸石、氧化鋁、二氧化鈦、二氧化鋯、高嶺土、硅膠、陶瓷、聚合物運(yùn)載體材料，例如聚亞烷基和聚苯乙烯珠。最終起決定性作用的是運(yùn)載體材料能夠結(jié)合核酸。能夠用官能團(tuán)例如陰離子交換基團(tuán)修飾所述運(yùn)載體材料，或者其能是未修飾的并且因此在表面不含任何額外的官能團(tuán)。所述運(yùn)載體材料的其他實(shí)施方式已經(jīng)如上述，并且參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。特別優(yōu)選地，使用二氧化硅材料。在這種情況下優(yōu)選使用具有二氧化硅或玻璃表面的磁性顆粒。磁性二氧化硅顆粒優(yōu)選使本發(fā)明所述方法易自動(dòng)化，并且優(yōu)選的實(shí)施方式已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法如上描述；參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。按照一個(gè)實(shí)施方式，能夠通過步驟C.1)使用的裂解劑調(diào)節(jié)結(jié)合核酸所必需的結(jié)合條件，例如當(dāng)所述裂解劑包含合適濃度的離液化合物時(shí)。相應(yīng)的結(jié)合步驟已在現(xiàn)有技術(shù)中描述，例如在US5，234，809中。然而，優(yōu)選地，為了調(diào)節(jié)結(jié)合條件，加入結(jié)合劑，其包括至少一種醇，優(yōu)選具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇，尤其優(yōu)選異丙醇。所述結(jié)合劑也能夠包括離液化合物，優(yōu)選離液鹽和/或至少一種去污劑。所述去污劑優(yōu)選是非離子型去污劑。所述結(jié)合劑的優(yōu)選實(shí)施方式也結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法如上描述。參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。能用于步驟c.2)的其他結(jié)合劑描述于例如W02009 / 144182，其在此通過引用納入。核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料之后優(yōu)選是從剩余樣品中分離結(jié)合的核酸。如果使用磁性二氧化硅顆粒，這通常在磁場(chǎng)協(xié)助下優(yōu)選通過分離結(jié)合到所述運(yùn)載體材料的核酸來完成。任選地，所述核酸隨后能進(jìn)行洗滌和洗脫。
[0279]本發(fā)明所述用于從生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸的方法還包括用于檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的任選步驟(d.)。檢測(cè)能夠是定性的，但是在生物藥物領(lǐng)域，優(yōu)選是定量的。對(duì)于檢測(cè)，通常足以檢測(cè)經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的核酸片段。定量檢測(cè)優(yōu)選通過擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的片段發(fā)生。定 量檢測(cè)能夠?qū)ι锾幚順悠匪袠?biāo)核酸的量做出定量陳述。由于管理機(jī)構(gòu)要求，這尤其在生物藥物領(lǐng)域是重要的，因?yàn)椴荒艹^特定量的例如宿主DNA或其他核酸污染物。
[0280]除了上文已描述的基本步驟(a.)-(d.)，按照本發(fā)明的額外步驟也能夠在所述步驟(a.)-(d.)之前或之后進(jìn)行(并且例如在所述步驟(c.)的子步驟之前或之后)。詳細(xì)內(nèi)容也結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法加以解釋；參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。
[0281]術(shù)語生物處理樣品特別涉及在生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)過程中得到或產(chǎn)生的樣品材料。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述生物處理樣品是在純化過程中得到的純化部分。例如，其能是生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品(尤其是生物藥物)的純化過程中得到的純化部分。通常在此使用的用于純化相應(yīng)所生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品的方法如上所解釋；參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。術(shù)語生物處理樣品和純化部分也包括最終純化和/或配制的生物技術(shù)產(chǎn)物(例如生物藥物)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述純化部分是色譜洗脫液。例如可能在離子交換色譜、蛋白-A / G-親和色譜、疏水性相互作用色譜和/或親水相互作用色譜的過程中得到所述洗脫液。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述純化部分是水性樣品材料，除了需要分離的核酸以外其還包括一種或多種緩沖物質(zhì)和/或鹽。相應(yīng)純化部分中經(jīng)常含有的緩沖物質(zhì)示例是乙酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液。在純化緩沖液中經(jīng)常使用并且因此在純化部分中包含的其他緩沖劑是ACES、ADA、BES、BICINE、BIS-TRIS、CHES、檸檬酸鹽、甘氨酸、Gly-Gly、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、磷酸鹽、TAPS、TES、TRICINE、TRIS。也使用馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲酸鹽、三甲基胺、三乙基胺。尤其也在純化部分中出現(xiàn)的常見鹽是，例如堿金屬和堿土金屬基團(tuán)的氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽以及銨化合物，以及任選的Zn、Cu、N1、Co、Fe鹽(例如當(dāng)IMAC方法如N1-NTA用于純化時(shí))。
[0282]按照一個(gè)實(shí)施方式，所述生物處理樣品并且尤其是純化部分基本沒有細(xì)胞。需要研究的純化部分能源自用于生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品純化過程的任意階段。按照一個(gè)實(shí)施方式，用本發(fā)明所述方法從純化過程得到的不同純化部分中分離靶標(biāo)核酸。因此，例如能夠用本發(fā)明所述方法從純化過程的各種或甚至每個(gè)純化部分(包括最終純化的終產(chǎn)物)純化靶標(biāo)核酸。這使得優(yōu)選能監(jiān)測(cè)純化過程并且例如確保所純化終產(chǎn)物中包含的靶標(biāo)核酸量不超過所需和/或允許的量成為可能?；诎凑毡景l(fā)明在步驟(a.)中完成的生物處理樣品預(yù)處理，能夠用統(tǒng)一方法實(shí)現(xiàn)核酸的實(shí)際分離，即使所述生物處理樣品例如各種純化部分在其組成方面不同。此外，甚至極少量核酸的定量分離也是可能的。
[0283]按照一個(gè)實(shí)施方式，靶標(biāo)核酸代表所述生物處理樣品例如純化部分的污染。代表污染的核酸能是例如病毒核酸或微生物的核酸。按照一個(gè)實(shí)施方式，靶標(biāo)核酸是DNA，尤其是例如來自宿主或宿主細(xì)胞的基因組DNA，所述宿主或宿主細(xì)胞用于生物技術(shù)產(chǎn)品具體例如生物藥物的生產(chǎn)。通常用作生產(chǎn)器的宿主和宿主細(xì)胞結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法如上述解釋。參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。特別是當(dāng)使用永生化宿主細(xì)胞時(shí)，來自宿主細(xì)胞的DNA不應(yīng)以較大的量存在于最終生產(chǎn)的生物藥物中。當(dāng)重組產(chǎn)生感興趣的生物藥物，尤其是例如生物藥物肽或蛋白時(shí)，經(jīng)常使用各永生化宿主細(xì)胞。如上所述，管理當(dāng)局要求證明沒有超過特定的限制。另外，用于提供這種證明的核酸分離方法必須滿足特定的標(biāo)準(zhǔn)，尤其是它們必須足夠靈敏和可靠以保證可靠的結(jié)果。本發(fā)明所述方法滿足這些要求。相應(yīng)的背景、生物處理樣品的其他示例以及合適并且優(yōu)選的生物藥物示例已經(jīng)在前序中并結(jié)合本發(fā)明所述第一種方法詳細(xì)解釋。參考上述公開內(nèi)容，其也在此相關(guān)。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述生物藥物不是核酸。按照一個(gè)實(shí)施方式，所述生物藥物是肽或蛋白。如上所述，能夠用各種宿主細(xì)胞重組生產(chǎn)肽和蛋白。
[0284]按照一個(gè)實(shí)施方式，檢測(cè)了至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸，并且所述檢測(cè)優(yōu)選是定量的。如已提及的，其優(yōu)勢(shì)在于能測(cè)定所分析生物處理樣品中靶標(biāo)核酸的量在允許和/或需要的最大限度以上或是以下。
[0285]按照一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明所述方法具有如下L0D(檢測(cè)限):生物處理樣品中的lpg、0.5pg,優(yōu)選0.lpg、0.05pg,特別優(yōu)選0.01pg祀標(biāo)核酸,從所述生物處理樣品中分離革巴標(biāo)核酸。由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，從非常不同的生物處理樣品中高效、有效和可靠地分離甚至如此小量的靶標(biāo)核酸，并且因此能定量確定生物處理樣品中的靶標(biāo)核酸量。當(dāng)然，然而，所述生物處理樣品也可能含有顯著較高量的靶標(biāo)核酸。本發(fā)明所述方法的檢測(cè)下限的特別優(yōu)點(diǎn)在于甚至能夠檢測(cè)到如此小的量并且因此也能確保所述方法得到在Pg范圍(或更高)內(nèi)的可靠結(jié)果，即使所述生物處理樣品有顯著差異并且因此純化受到明顯阻礙。在其低LOD的基礎(chǔ)上，本發(fā)明所述方法滿足用于核酸污染物檢測(cè)的核酸純化方法的靈敏度官方要求。
[0286]在經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的任選后續(xù)檢測(cè)中，經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的回收率優(yōu)選是至少50 %，優(yōu)選至少75 %，特別優(yōu)選至少85 %。
[0287]按照一個(gè)具體的實(shí)施方式，本發(fā)明提供了用于在從純化過程得到的各種生物處理樣品中檢測(cè)至少一種靶標(biāo)核酸的方法，其中所述方法的特征在于所述靶標(biāo)核酸按照上述用于從生物處理樣品分離靶標(biāo)核酸的方法分離自需要研究的生物處理樣品并且檢測(cè)了至少一部分純化的靶標(biāo)核酸。優(yōu)選地，所述檢測(cè)是定量的，例如通過已知的擴(kuò)增技術(shù)。對(duì)于用于從生物處理樣品中分離靶標(biāo)核酸的方法的詳細(xì)內(nèi)容，參考前述公開內(nèi)容。所述方法的這種變化具有的優(yōu)勢(shì)在于靶標(biāo)核酸能夠通過本發(fā)明所述方法從各種純化過程所得生物處理樣品中分離，所述生物處理樣品優(yōu)選包括最終純化的終產(chǎn)物。如上所述，這能監(jiān)測(cè)純化的過程并且例如確保純化的終產(chǎn)物不超過需要的和/或允許的靶標(biāo)核酸量。所述靶標(biāo)核酸優(yōu)選是宿主DNA(特別是當(dāng)所述宿主細(xì)胞是永生化細(xì)胞時(shí))和/或病毒核酸。生物處理樣品、生物藥物和單獨(dú)過程步驟的實(shí)施方式的合適示例如上詳細(xì)解釋。參考相應(yīng)的公開內(nèi)容。
