專利名稱：棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac 毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，涉及棉鈴蟲(chóng)對(duì)CrylAc毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
表達(dá)CrylAc毒素蛋白的轉(zhuǎn)Bt基因棉花，從1997年開(kāi)始在我國(guó)推廣應(yīng)用，目前已大規(guī)模種植于黃河流域和長(zhǎng)江流域棉區(qū)，平均占到全國(guó)棉花種植面積的75%左右。由于轉(zhuǎn)基因Bt棉花的大規(guī)模推廣應(yīng)用的高強(qiáng)度選擇壓力導(dǎo)致其祀標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)對(duì)CrylAc毒素產(chǎn)生抗性,是Bt棉花使用中面臨的最大威脅。目前研究表明棉鈴蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞鈣粘蛋白基因突變是抗性形成的主要原因。鈣粘蛋白是一類對(duì)細(xì)胞粘結(jié)起決定作用的依賴Ca2+的糖蛋白，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，是由12個(gè)重復(fù)子的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和較小的胞內(nèi)區(qū)組成。以往發(fā)現(xiàn)的基因突變部位均位于鈣粘蛋白胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的插入或片段缺失導(dǎo)致鈣粘蛋白翻譯提前終止，喪失了毒素結(jié)合區(qū)，從而對(duì)CrylAc產(chǎn)生抗性，這種功能喪失性突變產(chǎn)生的抗性通常呈隱性。2009年利用Fl單對(duì)檢測(cè)法共檢測(cè)230頭山東夏津田間棉鈴蟲(chóng)，檢測(cè)到攜帶抗性基因的個(gè)體有67頭。根據(jù)Fl檢測(cè)的原理(Zhang等，Diverse genetic basis offield-evolved resistance to Bt cotton in cotton boIlworm from China. PNAS,2012,109(26) :10275-10280)，這些抗性個(gè)體與室內(nèi)抗性品系SCD_rl單對(duì)雜交(Yang等，Introgression of a disrupted cadherin gene enables susceptible Helicoverpaarmigera to obtain resistance to Bacillus thuringiensis toxin CrylAc. Bulletinof Entomological Research, 200, 99 (2) : 175-181), F1 代經(jīng)診斷劑量(I μ g/cm2CrylAc)處理存活個(gè)體應(yīng)含有兩個(gè)鈣粘蛋白等位基因，一個(gè)來(lái)自SCD-rl品系G1) (Yang等，Identification and molecular detection of a deletion mutation responsiblefor a truncated casherin of Helicoverpa armigera.1nsect Biochemistry andMolecular Biology, 2006，36 (9) : 735-740)，另一個(gè)來(lái)自田間個(gè)體(rx)。SCD-rl 品系的抗性是由鈣粘蛋白突變基因A引起的，Γι缺失大部分胞外區(qū)和整個(gè)跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)，因此可以通過(guò)4組特異性引物選擇性的克隆出田間抗性個(gè)體的鈣粘蛋白基因rx (Zhao等，Diverse cadherin mutations conferring resistance to toxin CrylAc in Helicoverpaarimgera.，2010，40(2) : 113-118)?？寺×?20個(gè)田間抗性個(gè)體的鈣粘蛋白基因序列，鑒定至IJI個(gè)新的鈣粘蛋白突變基因r15。測(cè)序結(jié)果表明位于鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的第32號(hào)外顯子缺失165個(gè)堿基，導(dǎo)致其編碼的55個(gè)氨基酸發(fā)生缺失，這種鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)突變能夠使CrylAc毒力顯著降低，從而導(dǎo)致抗性產(chǎn)生。(見(jiàn)附圖1、見(jiàn)附圖2)。多年多點(diǎn)的田間監(jiān)測(cè)表明，雖然棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt棉花的抗性水平?jīng)]有明顯上升，但田間對(duì)CrylAc毒素抗性基因頻率在逐年增加，特別是新發(fā)現(xiàn)的非隱性抗性基因頻率增加明顯。目前主要的抗性監(jiān)測(cè)技術(shù)包括劑量對(duì)數(shù)-死亡機(jī)率值法(抗性倍數(shù)法)、F1檢測(cè)法、F2檢測(cè)法、診斷劑量檢測(cè)法及分子檢測(cè)法。