專利名稱：快速檢測地溝油的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種快速檢測地溝油的試劑盒。
背景技術(shù)：
目前，市場上食用油的質(zhì)量良莠不齊，一小部分油脂加工生產(chǎn)商為了節(jié)約成本、牟取暴利，違法加工提煉地溝油，或是在普通食用油中摻入地溝油來欺騙消費者，這些不法行為給食品安全帶來了隱患，嚴(yán)重危害了消費者的健康與利益。地溝油是質(zhì)量、衛(wèi)生極差，過氧化值、酸價、水分、羰基價、丙二醛等指標(biāo)嚴(yán)重超標(biāo)的非食用油，一般分為3類:一是狹義的地溝油，即將下水道中的油膩漂浮物或者將賓館、酒樓的剩飯、剩菜(通稱泔水)經(jīng)過簡單加工、提煉出的油；二是劣質(zhì)動物肉類、動物內(nèi)臟、動物皮脂加工以及提煉后產(chǎn)出的油；三是用于油炸食品的油使用次數(shù)超過規(guī)定要求后，再被重復(fù)使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。地溝油中的重金屬、毒素(如丙烯醛)等嚴(yán)重超標(biāo)，過氧化值一般高于0.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國家標(biāo)準(zhǔn)0.15%，長期攝入會使細(xì)胞功能衰竭，誘發(fā)多種疾病，甚至致癌。日本曾發(fā)生食用過氧化值為7.5%的劣質(zhì)油脂而造成集體急性中毒事件。目前國內(nèi)對地溝油的鑒別和檢測主要是從感官和理化檢驗兩個方面進行。理化檢測分別檢驗水分含量、比重、折光率、皂化值、酸值、羰基值、過氧化值、碘值重金屬、脂肪酸相對不飽和度、膽固醇、殘留檢測、氧化產(chǎn)物等指標(biāo)。地溝油由于經(jīng)過水洗、蒸餾、脫色、脫臭等精煉工藝后，或者與普通食用植物油摻兌之后，已經(jīng)很難用常規(guī)的感官分析或者理化指標(biāo)等進行區(qū)分。目前國內(nèi)尚缺乏能夠有效鑒別地溝油的檢測方法。

實用新型內(nèi)容基于此，本實用新型依據(jù)地溝油的加工原料與普通食用油原料存在較大的差異，提供了一種快速檢測地溝油的試劑盒。利用試劑盒對地溝油中的基因成分進行檢測，通過檢測結(jié)果判斷地溝油的加工原料，從而達到快速檢測地溝油的目的。一種快速檢測地溝油的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)主要有:具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶；所述試劑瓶包括裝有DNA提取緩沖液的試劑瓶，裝有TaqDNA聚合酶的試劑瓶，裝有PCR反應(yīng)液的試劑瓶和裝有上樣緩沖液的試劑瓶。本實用新型的發(fā)明人改進并優(yōu)化了從地溝油基因的提取到PCR檢測整個過程中的提取試劑與反應(yīng)條件等關(guān)鍵控制性因素，建立了穩(wěn)定性高、快速簡便的一整套地溝油檢測試劑盒。本實用新型從基因的角度對地溝油成分進行鑒別，針對地溝油檢測具有特異性強、靈敏度高、方法重現(xiàn)性好、檢測快速簡便等優(yōu)點，彌補了當(dāng)前檢測方法的空白。本實用新型方法具有重大的推廣應(yīng)用價值，對于有效監(jiān)管地溝油，保護廣大消費者利益具有重大意義。本實用新型可廣泛應(yīng)用于油脂基因的提取、油脂品種鑒定以及開發(fā)油脂核酸快速檢測試劑盒等方面，具有良好的經(jīng)濟與社會效益。

圖1為本發(fā)明實施例1的快速檢測地溝油的試劑盒的結(jié)構(gòu)圖。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例來詳細(xì)說明本實用新型。實施例1快速檢測地溝油的試劑盒請參考圖1，所述快速檢測試劑盒的盒體I內(nèi)具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2(共有4個下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置裝有溶液的試劑瓶；所述試劑瓶包括:裝有DNA提取緩沖液的試劑瓶，裝有Taq DNA聚合酶的試劑瓶，裝有PCR反應(yīng)液的試劑瓶和裝有上樣緩沖液的試劑瓶。上述試劑盒里的試劑瓶的成分及制備如下:(可供進行50份PCR反應(yīng)):(I) DNA 提取緩沖液(IOOmL)分別稱取2.00mg CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)、1.2 Img Tris.HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)、0.58g EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)和8.18g NaCl于容量瓶中，用水定容至IOOmL,混勻。