[0288]本發(fā)明還涉及用于制備生物處理樣品的試劑的應(yīng)用，所述生物處理樣品優(yōu)選含有一種用于后續(xù)核酸分離和/或純化以及優(yōu)選核酸檢測(cè)的生物藥物，其中所述試劑包括至少下列組分:
[0289]a.至少一種或多種包括氨基的化學(xué)物，所述化合物來自下組中的一種或多種:
[0290]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0291]i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0292]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0293]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0294]V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，優(yōu)選大小為 0.5kDa-300kDa,
[0295]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，
[0296]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的。通式(I)的化合物優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0297]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的。一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)羥基能夠以羥基烷基的形式存在。二(羥基烷基)基團(tuán)和三(羥基烷基)基團(tuán)也是合適的?；衔?II)優(yōu)選是三(羥基甲基)_5氨基甲烷(Tris)，
[0298]以及優(yōu)選至少一種或多種下列組分:
[0299]b.至少一種去污劑，
[0300]c.至少一種絡(luò)合 劑，[0301]d.至少一種蛋白。
[0302]所述試劑在預(yù)處理中的應(yīng)用優(yōu)選具有以下效果:能增加核酸純化效率并且因此能從優(yōu)選含有生物藥物的生物處理樣品中分離甚至極少量的靶標(biāo)核酸。在一些生物處理樣品的情況中，核酸純化僅僅作為使用本發(fā)明所述試劑的結(jié)果而變得可能。優(yōu)選分離之后是靶標(biāo)核酸的檢測(cè)。在此，按照本發(fā)明的應(yīng)用使得靶標(biāo)核酸的回收率能夠增加并且因此回收率為至少50%，優(yōu)選至少75%，特別優(yōu)選至少85%。
[0303]對(duì)于包括合適和優(yōu)選濃度的單獨(dú)組分在內(nèi)的試劑單獨(dú)組分以及組分組合的優(yōu)選實(shí)施方式和本發(fā)明所述試劑的優(yōu)選實(shí)施方式，參考所述試劑的上述公開內(nèi)容，尤其是已經(jīng)在本發(fā)明所述用于從樣品材料分離和/或純化核酸的第一種方法中描述的試劑，以及按照本發(fā)明的試劑。所述生物處理樣品優(yōu)選是純化部分，優(yōu)選從色譜過程中得到的純化部分。所述生物處理樣品優(yōu)選是水性樣品材料，除了需要純化的核酸以外其還包括一種或多種緩沖劑和/或鹽。關(guān)于生物處理樣品和優(yōu)選實(shí)施方式、純化部分的組成和性質(zhì)的進(jìn)一步詳細(xì)內(nèi)容結(jié)合本發(fā)明所述用于從生物處理樣品純化核酸的方法如上解釋。參考上述公開內(nèi)容。
[0304]此外，應(yīng)用本發(fā)明所述試劑和/或本發(fā)明所述方法能定量檢測(cè)分離和純化的核酸，所述核酸優(yōu)選包含于來自純化過程的純化部分中。作為本發(fā)明所述預(yù)處理的結(jié)果，優(yōu)選能降低L0D。按照本發(fā)明的應(yīng)用能夠使樣品中核酸分離的檢測(cè)限降低到至少lpg，優(yōu)選至少0.1pg并且特別優(yōu)選0.01pg的核酸。由于按照本發(fā)明的預(yù)處理，能分離甚至如此小量的核酸。當(dāng)然，較大量的核酸純化也是可能的并且由本發(fā)明的各個(gè)方面覆蓋。另外，按照本發(fā)明的預(yù)處理允許以至少50%，優(yōu)選至少75%，特別優(yōu)選至少85%的回收率純化和檢測(cè)核酸。這些驚人的檢測(cè)下限和高回收率增加了核酸純化的可靠性，因?yàn)樗鼈兇_保能夠從生物處理樣品中可靠地純化甚至微量(和當(dāng)然較大的量)的核酸。增加對(duì)于患者的安全性并且排除由少量核酸產(chǎn)生的污染是非常重要的，尤其是與生物藥物的醫(yī)藥產(chǎn)品授權(quán)/批準(zhǔn)程序相關(guān)。
[0305]本發(fā)明所述用于從樣品材料分離和/或純化核酸的方法的試劑盒包括本發(fā)明所述試劑的實(shí)施方式，其對(duì)應(yīng)于在分離和純化核酸方法內(nèi)使用的試劑的上文描述和/或?qū)?yīng)于本發(fā)明所述用于核酸分離和/或純化方法的上文描述。所述試劑盒包括以下組分中的至少一種或多種:`
[0306]1.運(yùn)載體材料，優(yōu)選含有用于分離靶標(biāo)核酸的二氧化硅、玻璃纖維、聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE。所述運(yùn)載體材料能夠以顆粒的形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)、膜和優(yōu)選作為柱填充材料使用，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式。所述珠優(yōu)選采用磁性顆粒的形式，優(yōu)選磁性珠。
[0307]i1.一種或多種用作裂解劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，
[0308]ii1.一種或多種酶，優(yōu)選蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶，
[0309]iv.一種或多種用作結(jié)合劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，以及任選至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，[0310]v.一種或多種用作洗滌劑的制劑，所述制劑優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，以及任選的離液化合物和/或任選來自非離子型表面活性劑組的去污劑，
[0311]v1.一種或多種用作洗脫劑的制劑，優(yōu)選包括緩沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑。
[0312]所述試劑盒適于手動(dòng)使用和自動(dòng)化應(yīng)用，尤其是基于膜和/或柱以及磁性珠的運(yùn)載體材料能夠?qū)嵺`自動(dòng)化。
[0313]術(shù)語“試劑”在本申請(qǐng)內(nèi)容中特定指化學(xué)組合物。術(shù)語試劑、組合物和制劑在此作為同義詞使用，除非使用它們的上下文有一些其他的意思。優(yōu)選地，所述試劑是水性組合物。
[0314]術(shù)語“核酸”和“多種核酸”以及其衍生的術(shù)語在本申請(qǐng)內(nèi)容中以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式同義使用。能用本方法分離的核酸是例如DNA、RNA、mRNA、質(zhì)粒、粘粒、線粒體，表觀遺傳修飾的、單鏈、雙鏈、環(huán)狀、游離循環(huán)、胎兒的、人工或合成的核酸，以及cDNA和其片段。按照一個(gè)實(shí)施方式，需要純化的核酸代表樣品材料尤其是例如生物處理樣品的污染。在生物處理樣品的情況中，相應(yīng)污染物示例特定是生產(chǎn)者的基因組DNA或病毒核酸。取決于本發(fā)明所述方法的步驟(c.)的實(shí)施，可純化總核酸和特定DNA或RNA。此外，能夠在設(shè)定的合適結(jié)合條件下純化短鏈核酸(例如具有< 1000bp、< 800bp、< 500bp、< 300bp ( 200bp 或< IOObp長度的任意形式的DNA和RNA，包括非編碼RNA，例如miRNA或合成核酸)。用于分離短鏈核酸的相應(yīng)條件/方法在現(xiàn)有技術(shù)中熟知并且可以相應(yīng)地按照本發(fā)明在本發(fā)明所述方法的步驟(c.)中使用。
[0315]特別優(yōu)選的實(shí)施方式再次如下描述:
[0316]按照第一個(gè)實(shí)施`方式，提供了一種用于從樣品材料中分離和/或純化核酸的方法，所述方法包括以下步驟:
[0317]a.向所述樣品材料加入試劑，其中所述試劑包括至少一種或多種含氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0318]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0319]i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0320]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0321]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0322]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0323]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，
[0324]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、
羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基燒基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0325]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0326]b.優(yōu)選混合該試劑與樣品材料，
[0327]c.從所述樣品材料中分離和/或純化核酸，所述樣品材料已經(jīng)與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合，
[0328]d.任選定量和/或定性檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離的核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)，
[0329]其中，所述方法包括以下特征中的至少一種:
[0330]1.向所述樣品材料加入的按照步驟(a.)的試劑不含離液試劑，或
[0331]I1.如果步驟(c.)中加入了至少一種含有離液劑的試劑，在步驟(c.)中加入含有離液劑的試劑在缺乏具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇的情況下第一次發(fā)生，
[0332]其中，所述具有待分離和/或純化核酸的樣品材料選自下組之一:
[0333]A.水性組合物，優(yōu)選來自純化過程的純化部分，所述組合物包括生物分子和/或生物體，其中所述生物分子和/或生物體具有至少一種下列特征:
[0334]1.所述生物分子和/或生物體選自下組:蛋白、核酸(優(yōu)選DNA、RNA、質(zhì)粒、小干擾RNA(siRNA))、病毒和/或疫苗，
[0335]i1.所述生物分子和/或生物體是藥學(xué)上活性物質(zhì)，
[0336]ii1.所述生物分子是合成或生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的，和/或
[0337]iv.所述生物分子是生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的分子，其通過遺傳修飾或未修飾的生物產(chǎn)生，
[0338]B.人或動(dòng)物體組分選自體液、體細(xì)胞和/或體組織,優(yōu)選血液、血液組分、血清、腦脊液、液體粘膜涂片(liquor mucosal smear)、痰液、尿、糞便、精液和組織樣品,其中這些身體組分包括下列分子和/或生物體中的一種或多種:
