两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

豬細小病毒的培養(yǎng)方法

文檔序號:509447閱讀:3094來源:國知局
豬細小病毒的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬細小病毒的培養(yǎng)方法,利用豬睪丸傳代細胞(ST)細胞作為豬細小病毒培養(yǎng)的細胞源,在細胞傳代的同時接種病毒,從而進行病毒的增殖培養(yǎng)。工藝簡便、生長量大、得率高、成本低廉的特點,并且利用本發(fā)明培養(yǎng)的豬細小病毒制備的疫苗對豬細小病毒病具有完全的防治作用,具有很好的社會效益和應(yīng)用前景。
【專利說明】豬細小病毒的培養(yǎng)方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于豬細小病毒疫苗生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及豬細小病毒的培養(yǎng)方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬于細小病毒科,是引起母豬繁殖障礙疾病的主要病原之一,可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。豬是本病唯一的易感動物,不同年齡、性別的家豬和野豬都可感染。帶毒豬是PPV的主要傳染源,帶毒豬的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染數(shù)月。實驗證明,雖然帶毒豬的排毒時間只有I周~2周,但被其污染的圈舍至少在4個月內(nèi)仍具感染性,這主要是因為PPV對熱穩(wěn)定,對許多常用的消毒劑具有抵抗力,因此,污染的圈舍是PPV的主要儲藏所。
[0005]該病最早是在1967年發(fā)現(xiàn)于英國,Carteright報道了本病,并從豬的流產(chǎn)胎兒中分離到PPV。目前世界各個國家均有流行和報道。我國自20世紀(jì)80年代從各地相繼分離到PPV,血清學(xué)調(diào)查證實豬群中該病的陽性率達85%以上,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前世界上多采用疫苗免疫來控制本病的流行,在疫苗的生產(chǎn)過程中多使用細胞來增殖病毒,最常用的細胞大多都采用該病毒的本動物細胞(包括豬腎細胞、睪丸細胞和傳代系PK-15細胞)和人的某些傳代細胞(如Hela、KB等),但由于該病毒在不同的細胞上增殖效果不盡相同,出現(xiàn)病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量和血凝價均有所差另O,如不能掌握其規(guī)律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養(yǎng)及培養(yǎng)技術(shù),將難以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的疫苗。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】存在的上述缺陷,本發(fā)明的目的在于,提供一種豬細小病毒的培養(yǎng)方法,解決現(xiàn)有技術(shù)因豬細小病毒在不同的細胞上增殖效果不盡相同,出現(xiàn)病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量和血凝價均有所差別,如不能掌握其規(guī)律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養(yǎng)及培養(yǎng)技術(shù),難以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)疫苗的問題。
[0008]本發(fā)明提供的豬細小病毒的培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
(1)細胞傳代,將長滿細胞瓶的生長狀態(tài)良好的ST細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化,待細胞松動后,加入MEM細胞培養(yǎng)液,并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻,倒出4/5的細胞懸液,再加入等量的細胞培養(yǎng)液,即將細胞密度稀釋為原來的5倍;
(2)病毒增殖,將PPV毒種2%同步接種ST細胞,并同時設(shè)未接毒的正常對照細胞,置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),接毒后16h換用不含血清的MEM細胞培養(yǎng)液,每天觀察細胞病變CPE并記錄病變情況,當(dāng)細胞出現(xiàn)80 % CPE時收毒,凍融3次,I 500 r.mirT1離心15min,小瓶分裝上清液備用,按此方法傳代至第3次,-70 °C冰柜保存?zhèn)溆茫?br> 它還包括以下步驟=TCID5tl的測定,將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋,取10_4~10_7 4個稀釋度同步接種每孔100 μ L ST細胞懸液的96孔微量培養(yǎng)板各8孔,每孔100 μ L,接毒后16 h換成不含血清的MEM培養(yǎng)液,同時設(shè)細胞對照孔,置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察6 d,按Reed-Muench法計算TCID5tl ;它還包括以下步驟:血凝價的測定,(I)紅細胞的制備,無菌采取豚鼠血液,按I:9的比例加入PH7.2的PBS,混勻,2 000 r.mirT1離心10 min,吸去上清和中層的白細胞,加入紅細胞體積10倍的PBS,混勻離心10 min,然后重復(fù)以上操作3次,最后將紅細胞轉(zhuǎn)至另一無菌的離心管中,同時用PH7.2的PBS稀釋成濃度為0.6 %的豚鼠紅細胞,4 °〇保存?zhèn)溆茫?br> (2)血凝試驗將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作為待測病毒分別測定血凝價,采用標(biāo)準(zhǔn)U型板,首先加入25 μ L PBS,然后將待測病毒做1:2,1:4…1:4096做倍比稀釋,在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀釋好的病毒液,再加入25 μ L 0.6 %的紅細胞,輕輕振蕩混勻,室溫感作2~3 h,判定結(jié)果。
[0009]本發(fā)明提供的豬細小病毒的培養(yǎng)方法,其有益效果在于,具有工藝簡便、生長量大、得率高、成本低廉的特點,并且利用本發(fā)明培養(yǎng)的豬細小病毒制備的疫苗對豬細小病毒病具有完全的防治作用,具有很好的社會效益和應(yīng)用前景;所培養(yǎng)的病毒液病毒含量需不低于106_° TCID5(i/0.lrnl,血凝價HA不低于1:21°,顯著高于現(xiàn)行技術(shù)培養(yǎng)的豬細小病毒的毒價和血凝價;所用細胞是豬的睪丸細胞為普通的常用細胞,來源充足,獲取成本低,培養(yǎng)技術(shù)成熟,易于生產(chǎn)。
