一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌dgge標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法，在普洱茶發(fā)酵過程中檢測優(yōu)勢細(xì)菌時，利用DGGE細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶，快速鑒定發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌，該方法通過監(jiān)控普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌條帶，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。
【專利說明】一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法，在普洱茶發(fā)酵過程中檢測優(yōu)勢細(xì)菌時，利用DGGE細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶，快速鑒定發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌，該方法通過監(jiān)控普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌條帶，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。
【背景技術(shù)】
[0002]普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)特有的大葉茶制成的曬青毛茶為原料，經(jīng)過后發(fā)酵工藝生產(chǎn)而成的散茶和緊壓茶。普洱茶色澤呈棕紅褐色，湯色紅濃明亮，具獨(dú)特陳香，滋味醇厚回甘，耐沖泡。經(jīng)現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)驗(yàn)證，普洱茶對人體具有多種保健作用，例如降血脂、降血壓、減肥、預(yù)防心血管疾病、抗癌等功效。
[0003]在普洱茶加工過程中，渥堆發(fā)酵是普洱茶品質(zhì)形成的最為關(guān)鍵的一道工序，渥堆過程中茶葉品質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其湯色、香氣、滋味、葉底都發(fā)生了深刻的變化，其中微生物在發(fā)酵過程中起著決定性的作用。在普洱茶的渥堆過程中微生物對茶葉中許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，最終形成了普洱茶獨(dú)特的風(fēng)味以及多種功效。
[0004]優(yōu)勢微生物指在一定的環(huán)境下，具有最適生活度、繁殖最快、數(shù)量最多的微生物種群。普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物菌群，是決定普洱茶品質(zhì)的關(guān)鍵。因此，若想控制普洱茶產(chǎn)品的質(zhì)量，就要掌握普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物菌群的變化。
[0005]變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradient Gel Electrophoresis, DGGE)最早是由Fisher和Lerman于1979年首先發(fā)明用于檢測DNA突變的技術(shù)，1993年Muzyer等首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，并證實(shí)了這種技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。
[0006]與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，PCR-DGGE技術(shù)以基因組DNA為研究對象，能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定在自然環(huán)境及人工環(huán)境中的微生物種群，無需對所研究的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，這一特性克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究微生物群落時造成的微生物信息大量丟失的缺點(diǎn)，可以更為真實(shí)、客觀、有效的反映樣品中微生物群落尤其是復(fù)雜微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和功能。另外PCR-DGGE可快速同時對多個樣品進(jìn)行分析，因此非常適合研究微生物群落的時空變化。
[0007]作為一種成熟的分子生物學(xué)方法，DGGE也存在著明顯的缺憾，目前，商業(yè)化的DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶(DGGE Marker)很少，根據(jù)不同規(guī)格DGGE每塊膠上可以同時進(jìn)行15-20個樣品的電泳，樣品較多時，不同樣品之間的比較受到很大的限制，而不同時間的電泳產(chǎn)品由于電壓、電流、緩沖溶液濃度、電泳時間等不同，造成樣品之間比較缺乏標(biāo)志物，即DGGEMarker。
[0008]本發(fā)明利用PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測普洱茶發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物菌群的變化，其方法是，先制作一種優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶(即DGGE marker)，然后從生產(chǎn)過程中的普洱茶提取優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶，和 上述標(biāo)準(zhǔn)條帶進(jìn)行比較，如果吻合說明可以保證普洱茶質(zhì)量，如果不吻合，通過調(diào)整微生物的量或調(diào)整工藝方法，使達(dá)到吻合，從而保證生產(chǎn)出的普洱茶質(zhì)量均一，有利于普洱茶質(zhì)量的穩(wěn)定。此方法克服了傳統(tǒng)的開放式發(fā)酵中完全依靠經(jīng)驗(yàn)，無法嚴(yán)格保證微生物的重復(fù)性,也無法抑制有害微生物的弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法。
[0010]所述方法包括以下步驟:
[0011]步驟1，從合格的普洱茶樣品中獲得標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶；
[0012]步驟2，由標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶獲得優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
[0013]其中步驟I的方法如下:
[0014]I)取普洱茶發(fā)酵的合格樣品；
[0015]2)提取微生物總DNA ；
[0016]3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增；
[0017]4)對擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，經(jīng)sybrgreen I染色后得到DGGE標(biāo)準(zhǔn)圖譜；