[0339]1.游離循環(huán)的人或動(dòng)物核酸，優(yōu)選游離循環(huán)的胎兒核酸、來自惡性和/或非惡性腫瘤的核酸、來自凋亡細(xì)胞的核酸、非編碼小RNA、微小RNA(miRNA)和siRNA，
[0340]i1.來自微生物的游離循環(huán)核酸，優(yōu)選來自病原體，尤其優(yōu)選來自細(xì)菌和病毒，和/或
[0341]ii1.微生物，優(yōu)選病原體，尤其優(yōu)選細(xì)菌和病毒，
[0342]C.含有細(xì)胞和/或核酸和/或生物體的法醫(yī)學(xué)樣品材料，其中所述細(xì)胞和/或核酸和/或生物體以液體樣品材料或從溶于液體的樣品材料中提取的形式存在，
[0343]和/ 或
[0344]D.一種包括樣品組分和任選生物體的組合物，其中，所述樣品組分選自食物或其組分，以及環(huán)境組分，優(yōu)選土壤、水和植物，并且任選進(jìn)行重懸。
[0345]按照第一個(gè)實(shí)施方式的方法在第二個(gè)實(shí)施方式中特征為步驟c.分離和/或純化包括至少下列子步驟:
[0346]1.任選地，在沒有支鏈或直鏈烷醇的情況下，通過向按照第一個(gè)實(shí)施方式從步驟(a.)或(a.)和(b.)得到的樣品材料與試劑的組合物中加入一種或多種酶，優(yōu)選蛋白酶K，任選與含有離液劑的試劑組合來降解蛋白和/或污染樣品組分，
[0347]i1.加入制劑，所述制劑包括至少一種離液化合物和/或至少一種來自非離子型去污劑的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，優(yōu)選用于調(diào)節(jié)或預(yù)定義用于結(jié)合核酸的結(jié)合條件。
[0348]ii1.任選混合和/或孵育，
[0349]iv.加入
[0350]包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇的制劑，
[0351]任選額外離液化合物和/或
[0352]任選來自非離子型去污劑的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，
[0353]用于調(diào)節(jié)結(jié)合核酸的結(jié)合條件，
[0354]V.使核酸結(jié)合到運(yùn)載體材料上，優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維或聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE，其 中所述運(yùn)載體材料以顆粒形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)或膜使用，優(yōu)選作為柱填充材料，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，優(yōu)選磁性顆粒，并且優(yōu)選作為磁性珠，
[0355]v1.任選地，用一種或多種制劑洗滌結(jié)合的核酸，所述制劑用作洗滌劑，優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，和任選的額外離液化合物，和/或任選來自非離子型表面活性劑的去污劑，
[0356]vi1.任選地，用一種或多種制劑洗脫，其用作洗脫劑，優(yōu)選包括緩沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑，
[0357]其中，按照所述第二個(gè)實(shí)施方式的步驟1.和i1.的制劑或按照所述第二個(gè)實(shí)施方式的步驟1.和i1.的混合物能夠以可變順序加到按照第一個(gè)實(shí)施方式的步驟(a.)，或(a.)和(b.)得到的樣品材料和試劑的組合物中。
[0358]按照第一個(gè)實(shí)施方式或第二個(gè)實(shí)施方式的方法在第三個(gè)實(shí)施方式中的優(yōu)選特征在于除了前述步驟以外，發(fā)生以下步驟中的至少一個(gè)額外步驟:
[0359]1.完成樣品材料所含細(xì)胞的裂解，其中在向按照來自第一個(gè)實(shí)施方式的步驟(a.)的樣品材料加入試劑之前進(jìn)行裂解，
[0360]i1.純化樣品材料以在向按照來自第一個(gè)實(shí)施方式的步驟(a.)的樣品材料加入試劑之前，在一個(gè)或多個(gè)連續(xù)步驟中去除樣品材料的細(xì)胞片段和/或分子和/或離子組分，其中這些步驟優(yōu)選包括色譜技術(shù)，和/或
[0361]ii1.孵育按照第一個(gè)實(shí)施方式從工藝權(quán)利要求(a.)得到的樣品材料與試劑的組合物，并且優(yōu)選混合后的樣品材料與試劑的組合物，按照第一個(gè)實(shí)施方式從工藝權(quán)利要求(a.)和(b.)得到。
[0362]按照第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)實(shí)施方式中一個(gè)或多個(gè)的所述方法在第四個(gè)實(shí)施方式中的特征為生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的生物分子通過遺傳修飾或未修飾的生物產(chǎn)生，優(yōu)選選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、魚類細(xì)胞系、植物細(xì)胞系和克隆的微生物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系優(yōu)選包括以下細(xì)胞系:人細(xì)胞系、來自馬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自牛細(xì)胞的細(xì)胞系、來自豬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自袋鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自綿羊細(xì)胞的細(xì)胞系、來自猴細(xì)胞的細(xì)胞系、來自狗細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貓細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貂鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自兔細(xì)胞的細(xì)胞系、來自倉鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自大鼠細(xì)胞的細(xì)胞系和來自小鼠細(xì)胞的細(xì)胞系，并且特別優(yōu)選細(xì)胞系Hek293 (人胚胎腎細(xì)胞系)、HeLa (人宮頸癌)、Veix)(正常成年非洲綠猴的腎臟)、MDCK (可卡犬腎)、CHO (中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、SP2 (小鼠骨髓瘤)、NSO (小鼠骨髓瘤)、和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0363]按照實(shí)施方式1-4中一個(gè)或多個(gè)的方法在第五個(gè)實(shí)施方式中特征為用于預(yù)處理的試劑也包括至少一種或多種以下組分:
[0364]-至少一種去污劑或去污劑的混合物，優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0365]-至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，
[0366]和/ 或
[0367]-至少一種蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白。
[0368]按照第六個(gè)實(shí)施方式，提供了在用于從樣品材料中分離和/或純化核酸的方法，尤其是用于制備樣品材料的方法中使用的試劑，所述試劑包括以下組分: [0369]a.至少一種或多種包括氨基的化合物，所述化合物選自一種或多種下列組:
[0370]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0371]i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0372]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0373]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0374]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0375]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，
[0376]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基燒基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0377]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0378]以及至少一種或多種下列組分:
[0379]b.至少一種去污劑或去污劑的混合物，優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚，
[0380]c.至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物，
[0381]d.至少一種蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白，
[0382]其中，如果所述試劑含有一種或多種組(1.)、(i1.)、(ii1.)和/或(v1.)的組分，所述試劑中另外包括至少一種蛋白或蛋白混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白，
[0383]其中，所述試劑不是由Tris和EDTA或Tris和EGTA組成的混合物，并且其中，如果所述組分(a.)是Tris、N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸或N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸，所述試劑不包括離液化合物。
[0384]按照第五個(gè)或第六個(gè)實(shí)施方式的方法和/或試劑優(yōu)選特征是所述去污劑選自下組中的一種或多種:
[0385]a.烷基葡糖苷，優(yōu)選來自聚山梨酯，優(yōu)選選自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，所述去污劑特別優(yōu)選是 聚山梨酯20(吐溫20)。
[0386]b.聚氧乙烯烷基苯基醚，優(yōu)選是辛苯聚醇9 (曲通X-100)和諾乃洗滌劑P-40。
[0387]按照實(shí)施方式5-7中一個(gè)或多個(gè)的方法和/或試劑按照第八個(gè)實(shí)施方式，特征在于所述絡(luò)合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(氨基乙基醚)_N，N'-四乙酸(EGTA)和乙二胺二琥珀酸(EDDS)。
[0388]按照實(shí)施方式5-8中一個(gè)或多個(gè)的方法和/或試劑按照第九個(gè)實(shí)施方式，特征在于所述蛋白選自下組中的一種或多種:
[0389]a.選自動(dòng)物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白的白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)，
[0390]b.選自動(dòng)物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白的球蛋白，優(yōu)選Y -球蛋白。
[0391]按照實(shí)施方式5-9中一個(gè)或多個(gè)的試劑和/或方法按照第十個(gè)實(shí)施方式，特征在于
[0392]a.用于樣品材料預(yù)處理的試劑具有以下特征中的至少一個(gè):
[0393]1.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合在試劑中的總濃度是5mM-500mM，優(yōu)選 25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM，