但前面四種抗性監(jiān)測(cè)方法在棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt棉花的抗性監(jiān)測(cè)中都有明顯的缺點(diǎn)，如不能檢測(cè)抗性基因類型，難以確定合適的診斷劑量，室內(nèi)必須有相應(yīng)抗性品系，成本高，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等，導(dǎo)致對(duì)抗性監(jiān)測(cè)的不準(zhǔn)確和延后，嚴(yán)重影響后續(xù)有效抗性治理的開(kāi)展和實(shí)施。而分子檢測(cè)方法可以直接檢測(cè)抗性基因型，精確性高，對(duì)待測(cè)樣本的狀態(tài)無(wú)要求，對(duì)抗性基因顯隱性無(wú)要求，具有靈活性和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
田間棉鈴蟲(chóng)由于鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變導(dǎo)致的非隱性抗性基因頻率增加明顯，且在基因組DNA水平上有三種不同的類型。本發(fā)明的目的在于，利于PCR方法，根據(jù)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變序列特點(diǎn)，建立快速、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，明確由此類突變導(dǎo)致的非隱性抗性基因頻率，對(duì)棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt棉花的抗性監(jiān)測(cè)和治理提供指導(dǎo)，具有實(shí)用價(jià)值。棉鈴蟲(chóng)對(duì)CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)，檢測(cè)棉鈴蟲(chóng)種群內(nèi)各個(gè)體鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū) 是否存在由于三種不同的插入或缺失導(dǎo)致胞內(nèi)區(qū)32號(hào)外顯子缺失55個(gè)氨基酸的情況。本發(fā)明棉鈴蟲(chóng)對(duì)CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測(cè)方法優(yōu)選包含以下三個(gè)步驟第一步提取棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的基因組DNA ；第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR擴(kuò)增上一步提取的棉鈴蟲(chóng)基因組DNA ；第三步將上一步PCR獲得產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖譜準(zhǔn)確鑒定棉鈴蟲(chóng)個(gè)體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個(gè)體。r15_i突變是由第32號(hào)外顯子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為2500bp左右，這個(gè)片段與I個(gè)棉鈴蟲(chóng)羧酸膽堿酯酶基因(GenBank登錄號(hào)為FJ997310.1)的3’端非編碼區(qū)有95%的相似性，如果電泳結(jié)果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導(dǎo)致的mRNA缺失突變的抗性純合子，如果電泳有2500bp和IOOObp兩個(gè)條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道I和泳道2)。r15_2突變的等位基因在第32號(hào)外顯子上缺失82bp的DNA序列，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp，如果電泳結(jié)果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA缺失而導(dǎo)致的mRNA第32號(hào)外顯子缺失突變的抗性純合子，如果電泳有750bp和IOOObp兩個(gè)條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道3和泳道4)。r15_3突變是由第32號(hào)外顯子上插入了約4000bp的片段形成，擴(kuò)增產(chǎn)物約為5000bp，如果電泳結(jié)果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導(dǎo)致的mRNA缺失突變的抗性純合子，如果電泳有5000bp和兩個(gè)條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道5和泳道6)。如果PCR擴(kuò)增片段只有IOOObp (如附圖3，泳道7)，則為敏感個(gè)體。本發(fā)明方法還可包括基于第三步的結(jié)果判斷種群內(nèi)抗性基因頻率。有益效果本發(fā)明就是基于室內(nèi)前期研究的基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)了針對(duì)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的基因組DNA分子檢測(cè)技術(shù)，它具有(I)快速、準(zhǔn)確及同時(shí)檢測(cè)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)突變基因組DNA水平上的三種不同類型，(2)判斷出發(fā)生突變個(gè)體的基因型，計(jì)算出與突變有關(guān)的非隱性抗性基因個(gè)體頻率，(3)全過(guò)程耗時(shí)5-8小時(shí)等特點(diǎn)。