經(jīng)過120°C、30min,高溫消毒滅菌后，再加入10.0Omg購置的蛋白酶K(購自大連寶生物公司)；(2) Taq DNA 聚合酶(25 μ I)；購置Taq DNA聚合酶25 μ I共125IU (購自大連寶生物公司)；(3) PCR 反應(yīng)液(1000 μ I)首先制備引物，制備的引物濃度為100nmol/L。按照本領(lǐng)域常規(guī)方法制備引物。在DNA自動合成儀(采用美國ABI公司的ABI3949型全自動DNA合成儀)上按照制造商的說明書進行合成。分別合成如下引物:動物基因成分通用引物，正向:5’-aagacgagaagacccttggacttta-3’ (SEQ IDN0.1)；動物基因成分通用引物，反向:5’-gattgcgctgttatccctagggta-3’ (SEQ IDN0.2)；植物基因成分通用引物，正向:5’-cgaaatcggtagacgctacg-3’ (SEQ ID N0.3)；植物基因成分通用引物，反向:5，-ttccattgagtctctgcacct-3，(SEQID N0.4)；牛線粒體基因的正向引物:5’-gccatatactctccttggtgaca-3’ (SEQ ID N0.5)；牛線粒體基因的反向引物:5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’ (SEQ ID N0.6)；羊線粒體基因的正向引物:5’-tattaggcctcccccttgtt-3’ (SEQ ID N0.7)；羊線粒體基因的反向引物:5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’ (SEQ ID N0.8)；豬線粒體基因的正向引物:5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’ (SEQ IDN0.9)；豬線粒體基因的反向引物:5’-ctacgaggtctgttccgatataagg_3’(SEQID N0.10)；雞線粒體基因的正向引物:5，-gggacaccctcccccttaatgaca-3’(SEQ ID N0.11)；[0037]雞線粒體基因的反向引物:5’-ggagggctggaagaaggagtg-3’ (SEQ ID N0.12)；[0038]玉米內(nèi)源基因的正向引物:5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc_3’(SEQID N0.13)；玉米內(nèi)源基因的反向引物:5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc_3’(SEQID N0.14)；大 內(nèi)源基因的正向引物:5，-gccctctactccacccccatcc-3’(SEQ ID N0.15)；大豆內(nèi)源基因的反向引物:5，-gcccatctgcaagcctttttgtg-3，(SEQID N0.16)；大米內(nèi)源基因的正向引物:5，-ttgcgcctgaacggatat-3’(SEQ ID N0.17)；大米內(nèi)源基因的反向引物:5，-ggagaagcactggacgagg-3’(SEQ ID N0.18)；花生內(nèi)源基因的正向引物:5’-tatgatcctcgttgtgtctatgac-3’(SEQ ID N0.19)；花生內(nèi)源基因的反向引物:5’-tctccagtcttcttctctttcac-3’ (SEQ ID N0.20)；油菜籽內(nèi)源基因的正向引物:5’-ccagttcttggagccgcttga-3’ (SEQ ID N0.21)；油菜籽內(nèi)源基因的反向引物:5’-aagggccagtccaaatgcaga-3’ (SEQ ID N0.22)；馬鈴薯內(nèi)源基因的正向引物:5’-tgacctggacaccacagttat-3’ (SEQ ID N0.23)；馬鈴薯內(nèi)源基因的反向引物:5’-gtggatttcaggagttcttcga-3’(SEQ ID N0.24)；稱取0.285mg MgCl2,用500 μ L水溶解,經(jīng)過120°C、30min,高溫消毒滅菌后，分別加入0.5μηιο1的一對引物和0.5mmol的三磷酸脫氧核苷酸,用滅菌水定容至IOOOyL;(4)上樣緩沖液(100 μ I)分別稱取2.5g溴酚藍、400g蔗糖于IL容量瓶中，用水定容、混勻。實施例2利用實施例1的試劑盒檢測地溝油中的基因成分檢測方法包括以下步驟:(I)樣品DNA的制備a疑似地溝油、食用植物油樣品:量取300 500mL樣品；取離心管,每管加入50mL油樣與50mL雙蒸水,振蕩儀上振蕩60min, 12000r/min離心lOmin，棄去上層油脂，保留下層水相。再向離心管中加入50mL油樣，繼續(xù)振蕩，離心，上述過程重復(fù)8次,所萃取油樣的體積約為400mL。