[0394]i1.試劑中去污劑的總濃度是0.1% (V / v)~5% (v / v),優(yōu)選0.2% (v / v)-4%(v / v),并且優(yōu)選 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也優(yōu)選 I % (v / v) -3% (v / v),就曲通X-100的使用而言優(yōu)選0.2% (v / v) -0.5% (v / v),就吐溫20的使用而言優(yōu)選I %(v / v)-5% (v / v)，其中所述去污劑優(yōu)選是非離子型表面活性劑，
[0395]ii1.試劑中絡(luò)合劑的總濃度是10mM-500mM，優(yōu)選IOmM-1OOmM,
[0396]iv.試劑中一種蛋白或多種蛋白的總濃度是Img / mL-100mg / mL,優(yōu)選2mg /mL-25mg / mL, 2mg / mL-10mg / mL 并且更優(yōu)選 4mg / mL-10mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言優(yōu)選2mg / mL-25mg / mL,
[0397]v.所述試劑的pH值優(yōu)選在pH3_pH9的范圍內(nèi)，
[0398]b.在樣品材料和試劑的反應(yīng)混合物中試劑的組分具有以下特征中的至少一種:
[0399]1.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合在反應(yīng)混合物中的總濃度是2.5mM-400mM，優(yōu)選 12.5mM-280mM，特別優(yōu)選 25mM-200mM，
[0400]i1.試劑中去污劑的總濃度是0.05 % (v / v)-4% (v / v),優(yōu)選0.1 % (v /v) -3% (v / v),并且優(yōu)選 0.25% (v / v) -2.5% (v / v)并且也優(yōu)選 5% (v / v) -2.5%(v / v),就曲通X-100的使用而言優(yōu)選0.1% (v / v) -0.4% (v / v),就吐溫20的使用而言優(yōu)選0.5% (v / v)-4% (v / v)，其中非離子型表面活性劑用作去污劑，
[0401]ii1.反應(yīng)混合物中絡(luò)合劑的總濃度是5mM-400mM，優(yōu)選5mM-80mM，
[0402]iv.反應(yīng)混合物中一種蛋白或多種蛋白的總濃度是0.5mg / mL_80mg / mL,優(yōu)選Img / mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 并且也優(yōu)選 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA的使用而言優(yōu)選Img / mL-20mg / mL,
[0403]c.試劑與樣品材料以以下比例混合:1+4(V試劑+V樣品材料)至4+1 (V試劑+V樣品材料)，優(yōu)選 1+2 (Vwflj+V樣品材料 )至2+1 (V試劑+V樣品材料 )，特別優(yōu)選1+1 (V_+V 樣品材料)’
[0404]d.所述試劑不包括含有總濃度> 5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽的水性制劑，
[0405]e.所述方法具有至少lpg，優(yōu)選至少0.1pg的LOD (檢測(cè)限)，
[0406]和/ 或
[0407]f.經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的回收率是至少50%，優(yōu)選至少75%，特別優(yōu)選至少85%。
[0408]按照第十一個(gè)實(shí)施方式，提供了用于從生物處理樣品中分離和/或純化至少一種靶標(biāo)核酸的方法，所述生物處理樣品優(yōu)選包括至少一種生物藥物，其特征在于所述方法包括以下步驟:
[0409]a.用試劑預(yù)處理所述生物處理樣品，其中所述試劑包括至少一種或多種有氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0410]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0411]i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0412]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0413]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0414]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0415]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)_(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，
[0416]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、
羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基燒基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0417]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0418]b.優(yōu)選混合所述試劑與生物處理樣品，
[0419]c.從所述生物處理樣品中分離和/或純化核酸，所述樣品與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合，
[0420]d.任選定量和/或定性檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0421]按照第十二個(gè)實(shí)施方式，按照第十一個(gè)實(shí)施方式的所述方法的特征是以下特征中的一個(gè)或多個(gè):
[0422]a.所述生物處理樣品是在用于生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品優(yōu)選生物藥物的純化過程中得到的純化部分，
[0423]b.所述生物藥物是藥物活性物質(zhì)，優(yōu)選包括一種或多種生物分子，
[0424]c.靶標(biāo)核酸代表生物處理樣品的污染，
[0425]d.靶標(biāo)核酸包括`來自用于生成生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的宿主細(xì)胞和或宿主生物體的DNA，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是永生化宿主細(xì)胞，
[0426]e.所述方法具有至少lpg，優(yōu)選至少0.1pg的LOD (檢測(cè)限)，
[0427]f.經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的分離和/或檢測(cè)是定量的，和/或
[0428]g.經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的回收率是至少50%，優(yōu)選至少75%，特別優(yōu)選至少85%。
[0429]按照第十三個(gè)實(shí)施方式，按照第十一個(gè)實(shí)施方式或第十二個(gè)實(shí)施方式的方法的特征在于步驟(c.)中的分離包括以下步驟的至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè):
[0430]c.1)向按照(a.)預(yù)處理的生物處理樣品中加入至少一種裂解劑，其中含有至少一種蛋白水解酶和/或離液劑的試劑作為裂解劑加入，
[0431]c.2)優(yōu)選通過結(jié)合到運(yùn)載體材料來分離靶標(biāo)核酸，其中對(duì)于結(jié)合，優(yōu)選加入包括醇和/或離液化合物的結(jié)合劑。
[0432]按照第十四個(gè)實(shí)施方式，提供了用于從獲自純化過程的不同生物處理樣品中檢測(cè)至少一個(gè)靶標(biāo)核酸的方法，其特征在于所述靶標(biāo)核酸是通過上述方法分離自需要研究的生物過程樣品并且檢測(cè)到至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸。
[0433]按照第十五個(gè)實(shí)施方式，按照第十四個(gè)實(shí)施方式的方法的特征是以下特征中的一個(gè)或多個(gè):
[0434]a.用于生物處理樣品預(yù)處理的試劑包括以下特征中的至少一個(gè):
[0435]1.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合在試劑中的總濃度是5mM-500mM，優(yōu)選 25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM，
[0436]i1.試劑中去污劑的總濃度是0.1% (V / v)~5% (v / v),優(yōu)選0.2% (v / v)-4%(v / v),并且優(yōu)選 0.5% (v / v) -3% (v / v)并且也優(yōu)選 I % (v / v) -3% (v / v),就是用曲通X-1OO而言優(yōu)選0.2% (V / v) -0.5% (V / V),就是用吐溫20而言優(yōu)選I % (v /v)-5% (v / v)，所述一種或多種去污劑優(yōu)選是非離子型表面活性劑并且特別優(yōu)選選自第七個(gè)實(shí)施方式中定義的去污劑，
[0437]ii1.試劑中絡(luò)合劑的總濃度是10mM-500mM，優(yōu)選IOmM-1OOmM,優(yōu)選地，所述絡(luò)合劑選自第八個(gè)實(shí)施方式中定義的絡(luò)合劑，
[0438]iv.試劑中蛋白的總濃度是 Img / mL-100mg / mL,優(yōu)選 2mg / mL_25mg / mL,2mg / mL-10mg / mL并且也優(yōu)選4mg / mL-10mg / mL,就IgG和BSA的使用而言優(yōu)選2mg /mL-25mg / mL,優(yōu)選地,所述蛋白選自第九個(gè)實(shí)施方式中定義的蛋白，
[0439]V.所述試劑的pH值優(yōu)選在pH3_pH9的范圍內(nèi)，和/或
[0440]v1.所述試劑是按照實(shí)施方式6-10中一個(gè)或多個(gè)的試劑，
[0441]b.在按照第十一個(gè)實(shí)施方式從步驟(a.)得到的生物處理樣品和試劑的反應(yīng)混合物中，所述試劑的組分具有以下特征中的至少一種:
[0442]1.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合的總濃度是2.5mM-400mM，優(yōu)選 12.5mM-280mM，特別優(yōu)選 25mM-200mM，
[0443]i1.反應(yīng)混合物中去污劑的總濃度是0.05% (v / v)-4% (v / v)，優(yōu)選0.1 %(v / v)-3 % (v / v ),并且優(yōu)選 0.25 % (v / v)-2.5 % (v / v)并且也優(yōu)選 5% (v /v) -2.5% (v / v),就曲通 X-100 的使用而言優(yōu)選 0.1 % (v / v) -0.4% (v / v),就吐溫 20的使用而言優(yōu)選0.5% (v / v)-4% (v / v)，優(yōu)選地，所述去污劑是非離子型表面活性劑并且特別優(yōu)選選自第七個(gè)實(shí)施方式中定義的去污劑，
[0444]ii1.反應(yīng)混合物中絡(luò)合劑的總濃度是5mM-400mM，優(yōu)選5mM-80mM，和/或
[0445]iv.反應(yīng)混合物中試劑所含蛋白的總濃度是0.5mg / ml / mL_80mg / mL,優(yōu)選Img / mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 并且也優(yōu)選 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA的使用而言優(yōu)選Img / mL-20mg / mL,
[0446]c.在步驟(a.)中，所述試劑與所述生物處理樣品材以下列比例混合:1+4(V試劑+V樣品材料)至4+1 (V試劑+V樣品材料)，優(yōu)選1+2 (V試劑+V樣品材料)至2+1 (V試劑+V樣品材料)，特別優(yōu)選1+1 (V試劑+V樣品材料)，
[0447]和/ 或