[0018]5)將圖譜中的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，得到標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶。
[0019]其中步驟2的方法如下:
[0020]I)取標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶；
[0021]2)以標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶的DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0022]3)將擴(kuò)增產(chǎn)物按照一定比例混合；
[0023]4)對其進(jìn)行變性梯度凝膠電泳,經(jīng)sybrgreen I染色，即得DGGE優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
[0024]以上步驟I中，
[0025]其中I)所述發(fā)酵合格樣品為經(jīng)多次機(jī)械柜發(fā)酵后挑選出來的品評打分和理化指標(biāo)檢測復(fù)合普洱茶標(biāo)準(zhǔn)的茶葉樣品。
[0026]其中2)所述提取微生物總DNA，包括提取待測樣品中細(xì)菌16S rDNA,采用原位的提取方法提取其中的總DNA。
[0027]其中3)所述在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)菌總DNA的PCR擴(kuò)增，所述的專用引物如下:
[0028]第一步擴(kuò)增采用的引物為16sl:5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16s2:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ 。
[0029]第二步擴(kuò)增采用的引物為:338fGC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
[0030]PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增:先加入第一步擴(kuò)增引物16S1U6S2和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4 min，然后在94°C變性45s，50°C-55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1.5min，循環(huán)30次，72°C終延伸10 min ;取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴(kuò)增引物338fGC和R518進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50-55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35次，72°C終延伸 10 min。
[0031]其中4)所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用IXTAE的緩沖液，電壓100V，時間10h。
[0032]在步驟2中，
[0033]其中2)所述專用引物及PCR擴(kuò)增條件與步驟I中所述專用引物及PCR擴(kuò)增條件相同。
[0034]其中3)所述一定比例是將各條帶按照等比例進(jìn)行混合。
[0035]其中4)所述變性梯度凝膠電泳，方法與步驟I中變性梯度凝膠電泳方法相同。
[0036]本發(fā)明得到的DGGE優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶，是對合格的普洱茶樣品進(jìn)行測定得到的細(xì)菌DGGE條帶，通過比較生產(chǎn)過程樣品的細(xì)菌DGGE條帶和本發(fā)明所得的標(biāo)準(zhǔn)條帶，可以快速準(zhǔn)確的確定每批產(chǎn)品的優(yōu)勢細(xì)菌是否一致，同時可以據(jù)此確定產(chǎn)品是否合格。
[0037]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0038]1、通過細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶可以快速鑒定發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌，減少切膠、擴(kuò)增、測序鑒定等步驟，節(jié)省時間和成本。
[0039]2、該方法通過監(jiān)控普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌條帶，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。 [0041]實(shí)施例1
[0042]取合格的普洱茶發(fā)酵樣品，首先提取該樣品中微生物的總DNA，提取方法是:稱取Ig樣品，加入200mg玻璃珠,使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70°C水浴IOmin，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min, 13000g離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0.7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心10min，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65°C水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液,混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA柱子中，1000Og離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，1000Og離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，1000Og離心lmin,棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff rash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min,將柱子放入50°C烘箱30min。把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elutionbuffer到柱子中心，65°C水浴lOmin, 13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中，65°C水浴lOmin，13000g離心2min，所得洗脫液即為提取好的微生物總DNA。
[0043]對于細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)±曾，第一步擴(kuò)增采用的引物為16sl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 16s2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3，。第二步擴(kuò)增采用的引物為:338fGC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和R518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增:先加入第一步擴(kuò)增引物16S1U6S2和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4 min，然后在94°C變性45s，50 V -55 V引物復(fù)性45s，72 °C引物延伸1.5min,循環(huán)30次，72 V終延伸10 min，取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin,循環(huán)30-35次，72°C終延伸10 min。目的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。