萃取到下層水相渾池后，12000r/min離心lOmin，棄去上層油脂，將水相轉(zhuǎn)移至平面皿中，濃縮干燥，干燥濃縮過程約3小時；充分干燥后，向平面皿中加入2mL試劑盒中的DNA提取緩沖液，混勻后，轉(zhuǎn)移懸濁液于離心管中。將離心管置于65°C放置60min，不時搖動，使樣品充分裂解。用氯仿:異戊醇體積比為24:1的混合液進行提取，小心的混合兩相，12000r/min離心lOmin。將上清液移至一新的離心管中，加入2倍體積的預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，_20°C放置2小時，使得異丙醇與核酸充分反應(yīng)，12000r/min離心lOmin，獲得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室溫離心12000r/min, IOmin收集DNA，盡可能除去乙醇。用100 μ I雙蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得樣品DNA，置于_20°C保存。b動物肉類(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉)、常見植物物種(玉米、大豆、花生、油菜籽、馬鈴薯)樣品:分別將牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、大米、玉米、大豆、花生、油菜籽、馬鈴薯等試驗材料，使用經(jīng)過120°C、30min高壓消毒過的固體粉碎機或研缽粉碎制成粉樣。分別稱取IOOmg研磨粉碎后的樣品于離心管中，加入ImL試劑盒中的DNA提取緩沖液，混勻。將離心管置于65°C放置60min，不時搖動，使樣品充分裂解。用氯仿:異戊醇體積比為24:1的混合液進行提取，小心的混合兩相，12000r/min離心5min。將上清液移至1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的異丙醇,充分混勻，12000r/min離心5min,獲得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室溫離心12000r/min，5min收集DNA，盡可能除去乙醇。用100 μ I雙蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得樣品DNA，置于_20°C保存。(2)檢查DNA的純度和含量在石英比色皿中加入50 μ I按10倍稀釋的DNA樣品(5 μ I DNA樣品加水45 μ I混勻)，分別測定DNA樣品在260nm和280nm處的紫外光吸收值，并計算A26(l/A28(l值。A26tl/A280應(yīng)介于1.7 1.9之間，低于1.7則表明制備物中存留顯著蛋白質(zhì)，應(yīng)重新提取DNA ’大于1.9則表明DNA樣品中含有RNA，此時應(yīng)加入RNA酶進行消化。計算DNA 濃度:10 X A260 ( μ g/ μ I)。疑似地溝油樣品、食用植物油、常見肉類及植物組織DNA提取結(jié)果見表I。
表I樣品DNA提取結(jié)果
權(quán)利要求1.一種快速檢測地溝油的試劑盒，其特征是，包括盒體，盒體內(nèi)主要有:具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶；所述試劑瓶包括裝有DNA提取緩沖液的試劑瓶，裝有Taq DNA聚合酶的試劑瓶，裝有PCR反應(yīng)液的試劑瓶和裝有上樣緩沖液的試劑瓶。
專利摘要本實用新型公開了一種快速檢測地溝油的試劑盒，所述試劑盒包括DNA提取緩沖液、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、上樣緩沖液。本實用新型在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，改進并優(yōu)化了從地溝油基因的提取到PCR檢測整個過程中的提取試劑與反應(yīng)條件等關(guān)鍵控制性因素，建立了穩(wěn)定性高、快速簡便的一整套地溝油檢測試劑盒。本實用新型從基因的角度對地溝油成分進行鑒別，針對地溝油檢測具有特異性強、靈敏度高、方法重現(xiàn)性好、檢測快速簡便等優(yōu)點，彌補了當(dāng)前檢測方法的空白。具有重大的推廣應(yīng)用價值，對于有效監(jiān)管地溝油，保護廣大消費者利益具有重大意義。
文檔編號C12Q1/68GK203021574SQ20122039259
公開日2013年6月26日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者郭新東, 吳玉鑾, 柯振華, 陳立偉, 羅海英, 侯向昶, 冼燕萍, 陳意光, 羅東輝, 吳文海, 王斌 申請人:廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院