[0448]d.所述試劑不包括含有總濃度> 5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽的水性制劑。
[0449]按照第十六個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及使用試劑以制備用于后續(xù)核酸分離和/或純化的含有生物藥物的生物處理樣品，其特征在于所述試劑包括以下組分:
[0450]a.至少一種或多種包括氨基的化學(xué)物，所述化合物選自下組中的一種或多種:
[0451]1.極性-中性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，
[0452]i1.非極性-疏水性蛋白性a -氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸，
[0453]ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，
[0454]iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸，
[0455]V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸，
[0456]v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體，
[0457]vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基燒基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2> R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine),
[0458]vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)，
[0459]以及任選的一種或多種以下組分:
[0460]b.至少一種去污劑，
[0461]c.至少一種絡(luò)合劑，
[0462]d.至少一種蛋白， [0463]其中所述試劑優(yōu)選是按照實(shí)施方式6-10的試劑。
[0464]按照第十七個(gè)實(shí)施方式，提供了用于從樣品材料分離和/或純化核酸的試劑盒，其含有按照實(shí)施方式6-10中一個(gè)或多個(gè)的試劑。
[0465]按照第十八個(gè)實(shí)施方式，按照第十七個(gè)實(shí)施方式的試劑盒優(yōu)選包括至少一種或多種以下組分:
[0466]a.用于分離靶標(biāo)核酸的運(yùn)載體材料，優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維或聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述運(yùn)載體材料以顆粒形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)或膜使用，優(yōu)選作為柱填充材料，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，優(yōu)選磁性顆粒，更優(yōu)選作為磁性珠，
[0467]b.一種或多種用作裂解劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，
[0468]c.一種或多種酶，優(yōu)選蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶，
[0469]d.一種或多種用作結(jié)合劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，以及任選至少一種具有
1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，
[0470]e.一種或多種用作洗滌劑的制劑，所述制劑優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，以及任選的離液化合物和/或任選來自非離子型表面活性劑組的去污劑，
[0471]f.一種或多種用作洗脫劑的制劑，優(yōu)選包括緩沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑。實(shí)施例
[0472]本發(fā)明的可能實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)通過實(shí)施例方式在下列部分中描述。如下所述完成這些實(shí)施例。
[0473]實(shí)施例1:使用本發(fā)明所述試劑從各種純化緩沖液中提取真核DNA
[0474]包括待分離和純化核酸的起始樣品是來自純化緩沖液的溶液，其通常在柱色譜方法中使用，并且對(duì)于這個(gè)測(cè)試，向其中加入限定量的來自CHO細(xì)胞的經(jīng)純化染色體DNA。此樣品是常規(guī)生物處理樣品的良好模型體系。磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液用作純化緩沖液:a)PBS pH7，b)含IM NaCl的PBS，pH7以及c)檸檬酸鹽緩沖液pH3。這些樣品的一部分另外與本發(fā)明所述試劑混合。所有樣品然后經(jīng)過自動(dòng)化的核酸分離和純化。在定量PCR(qPCR)中檢測(cè)所得的核酸量。
[0475]下列方案如下:
[0476]在每種情況下，將來自CHO細(xì)胞的Ipg DNA加入到200 U I純化緩沖液中。另外，在每種情況下，100 U I純化緩沖液與來自CHO細(xì)胞的Ipg DNA混合，然后與100 yl本發(fā)明所述試劑(此處:0.1M甘氨酸溶液，pH3.2)混合。所得的樣品用于后續(xù)自動(dòng)化的核酸分離和純化，其使用QIAsymphony病毒/細(xì)菌試劑盒(恰根(QIAGEN))在QIAsymphony自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)機(jī)(QIAsymphony automatic laboratory automat)(恰根)上進(jìn)行。然后，通過定量實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)洗脫液中分離的DNA。
[0477]圖1顯示了所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖:
[0478]通過在核酸分離和純化之前向由純化緩沖液(PBS、PBS+1M NaCl或檸檬酸鹽緩沖液)和真核DNA組成的樣品中加入本發(fā)明所述試劑，顯著增加了核酸產(chǎn)率。這能夠從與未用本發(fā)明所述試劑預(yù)處理的樣品(ct=39.6-40)相比，這些樣品明顯較低的ct (閾值循環(huán))值(ct = 35.5-36.5)看出。在含有檸檬酸鹽緩沖液的部分中的DNA顯示處于PCR-陰性-對(duì)照/非模版對(duì)照(NTC)區(qū)域的信號(hào)，例如沒有核酸能夠被分離并且因此檢測(cè)到。只有在用本發(fā)明所述試劑處理之后，核酸能夠從含有檸檬酸鹽緩沖液的樣品中提取并且檢測(cè)到。結(jié)果顯示，盡管起始樣品有非常不同的性質(zhì)，按照本發(fā)明的預(yù)處理不僅具有以下效果，即在一些情況下核酸的分離變得完全可能，而且用所有樣品實(shí)現(xiàn)了相似的良好結(jié)果。
[0479]實(shí)施例2:通過加入各種試劑從相同的純化緩沖液中提取真核DNA
[0480]有待分離核酸的起始樣品是來自純化緩沖液的同種溶液，其通常在離子交換色譜中使用，并且對(duì)于這個(gè)測(cè)試，向其中加入限定量的來自CHO細(xì)胞的經(jīng)純化染色體DNA。磷酸鹽緩沖液用作純化緩沖液:含有IM NaCl的PBS，pH7。能視作模型生物處理樣品的這些樣品另外與以下制劑之一混合:在兩個(gè)實(shí)施方式中按照本發(fā)明的試劑或磷酸鹽緩沖液。所有樣品然后經(jīng)過自動(dòng)化的核酸分離和純化。在定量PCR中檢測(cè)所得的核酸量。
[0481]下列方案如下:
[0482]在每種情況下，將來自CHO細(xì)胞的IpgDNA加入到三份有200 U I純化緩沖液的制劑中。然后，這些制劑與SOOiil的以下溶液之一混合:
[0483]1.本發(fā)明所述制劑，按照一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式(0.1M甘氨酸-甘氨酸，pH3.2)，
[0484]2?來自QIAsymphony病毒/細(xì)菌試劑盒(恰根)的裂解緩沖液，如本發(fā)明所述試劑的一個(gè)可能實(shí)施方式，
[0485]3.PBS，pH7.2。
[0486]然后如實(shí)施例1中所述，進(jìn)行自動(dòng)化的核酸分離和純化。應(yīng)注意的是，雖然純化試劑盒的裂解緩沖液已經(jīng)用于按照本發(fā)明的預(yù)處理，但是按照2.在后續(xù)核酸純化中，完成如實(shí)施例1所述的完整純化步驟，例如在核酸純化中再次使用所述裂解緩沖液。通過實(shí)時(shí)qPCR并且通過與先前所制備標(biāo)準(zhǔn)系列的比較來完成洗脫液中經(jīng)分離核酸的檢測(cè)和純化，對(duì)此也使用來自CHO細(xì)胞的純化DNA。
[0487]圖2和圖3顯示了所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖:
[0488]如實(shí)施例 1 (圖1)所示，圖2也顯示了由于使用本發(fā)明所述試劑對(duì)由純化緩沖液(PBS+1M NaCl)組成的樣品與真核DNA進(jìn)行預(yù)處理，因此核酸產(chǎn)率顯著增加。在后續(xù)進(jìn)行樣品的進(jìn)一步消化和核酸的分離(使用QIAsymphony病毒/細(xì)菌方法，見上)之前，出于樣品預(yù)處理目的而加入已知裂解緩沖液已經(jīng)使ct值降至38。本發(fā)明所述試劑的優(yōu)選實(shí)施方式引起甚至更為顯著降低ct值至36。相對(duì)高許多的ct值(ct = 40)，其在加入PBS代替本發(fā)明所述試劑的樣品(并且因此沒有經(jīng)過按照本發(fā)明進(jìn)行預(yù)處理)中檢測(cè)到，顯示出從該樣品中分離和純化得到量小得多的核酸。純磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)于核酸分離具有抑制效果，從而如同純檸檬酸鹽緩沖液樣品(參見實(shí)施例1)，在PCR-陰性-對(duì)照(NTC)的區(qū)域檢測(cè)到信號(hào)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)也明顯證明了在從典型生物處理樣品例如純化部分中分離核酸時(shí)可能出現(xiàn)問題，因?yàn)榛诔Ｓ玫募兓彌_液，使用標(biāo)準(zhǔn)方法的經(jīng)典純化是不可能的。用來自純化試劑盒的裂解劑進(jìn)行額外預(yù)處理已經(jīng)允許核酸的分離，但是程度小于用本發(fā)明所述試劑的更優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行預(yù)處理。圖3顯示加入裂解劑產(chǎn)生13%的核酸回收率，而加入本發(fā)明所述試劑的優(yōu)選實(shí)施方式產(chǎn)生57%的回收率，并且因此實(shí)現(xiàn)了 DNA產(chǎn)率的顯著增加。
[0489]來自實(shí)施例1和實(shí)施例2的結(jié)果提供了證據(jù)，即作為在后續(xù)分離核酸之前用本發(fā)明所述試劑預(yù)處理樣品的結(jié)果，在來自不同純化緩沖液的核酸回收率方面實(shí)現(xiàn)了顯著增加，所述緩沖液通常用于采用柱色譜的純化方法。有時(shí)，只有通過按照本發(fā)明的預(yù)處理，核酸分離才變得可能。結(jié)果也顯示使用經(jīng)典分離和純化方法而沒有用本發(fā)明所述試劑預(yù)處理樣品不能就樣品而言實(shí)現(xiàn)核酸分離，在所述樣品中待分離核酸包含于例如純的含有磷酸鹽或含有檸檬酸鹽的純化緩沖液中。相反，高磷酸鹽和檸檬酸鹽含量對(duì)于核酸分離以及因此對(duì)于洗脫液中核酸回收具有抑制效果。因此，來自生物處理樣品的核酸純化在沒有特別措施的情況下通常是不可能的，尤其是當(dāng)所述樣品僅含有少量的核酸時(shí)。