[0044]細(xì)菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析:
[0045]采用DC0DE?系統(tǒng)(BIO-RAD)構(gòu)建DGGE指紋圖譜，具體方法為:將獲得的樣品的16S擴(kuò)增產(chǎn)物(約230bp)混合，取200ng用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳進(jìn)行分離(丙烯酞胺濃度30-60%，電泳緩沖液1XTAE，80V，10h)，然后切下目的泳道區(qū)域，用sybrgreen I對變性聚丙烯酞胺凝膠染色，用quantity one凝膠成像掃描系統(tǒng)對銀染條帶進(jìn)行照像，得到細(xì)菌的PCR-DGGE譜圖。
[0046]將譜圖中的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，以回收條帶為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的體系和條件同第一次擴(kuò)增。將優(yōu)勢條帶按照1:1的體積比進(jìn)行混合，以細(xì)菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行凝膠成像掃描與分析，sybrgreen I染色后進(jìn)行檢驗(yàn)，即得DGGE優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
【權(quán)利要求】
1.一種普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌DGGE標(biāo)準(zhǔn)條帶制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟1，從合格的普洱茶樣品中獲得標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶； 步驟2，由標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶獲得優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟I的方法如下: 1)取普洱茶發(fā)酵的合格樣品； 2)提取微生物總DNA； 3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增； 4)對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，經(jīng)sybrgreenI染色后得到DGGE標(biāo)準(zhǔn)圖譜； 5)將圖譜中的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，得到標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟2的方法如下: 1)取標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶； 2)以標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)勢細(xì)菌DGGE條帶的DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)將擴(kuò)增產(chǎn)物按照一定比例混合； 4)對其進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，經(jīng)sybrgreenI染色，即得DGGE優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的制作方法，其特征在于，其中I)所述合格樣品，為經(jīng)多次機(jī)械柜發(fā)酵后挑選出來的品評打分和理化指標(biāo)檢測復(fù)合普洱茶標(biāo)準(zhǔn)的茶葉樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的制作方法，其特征在于，其中2)所述提取的微生物總DNA，包括提取待測樣品中細(xì)菌16S rDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3任何一項(xiàng)制作方法，其特征在于，其中所述專用引物如下: 第一步擴(kuò)增采用的引物為 16sl:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16s2:5’ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ 。 第二步擴(kuò)增采用的引物為:338fGC:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACC GCGGCTGCTGG-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3任何一項(xiàng)制作方法，其中， PCR擴(kuò)增條件為巢式PCR擴(kuò)增:先加入第一步擴(kuò)增引物16S1U6S2和反應(yīng)體系進(jìn)行第一步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4 min，然后在94°C變性45s，50°C _55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸1.5min，循環(huán)30次，72°C終延伸10 min ;取其產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴(kuò)增引物338fGC和R518進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，然后在94°C變性45s，50-55°C引物復(fù)性45s，72°C引物延伸lmin，循環(huán)30-35次，72°C終延伸10 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3任何一項(xiàng)制作方法，其特征在于，其中所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用IXTAE的緩沖液，電壓100V，時間10h。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的制作方法，其特征在于，其中3)所述一定比例是將各條帶按照等比例進(jìn)行混合
10.根據(jù)權(quán)利要求1的 制作方法制作的DGGE優(yōu)勢細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)條帶。
【文檔編號】C12Q1/04GK103898200SQ201210583594
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】李長文, 李巍, 梁慧珍, 山其木格, 張長霞, 陳麗君, 劉冰 申請人:云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司