[0010]
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合一個實施例,對本發(fā)明提供的豬細小病毒的培養(yǎng)方法進行詳細的說明。
[0012]
實施例
[0013]本實施例的豬細小病毒的培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
(1)細胞傳代,將長滿細胞瓶的生長狀態(tài)良好的ST細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化,待細胞松動后,加入MEM細胞培養(yǎng)液,并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻,倒出4/5的細胞懸液,再加入等量的細胞培養(yǎng)液,即將細胞密度稀釋為原來的5倍;
(2)病毒增殖,將PPV毒種2%同步接種ST細胞,并同時設(shè)未接毒的正常對照細胞,置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),接毒后16h換用不含血清的MEM細胞培養(yǎng)液,每天觀察細胞病變CPE并記錄病變情況,當(dāng)細胞出現(xiàn)80 % CPE時收毒,凍融3次,I 500 r.mirT1離心15min,小瓶分裝上清液備用,按此方法傳代至第3次,-70 °C冰柜保存?zhèn)溆茫?br> (3)TCID50的測定,將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10%血清的MEM細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋,取10_4~10_7 4個稀釋度同步接種每孔100 μ L ST細胞懸液的96孔微量培養(yǎng)板各8孔,每孔100 μ L,接毒后16 h換成不含血清的MEM培養(yǎng)液,同時設(shè)細胞對照孔,置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察6 d,按Reed-Muench法計算TCID5tl,病毒含量不低于IO6.0 TCID50/0.Iml ;
(4)血凝價的測定:(1)紅細胞的制備,無菌采取豚鼠血液,按1:9的比例加入PH7.2的PBS,混勻,2 000 r ^mirT1離心10 min,吸去上清和中層的白細胞,加入紅細胞體積10倍的PBS,混勻離心10 min,然后重復(fù)以上操作3次,最后將紅細胞轉(zhuǎn)至另一無菌的離心管中,同時用PH7.2的PBS稀釋成濃度為0.6 %的豚鼠紅細胞,4 1:保存?zhèn)溆?;血凝試驗,將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作為待測病毒分別測定血凝價,采用標(biāo)準(zhǔn)U型板,首先加入25 μ L PBS,然后將待測病毒做1:2,1:4…1:4096做倍比稀釋,在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀釋好的病毒液,再加入25 μ L 0.6 %的紅細胞,輕輕振蕩混勻,室溫感作2~
3h ,血凝價HA不低于1:2'
【權(quán)利要求】
1.一種豬細小病毒的培養(yǎng)方法,其特征在于:包括以下步驟: (1)細胞傳代,將長滿細胞瓶的生長狀態(tài)良好的ST細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化,待細胞松動后,加入MEM細胞培養(yǎng)液,并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻,倒出4/5的細胞懸液,再加入等量的細胞培養(yǎng)液,即將細胞密度稀釋為原來的5倍; (2)病毒增殖,將PPV毒種2%同步接種ST細胞,并同時設(shè)未接毒的正常對照細胞,置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng),接毒后16h換用不含血清的MEM細胞培養(yǎng)液,每天觀察細胞病變CPE并記錄病變情況,當(dāng)細胞出現(xiàn)80 % CPE時收毒,凍融3次,I 500 r*min-l離心15min,小瓶分裝上清液備用,按此方法傳代至第3次,-70 1:冰柜保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細小病毒的培養(yǎng)方法,其特征在于:它還包括以下步驟: TCID50的測定,將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋,取10-4~10-7 4個稀釋度同步接種每孔100 μ L ST細胞懸液的96孔微量培養(yǎng)板各8孔,每孔100 μ L,接毒后16 h換成不含血清的MEM培養(yǎng)液,同時設(shè)細胞對照孔,置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察6 d,按Reed-Muench法計算TCID50。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細小病毒的培養(yǎng)方法,其特征在于:它還包括以下步驟: 血凝價的測定:(I)紅細胞的制備,無菌采取豚鼠血液,按1:9的比例加入PH7.2的PBS,混勻,2 000 Pmin-1離心10 min,吸去上清和中層的白細胞,加入紅細胞體積10倍的PBS,混勻離心10 min,然后重復(fù)以上操作3次,最后將紅細胞轉(zhuǎn)至另一無菌的離心管中,同時用PH7.2的PBS稀釋成濃度為0.6 %的豚鼠紅細胞,4 1:保存?zhèn)溆茫? (2)血凝試驗,將所述步驟(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作為待測病毒分別測定血凝價,采用標(biāo)準(zhǔn)U型板,首先加入25 μ L PBS,然后將待測病毒做1:2,1:4…1:4096做倍比稀釋,在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀釋好的病毒液,再加入25 μ L 0.6 %的紅細胞,輕輕振蕩混勻,室溫感作2~3 h,判定結(jié)`果。
【文檔編號】C12N7/00GK103865885SQ201210550709
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權(quán)汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
东方市| 青田县| 珲春市| 修武县| 新竹市| 张北县| 定结县| 丰顺县| 莎车县| 于都县| 西华县| 宁陕县| 安远县| 潍坊市| 云南省| 曲水县| 北碚区| 句容市| 宿松县| 定西市| 依兰县| 巴彦淖尔市| 稻城县| 昌平区| 信丰县| 嘉义市| 康定县| 贵南县| 靖远县| 长治市| 阳泉市| 红原县| 溧水县| 精河县| 景泰县| 垦利县| 永昌县| 大关县| 永修县| 伊金霍洛旗| 张家港市|