[0490]通過使用按照本發(fā)明的試劑和方法，在經(jīng)分離核酸產(chǎn)率方面有顯著的改善，其反映為例如明顯增加的核酸回收率，所述核酸僅僅以小量存在。由于其靈敏性，按照本發(fā)明的方法因此提供了關(guān)于在生物藥物活性物質(zhì)純化中和之后殘余宿主細(xì)胞DNA和/或其他核酸污染物含量的可靠得多的信息，尤其是當(dāng)純化部分中僅僅存在極少小量的污染核酸(例如宿主生物體的核酸)。用僅Ipg DNA /樣品成功地進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)，例如是IOpg宿主細(xì)胞DNA /劑藥物產(chǎn)品的官方推薦限度的十分之一。因此使用按照本發(fā)明的試劑和方法代表了非常靈敏、高效、有效和可靠的核酸分離和純化方法，其特別適于針對(duì)少量殘余宿主細(xì)胞核酸定量監(jiān)測(cè)和評(píng)估生物處理樣品的純化過程直到最終產(chǎn)物。
[0491]實(shí)施例3:通過本發(fā)明所述試劑的方式，在蛋白影響下從等份相同純化緩沖液提取真核DNA[0492]用于該測(cè)試的起始樣品是來自純化緩沖液的溶液，向所述溶液中加入定義量的來自CHO細(xì)胞的經(jīng)純化染色體DNA。如實(shí)施例2所示，使用的純化緩沖液是通常在柱色譜方法中使用的磷酸鹽緩沖液:含有IM NaCl的PBS，pH7。也能視作模型生物處理樣品的這些樣品與本發(fā)明所述含有蛋白的試劑混合，測(cè)試僅僅蛋白濃度不同的試劑的各種實(shí)施方式。
[0493]下列方案如下:
[0494]在每種情況下，將來自CHO細(xì)胞的Ipg DNA加入到四份有200 U I純化緩沖液的制劑中。然后這些制劑與800 ill的0.2M N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸溶液混合，該溶液含有0、5、50或IOOmg / ml濃度的BSA。然后進(jìn)行如實(shí)施例1所述的自動(dòng)化核酸分離和純化以及后續(xù)分析。
[0495]圖4顯示向本發(fā)明所述試劑加入BSA使得核酸回收率顯著增加超過10%。試劑中5mg / ml BSA的濃度足以達(dá)到效果。進(jìn)一步顯著提高蛋白濃度并不顯示出對(duì)于回收率的任意其他正面效應(yīng)。結(jié)果顯示，氨基化合物與蛋白的組合會(huì)帶來本發(fā)明所述試劑有效性的優(yōu)化。
[0496]實(shí)施例4:通過本發(fā)明所述試劑和各種蛋白的方式，在從等份的相同純化緩沖液提取真核DNA
[0497]用于此測(cè)試的起始樣品是兩種不同的純化緩沖液，向其中加入限定量的來自CHO細(xì)胞的經(jīng)純化染色體DNA以及限定量的蛋白，其中使用蛋白BSA和IgG。使用的純化緩沖液是通常在柱-色譜方法中使用的磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液:含有IM NaCl的PBS，pH7和檸檬酸鹽，pH3.2。然后制備的樣品與本發(fā)明所述試劑混合用于后續(xù)的核酸分離和純化。
[0498]下列方案如下:`[0499]在每種情況下，將來自CHO細(xì)胞的IpgDNA加入到兩份有200 ill PBS(含有IMNaCl)的制劑和三份有檸檬酸鹽的制劑中，從而得到基于所用純化緩沖液的模型生物處理樣品。在每種情況中隨后向一份PBS制劑和一份檸檬酸鹽制劑加入5mg / mL IgG,而向另一份檸檬酸鹽制劑加入5mg / mL BSA。向每個(gè)如此安排的測(cè)試制劑中加入800 的0.2MN，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸溶液。然后如實(shí)施例1所述進(jìn)行核酸的分離和純化以及后續(xù)分析。
[0500]圖5以圖形證明了實(shí)施例3的結(jié)果。向生物過處理型樣品加入BSA以及IgG對(duì)于所加入DNA的核酸回收率具有顯著正面效應(yīng)，其中IgG的正面效應(yīng)與BSA的正面效應(yīng)相比甚至稍高，高出15%的回收率。此外，實(shí)施例3和實(shí)施例4的結(jié)果顯示對(duì)于核酸回收率的正面效應(yīng)能夠以兩種方式實(shí)現(xiàn):a)通過將蛋白和有氨基化合物的本發(fā)明所述試劑連續(xù)加入模型生物處理樣品(實(shí)施例4)，或b)通過一步加入，其中本發(fā)明所述試劑包含蛋白和氨基化合物的組合。
[0501]實(shí)施例5:通過加入本發(fā)明所述試劑的各種制劑從等份的相同純化緩沖液中提取真核DNA
[0502]具有待分離和純化核酸的起始樣品是來自純化緩沖液的相同溶液，向所述溶液中加入限定量的來自CHO細(xì)胞的經(jīng)純化染色體DNA。如實(shí)施例1-4，使用的純化緩沖液是通常在柱-色譜方法中用作純化緩沖液的磷酸鹽緩沖液:含有IM NaCl的PBS，pH7。能視作模型生物處理樣品的這些樣品另外與以下制劑之一混合:在13個(gè)不同的實(shí)施方式中提供自身具有DNA或本發(fā)明所述試劑的樣品。所有樣品隨后經(jīng)過自動(dòng)化的核酸分離和純化。在定量PCR中檢測(cè)所得的核酸量。
[0503]下列方案如下:
[0504]在每種情況下，將來自CHO細(xì)胞的Ipg DNA加入到14種制劑中，所述制劑各具有
500 U I的純化緩沖液。然后，這些制劑與500 ill的以下溶液之一混合:
[0505]1.有IM NaCl的PBS純化緩沖液，pH7，含有來自CHO細(xì)胞的Ipg DNA,
[0506]2.試劑 Gl
[0507]3.試劑 G2
[0508]4.試劑 GGl
[0509]5.試劑 GG2
[0510]6.試劑 GG3
[0511]7.試劑 BI
[0512]8.試劑 B2
[0513]9.試劑 B3
[0514]10.試劑 B4
[0515]11?試劑 Tl
[0516]12.試劑丁2
[0517]13.試劑丁3
[0518]14?試劑 T4，
[0519]其中溶液2-14代表具有表1所列組分的本發(fā)明所述試劑的各個(gè)實(shí)施方式。
[0520]表1:
[0521]本發(fā)明所述試劑的各種實(shí)施方式
[0522]
【權(quán)利要求】
1.一種從樣品材料中分離和/或純化核酸的方法，其中所述樣品材料是生物處理樣品并且其中所述生物處理樣品是在用于生物技術(shù)產(chǎn)品的純化過程中得到的純化部分并且所述待分離核酸代表所述生物處理樣品的污染，其中所述方法包括以下步驟: a.向所述樣品材料加入試劑，其中所述試劑包括至少一種或多種含氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種: 1.極性-中性蛋白性α-氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸， ?.非極性-疏水性蛋白性α-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸， ii1.堿性α-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，選自丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸， v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體， vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基烷基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine), vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)， b.優(yōu)選混合該試劑與樣品材料， c.從所述樣品材料中分離和/或純化核酸，所述樣品材料已經(jīng)與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合， d.任選定量和/或定性檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離的核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物技術(shù)產(chǎn)品是生物藥物并且待分離的污染核酸是用于生成所述生物藥物的宿主細(xì)胞的核酸和/或是病毒核酸并且其中實(shí)施檢測(cè)步驟d.以分析這種污染核酸是否包含于所述生物處理樣品中。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下特征中的至少一種: .1.向所述樣品材料加入的按照步驟(a.)的試劑不含離液試劑，或 I1.如果在步驟(C.)中加入了至少一種含有離液劑的試劑，步驟(c.)中加入含有離液劑的試劑在缺乏具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇情況下第一次發(fā)生，并且其中，具有待分離和/或純化核酸的所述樣品材料是水性組合物，即來自用于生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品的純化過程的純化部分，包括生物分子和/或生物體，其中所述生物分子和/或生物體具有以下特征中的至少一種:L.所述生物分子和/或生物體選自蛋白、病毒和/或疫苗， i1.所述生物分子和/或生物體是藥學(xué)上活性物質(zhì)， ii1.所述生物分子是生物技術(shù)學(xué)產(chǎn)生的分子，其通過遺傳修飾或未修飾的生物產(chǎn)生。
4.如權(quán)利要求1-3中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟c.的分離和/或純化包括至少以下子步驟: L.任選地，優(yōu)選在沒有支鏈或直鏈烷醇的情況下，通過向如權(quán)利要求1所述步驟(a.)，或(a.)和(b.)得到的樣品材料與試劑的組合物中加入一種或多種酶，優(yōu)選蛋白酶K，任選與含有離液劑的試劑聯(lián)用來降解蛋白和/或污染樣品組分， i1.加入制劑，所述制劑包括至少一種離液化合物和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，優(yōu)選用于調(diào)節(jié)或預(yù)定義用于結(jié)合核酸的結(jié)合條件， ii1.任選混合和/或孵育， iv.加入 包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈烷醇的制劑， 任選額外離液化合物和/或 任選來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分，并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分， 用于調(diào)節(jié)結(jié)合核酸的結(jié)合條件， V.使核酸結(jié)合運(yùn)載體材料，優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維或聚亞烷基，例如PP、PE /PP、PE，其中所述運(yùn)載體材料以顆粒形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)或膜使用，優(yōu)選作為柱填充材料，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，優(yōu)選磁性顆粒，并且優(yōu)選作為磁性珠， v1.任選用一種或多種制劑洗滌結(jié)合的核酸，所述制劑用作洗滌劑，優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，和任選額外的離液化合物，和/或任選來自非離子型表面活性劑組的去污劑， vi1.任選用一種或多種制劑洗脫，其用作洗脫劑，優(yōu)選包括緩沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑， 其中，如權(quán)利要求4所述的步驟1.和i1.的制劑或如權(quán)利要求4所述的1.和i1.的混合物能夠以可變順序加到如權(quán)利要求1所述(a.)或(a.)和(b.)得到的樣品材料和試劑的組合物中。
5.如權(quán)利要求1-4中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，除了前述步驟以外，發(fā)生以下步驟中的至少一個(gè)額外步驟: 1.完成樣品材料中含有的細(xì)胞的裂解，其中在向如權(quán)利要求1步驟(a.)所述的樣品材料加入試劑之前進(jìn)行裂解， i1.純化所述樣品材料以在向如權(quán)利要求1步驟(a.)所述樣品材料加入試劑之前，在一個(gè)或多個(gè)連續(xù)步驟中去除樣品材料的細(xì)胞片段和/或分子和/或離子組分，其中這些步驟優(yōu)選包括色譜技術(shù)，和/或 iii.孵育從如權(quán)利要求1所述工藝權(quán)利要求(a.)得到的樣品材料與試劑的組合物，并且優(yōu)選混合后的樣品材料與試劑的組合物，所述組合物從如權(quán)利要求1所述的工藝權(quán)利要求(a.)和(b.)得到。