與傳統(tǒng)的抗性監(jiān)測(cè)技術(shù)相比，此方法無(wú)需將田間試蟲(chóng)飼養(yǎng)至適宜蟲(chóng)齡，再進(jìn)行生物測(cè)定以確定抗性水平，以后再通過(guò)與室內(nèi)現(xiàn)有的抗性和敏感品系進(jìn)行遺傳雜交以決定抗性的顯、隱性水平，最后再進(jìn)行基因型鑒定。如果完成上述工作需數(shù)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間，其結(jié)果對(duì)生產(chǎn)實(shí)際的指導(dǎo)意義嚴(yán)重滯后。而本發(fā)明方法不需飼養(yǎng)試蟲(chóng)，節(jié)省勞動(dòng)力和資源，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出棉鈴蟲(chóng)對(duì)CrylAc毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變，以及具體DNA的變化類型，單個(gè)試蟲(chóng)僅需數(shù)小時(shí)。如果采集鑒定田間的代表性試蟲(chóng)種群，也只需幾周時(shí)間就可以得到種群內(nèi)抗性基因頻率，鑒定結(jié)果可及時(shí)對(duì)棉鈴蟲(chóng)的有效抗性治理提供正確指導(dǎo)。


圖1棉鈴蟲(chóng)SCD品系鈣粘蛋白基因與rl5等位基因氨基酸序列比較相同序列用圓點(diǎn)表示，水平箭頭表示推測(cè)的結(jié)構(gòu)域起始點(diǎn)。SIG，信號(hào)肽區(qū)；EC，鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)；MPR，近膜區(qū)；TM，跨膜區(qū)；CYT，胞質(zhì)區(qū)。黑色方框表示缺失片段。S⑶鈣粘蛋白基因序列GenBank登錄號(hào) JN836544. 1，rl5 序列 GenBank 登錄號(hào) JN898956.1。 圖2棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。A :棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)又包括信號(hào)肽區(qū)(SIG)，11個(gè)鈣粘蛋白重復(fù)子區(qū)(1-11)和近膜區(qū)(MPR)。B :棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白基因組結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)區(qū)缺失突變是由于在其基因組DNA第33個(gè)外顯子上插入了 1459bp或4000bp或缺失了 82bp的DNA片段，導(dǎo)致胞內(nèi)區(qū)缺失55個(gè)氨基酸。圖3實(shí)施例1PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，用于驗(yàn)證棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的缺失突變及相應(yīng)的基因組DNA突變類型。不同的泳道表示突變不同的基因型，其中各泳道分別表示l:r15_iri5_1;2:ri5_lS;3:ri5-2ri5-2; 4:r15_2s; 5:r15_3r15_3; 6 :r15_3s; 7: ss ；M:DNA Ladder。r15_!突變擴(kuò)增片段為 2500bp，r15_2突變擴(kuò)增片段為750bp，r15_3突變擴(kuò)增片段為5000bp，ss擴(kuò)增片段為lOOObp。圖4實(shí)施例2PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，用于判斷棉鈴蟲(chóng)田間種群內(nèi)個(gè)體發(fā)生鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的缺失突變及相應(yīng)的基因組DNA突變類型的情況。不同的泳道表示突變不同的基因型，其中各泳道分別表示1，2:r15_2r15_2，為抗性純合子；3，4，5:r15_2s,為抗性雜合子6，7: ss,為敏感個(gè)體；M:DNA Ladder。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1第一步單頭棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)基因組DNA的提取。(I)分別獲取室內(nèi)通過(guò)生物測(cè)定方法和與敏感品系遺傳雜交證實(shí)其確為抗性純合子、抗性雜合子和敏感個(gè)體的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)。(2)采用市售的DNA提取試劑盒提取幼蟲(chóng)基因組DNA。