6.如權(quán)利要求1-5中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的生物分子通過遺傳修飾或未修飾的生物產(chǎn)生，優(yōu)選選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、魚類細(xì)胞系、植物細(xì)胞系和克隆的微生物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系優(yōu)選包括以下細(xì)胞系:人細(xì)胞系、來自馬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自牛細(xì)胞的細(xì)胞系、來自豬細(xì)胞的細(xì)胞系、來自袋鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自綿羊細(xì)胞的細(xì)胞系、來自猴細(xì)胞的細(xì)胞系、來自狗細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貓細(xì)胞的細(xì)胞系、來自貂鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自兔細(xì)胞的細(xì)胞系、來自倉鼠細(xì)胞的細(xì)胞系、來自大鼠細(xì)胞的細(xì)胞系和來自小鼠細(xì)胞的細(xì)胞系，并且特別優(yōu)選細(xì)胞系Hek293 (人胚胎腎細(xì)胞系)、HeLa(人宮頸癌)、Vero (正常成年非洲綠猴的腎臟)、MDCK(可卡犬腎)、CHO (中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、SP2(小鼠骨髓瘤)、NS0(小鼠骨髓瘤)、雜交瘤細(xì)胞系和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
7.一種用于從生物處理樣品中分離和/或純化至少一種靶標(biāo)核酸的方法，其中所述生物處理樣品是在用于生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的純化過程中得到的純化部分并且其中所述靶標(biāo)核酸代表所述生物處理樣品的污染，其特征在于所述方法包括以下步驟: a.用試劑預(yù)處理所述生物處理樣品，其中所述試劑包括至少一種或多種具有氨基的化合物，所述化合物選自下組中的一種或多種: i.極性-中性蛋白性α-氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸， ii.非極性-疏水性蛋白性α-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸， iii.堿性α-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，選自丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸， vi.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體， vii.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基烷基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、!?2、!?3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine), viii.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)， b.優(yōu)選混合所述試劑與生物處理樣品， c.從所述生物處理樣品中分離和/或純化核酸，所述樣品與所述試劑接觸和/或與所述試劑混合， d.任選定量和/或定性檢測(cè)至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸，優(yōu)選通過擴(kuò)增待檢測(cè)核酸片段進(jìn)行定量檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(c.)的分離包括以下步驟中的至少一種，優(yōu)選兩種: c.1)向按照(a.)預(yù)處理的生物處理樣品中加入至少一種裂解劑，其中含有至少一種蛋白水解酶和/或離液劑的試劑作為裂解劑加入， c.2)優(yōu)選通過結(jié)合到運(yùn)載體材料來分離靶標(biāo)核酸，其中對(duì)于結(jié)合，優(yōu)選加入包括醇和/或離液化合物的結(jié)合劑。
9.一種用于從來自純化過程的不同生物處理樣品中檢測(cè)至少一個(gè)靶標(biāo)核酸的方法，其特征在于所述靶標(biāo)核酸通過如權(quán)利要求7或8所述的方法分離自待研究的生物處理樣品并且檢測(cè)到至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸。
10.如權(quán)利要求 1-9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述下列特征中的一種或多種: a.所述生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品是生物藥物， b.所述生物處理樣品包括生物藥物，其中所述生物藥物是包括一種或多種生物分子的藥物活性物質(zhì)， c.所述生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品是生物藥物，其中所述生物藥物不是核酸并且其中優(yōu)選地，所述生物藥物是肽或蛋白， d.所述生物處理樣品包括純化和/或配制的生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品優(yōu)選是生物藥物。
11.如權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述純化部分具有以下特征中的一種或多種: a.所述純化部分基本不含細(xì)胞， b.所述純化部分是色譜洗脫液，和/或 c.除待分離的靶標(biāo)核酸以外，所述純化部分還包括作為生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的生物藥物、一種或多種緩沖液物質(zhì)和/或鹽。
12.如權(quán)利要求1-11中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的至少一種: a.所述靶標(biāo)核酸包括來自用于生成生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的宿主細(xì)胞和/或宿主生物體的DNA，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是永生化宿主細(xì)胞， b.所述目標(biāo)核酸是用于生成生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的宿主細(xì)胞的核酸，尤其是宿主細(xì)胞DNA，和/或是病毒核酸。
13.如權(quán)利要求1-12中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的一種或多種:a.所述方法具有至少lpg，優(yōu)選至少0.1pg的LOD (檢測(cè)限)， b.經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的分離和/或檢測(cè)是定量的，和/或 c.經(jīng)分離靶標(biāo)核酸的回收率是至少50%，優(yōu)選至少75%，特別優(yōu)選至少85%。
14.如權(quán)利要求1-13中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征中的一種或多種: a.所述靶標(biāo)核酸分離自從用于生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的純化過程中得到的不同純化部分， b.在純化的終產(chǎn)物和/或在一個(gè)或多個(gè)純化工藝過程所得生物處理樣品中檢測(cè)用于生成所述生物藥物的細(xì)胞的剩余核酸和/或其他核酸污染物，和/或 c.所述靶標(biāo)核酸分離自所述純化過程的各種或每個(gè)純化部分，包括最終純化的終產(chǎn) 物。
15.如權(quán)利要求1-14中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法具有一種或多種以下特征: a.實(shí)施所述方法用于監(jiān)測(cè)純化的過程， b.實(shí)施所述方法用于分析經(jīng)純化終產(chǎn)物中含有的污染靶標(biāo)核酸量沒有超過需要和/或允許的量，和/或 c.檢測(cè)到至少一部分經(jīng)分離的靶標(biāo)核酸并且確定所分析的生物處理樣品中污染靶標(biāo)核酸的量是否在允許和/或需要的最大限度之上或之下。
16.如權(quán)利要求1-15中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述用于預(yù)處理的試劑也包括至少一種或多種以下組分: -至少一種去污劑或去污劑的混合物，優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚， -至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物， 和/或 -至少一種蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白優(yōu)選是優(yōu)選選自白蛋白和/或球蛋白的球狀蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述去污劑選自下組中的一種或多種: a.烷基葡糖苷,優(yōu)選選自聚山梨酯,優(yōu)選選自聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，所述去污劑特別優(yōu)選是聚山梨酯20(吐溫20)。 b.聚氧乙烯烷基苯基醚，優(yōu)選是辛苯聚醇9(曲通X-100)和諾乃洗滌劑P-40。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述絡(luò)合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(氨基乙基醚)-N，N'-四乙酸(EGTA)和乙二胺二琥珀酸(EDDS)。
19.如權(quán)利要求16-18中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白選自下組中的一種或多種: a.選自動(dòng)物白蛋白、植物白蛋白和/或人白蛋白的白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA), b.選自動(dòng)物球蛋白、植物球蛋白和/或人球蛋白的球蛋白，優(yōu)選Y-球蛋白。
20.如權(quán)利要求1-19中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于 a.用于樣品材料預(yù)處理的試劑具有以下特征中的至少一個(gè): i.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合在試劑中的總濃度是5mM-500mM，優(yōu)選 25mM-350mM，特別優(yōu)選 50mM-250mM， i1.試劑中去污劑的總濃度是0.1 % (V / v)-5% (v / v),優(yōu)選0.2% (v / v) -4%(v / v),并且優(yōu)選 0.5% (v / v)-3% (v / v)且也優(yōu)選 I % (v / v) -3% (v / v),就曲通X-100的使用而言優(yōu)選0.2% (v / v) -0.5% (v / v),就吐溫20的使用而言優(yōu)選I % (v /v)-5% (v / v)，其中所述去污劑優(yōu)選是非離子型表面活性劑， ii1.試劑中的絡(luò)合劑的總濃度是10mM-500mM，優(yōu)選IOmM-1OOmM, iv.試劑中一種蛋白或多種蛋白的總濃度是Img/ mL-100mg / mL,優(yōu)選2mg /mL-25mg / mL, 2mg / mL-10mg / mL 并且更優(yōu)選 4mg / mL-10mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言優(yōu)選2mg / mL-25mg / mL, v.所述試劑的pH值優(yōu)選在pH3-pH9的范圍內(nèi)， b.在樣品材料和試劑的反應(yīng)混合物中試劑的組分具有至少一種以下特征:I.包括氨基的化合物和/或各種這些化合物的組合在反應(yīng)混合物中的總濃度是,2.5mM-400mM，優(yōu)選 12.5mM-280mM，特別優(yōu)選 25mM-200mM， i1.試劑中去污劑的總濃度是0.05% (V / v) -4% (v / v),優(yōu)選0.1% (v / v) -3%(v / v),并且優(yōu)選 0.25% (v / v) -2.5% (v / v)且也優(yōu)選 5% (v / v) -2.5% (v / v)，就曲通X-100的使用而言優(yōu)選0.1% (v / v)-0.4% (v / v),就吐溫20的使用而言優(yōu)選，0.5% (v / v)-4% (v / v)，其中非離子型表面活性劑用作去污劑， ii1.反應(yīng)混合物中絡(luò)合劑的總濃度是5mM-400mM，優(yōu)選5mM-80mM， iv.反應(yīng)混合物中一種蛋白或多種蛋白的總濃度是0.5mg / mL-80mg / mL,優(yōu)選Img /mL-20mg / mL, Img / mL-8mg / mL 且也優(yōu)選 2mg / mL-8mg / mL,就 IgG 和 BSA 的使用而言優(yōu)選 Img / mL-20mg / mL, c.所述試劑與所述樣品材料以下列比例混合:1+4(V試劑+V樣品材料)至4+1(V試劑+V樣品材料)，優(yōu)選1+2 (V試劑+V
樣品材料 )至2+1 (V試劑+V

樣品材料 )，特別優(yōu)選1+1 (V_+V樣品材料)，和/或 d.所述試劑不包括含有總濃 度>5mM的磷酸鹽和/或檸檬酸鹽的水性制劑。
21.如權(quán)利要求1-20中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑包括至少一種或多種含氨基的化合物，所述化合物選自下組1-viii中的一種或多種: ，1.天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸， i1.丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸， ii1.精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸， iv.^ -丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸， V.聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸， v1.甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體、甘氨酸四聚體和二肽(Ala-Glu)， vi1.N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine), 和/或 vii1.三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)。
22.如權(quán)利要求1-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑包括至少一種選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)、N,N_二(2-羥基乙基)甘氨酸(bicine)和三(羥基甲基)-氨基甲烷(Tris)的化合物作為含氨基的化合物。
23.如權(quán)利要求1-22中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑至少包括甘氨酸、Gly-Gly、N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸和/或N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸作為含氨基的化合物，至少一種絡(luò)合劑，以及至少一種，優(yōu)選至少兩種去污劑和任選至少一種蛋白。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述試劑包括N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述用于步驟(a.)的試劑包括聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚山梨酯作為去污劑。
26.如權(quán)利要求23-25中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑包括至少一種蛋白，優(yōu)選球狀蛋白，更優(yōu)選選自IgG或BSA的蛋白。
27.如權(quán)利要求1-26中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述用于步驟(a.)中預(yù)處理的試劑沒有任何裂解性質(zhì)。
28.一種在用于從樣品材料中分離和/或純化核酸，尤其是用于所述樣品材料制備的方法中使用的試劑，其中所述樣品材料是生物處理樣品并且其中所述生物處理樣品是在用于生物技術(shù)學(xué)所生產(chǎn)產(chǎn)品的純化過程中得到的純化部分并且其中所述待分離核酸代表所述生物處理樣品的污染，所述試劑包括以下組分: a.至少一種或多種包括氨基的化合物，所述化合物選自一種或多種下列組: I.極性-中性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸，II非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸， III.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括在(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸， v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體， viI.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基烷基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2、R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine), viiI.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)， 和 b.至少一種去污劑或去污劑的混合物，優(yōu)選選自非離子型表面活性劑，包括烷基葡糖苷和/或聚氧乙烯烷基苯基醚， c.任選至少一種絡(luò)合劑或絡(luò)合劑的混合物， 和 d.至少一種蛋白或蛋白的混合物，其中所述蛋白選自白蛋白和/或球蛋白。
29.如權(quán)利要求28所述的試劑，其特征在于，所述試劑還具有一種或多種如權(quán)利要求16-27所限定的特征。
30.用于制備含有生物藥物的生物處理樣品的試劑在后續(xù)核酸分離和/或純化中的應(yīng)用，其中所述生物處理樣品是在生物藥物的純化過程中得到的純化部分并且其中所述待分離核酸代表生物處理樣品的污染，其特征在于所述試劑包括以下組分: a.至少一種或多種包括氨基的化學(xué)物，所述化合物選自下組中的一種或多種: . 1.極性-中性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選天冬酰胺、半胱氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸， i1.非極性-疏水性蛋白性a-氨基羧酸，優(yōu)選丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸， ii1.堿性a-氨基羧酸，優(yōu)選精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸， iv.非蛋白性氨基羧酸，選自(6-丙氨酸、D-丙氨酸、L-高絲氨酸和D-纈氨酸， V.氨基羧酸聚合物，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(i)-(iv)中所述的氨基羧酸組成，優(yōu)選形成自相同、兩種或幾種不同的氨基羧酸單體，優(yōu)選與鹵化物聯(lián)合，優(yōu)選選自聚-L-賴氨 酸、聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽、聚-L-賴氨酸鹽酸鹽、聚(L-谷胺酰胺，L-丙氨酸)、聚(L-谷胺酰胺，L-賴氨酸)氫溴酸鹽、聚-L-鳥氨酸， v1.來自2-4個(gè)氨基羧酸的肽，包括(1.)-(iv.)中提及的至少一種氨基羧酸，優(yōu)選由(1.)-(iv.)中提及的氨基羧酸組成，優(yōu)選選自(1.)-(iv.)中提及的相同或不同氨基羧酸，優(yōu)選甘氨酸二聚體、甘氨酸三聚體和甘氨酸四聚體， vi1.通式R3R4N-CR1R2-COOH⑴的化合物，其中R1和R2互相獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基烷基、氣基烷基和硫代烷基，而R3和R4互相獨(dú)立地選自氣、烷基、羥基烷基、二(羥基烷基)和三(羥基烷基)，其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈的，是飽和或不飽和的并且其中R1、R2、R3和R4中的至少一個(gè)不是氫，優(yōu)選選自N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸(tricine)和N, N-二 (2-羥基乙基)甘氨酸(bicine), vii1.通式R3R4N-CR5R6R7(II)的化合物，其中R3和R4互相獨(dú)立地選自氫和羥基烷基，并且其中R5、R6和R7互相獨(dú)立地選自氫、烷基和羥基烷基，其中優(yōu)選地R5、R6和R7中的至少一個(gè)是羥基烷基，并且其中烷基成分具有C1-C5的鏈長度，其是支鏈或直鏈，飽和或不飽和的，其中所述化合物優(yōu)選是三(羥基甲基)_氨基甲烷(Tris)， 以及任選的一種或多種以下組分: b.至少一種去污劑， c.至少一種絡(luò)合劑， d.至少一種蛋白，其中所述試劑優(yōu)選是如權(quán)利要求16-27中一項(xiàng)或多項(xiàng)限定的試劑。
31.如權(quán)利要求30所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑包括于用于從生物處理樣品分離和/后純化核酸的試劑盒中，并且其中所述試劑盒任選還包括至少一種或多種以下組分: a.用于分離靶標(biāo)核酸的運(yùn)載體材料，優(yōu)選含有二氧化硅、玻璃纖維或聚亞烷基，例如PP、PE / PP、PE，其中所述運(yùn)載體材料以顆粒形式作為非織造織物、纖維、凝膠基質(zhì)或膜使用，優(yōu)選作為柱填充材料，其中所述顆粒優(yōu)選采用珠的形式，優(yōu)選磁性顆粒，更優(yōu)選作為磁性珠， b.一種或多種用作裂解劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分， c.一種或多種酶，優(yōu)選蛋白酶K、DNA酶和/或RNA酶， d.一種或多種用作結(jié)合劑的制劑，優(yōu)選包括至少一種離液劑和/或至少一種來自非離子型去污劑組的去污劑，優(yōu)選選自聚氧乙烯-脂肪醇醚，其包括具有6-22個(gè)碳原子的脂肪醇部分并且包括含有2-150個(gè)(CH2CH2O)單元的聚氧乙烯部分，以及任選地至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇， e.一種或多種用作洗滌劑的制劑，所述制劑優(yōu)選包括至少一種具有1-5個(gè)碳原子的支鏈或直鏈醇，以及任選的離液化合物和/或任選來自非離子型表面活性劑組的去污劑， f.一種或多種用作洗脫劑的制劑，優(yōu)選包括緩`沖介質(zhì)中的至少一種絡(luò)合劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103764827SQ201280031887
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月4日
【發(fā)明者】P·波爾什斯基 申請(qǐng)人:恰根有限公司