本方法采用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司的AxyPr印基因組DNA小量試劑盒。(3)取棉鈴蟲(chóng)3-4齡幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的腹部組織30毫克，于1. 5mL離心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸緩沖液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均勻。收集350 μ L組織勻漿液于2mL離心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，渦漩振蕩I分鐘后，短暫離心，再將其置于56度水浴10分鐘。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),渦漩振蕩30秒，12，OOOXg離心10分鐘。(6)將DNA制備管置于另一 2m L離心管中，將(5)中的上清液移至制備管中，12，000 Xg離心I分鐘。(7)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，加入500 μ L洗滌液(Buffer W1),12，000 Xg離心I分鐘。(8)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，加入700 μ L去鹽液(Buffer W2),12，000 Xg離心I分鐘。(9)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，12，OOOXg離心I分鐘。(10)棄濾液，將制備管放到另一潔凈的1. 5mL離心管，在制備管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 離心 I 分鐘，得到基因組 DNA 溶液，-20
度保存?zhèn)溆谩５诙?，?duì)第一步中提取的基因組DNA模板進(jìn)行鈣粘蛋白特定基因片段的PCR擴(kuò)
士豳
>曰ο(I)根據(jù)棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)32號(hào)外顯子缺失后的序列特征，設(shè)計(jì)出特異性PCR引物，可以通過(guò)擴(kuò)增同時(shí)檢測(cè)出基因組DNA水平上三種不同的插入或缺失。上游引物A 的序列為TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1)下游引物B 的序列為CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立總反應(yīng)體積為25 μ L的PCR反應(yīng)體系。
IOXLA FCR BufTerII Clgs* Free) 2. 5Pl MgCI, C25minoi/L)2. nML
JXTP Mixture ( 1() ibo1/L each)0. 5μ|.
A (10μ iioi/L)L OlC
B (IOpboI/L)1. OA
(ienomi c DXAI, Ol1L
LA Taq DKA 聚合_ (5 / μ I)0. 25Λ
ddH2()(滅菌雙蒸水)16· 25μΙ.
總體積25μ (3) PCR反應(yīng)條件為94V預(yù)變性3分鐘，94V變性30秒，57V退火30秒，72°C延伸5分30秒，循環(huán)數(shù)30，最后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物，用于后續(xù)瓊脂糖凝膠電脈檢測(cè)。第三步，對(duì)第二步得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈檢測(cè)。(I)準(zhǔn)備1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠。
(2)取IOyL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，穩(wěn)流80mA，1. 5小時(shí)后在紫外光下觀察。從電泳結(jié)果可以看到此對(duì)PCR引物針對(duì)棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白基因在胞內(nèi)區(qū)55個(gè)氨基酸的缺失突變擴(kuò)增出三種類型，根據(jù)電泳條帶的大小可以進(jìn)行同時(shí)鑒定，并能一次區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個(gè)體，結(jié)果見(jiàn)附圖3。由DNA的插入或缺失引起的3種突變導(dǎo)致鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)mRNA水平上32號(hào)外顯子的缺失。r15_i突變是由第32號(hào)外顯子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為2500bp左右，這個(gè)片段與I個(gè)棉鈴蟲(chóng)羧酸膽堿酯酶基因(GenBank登錄號(hào)為FJ997310.1)的3’端非編碼區(qū)有95%的相似性，抗性純合子電泳結(jié)果只顯示這一條帶(如附圖3，泳道I )，抗性雜合子電泳有2500bp和IOOObp兩個(gè)條帶(如附圖3，泳道2)。r15_2突變的等位基因 在第32號(hào)外顯子上缺失82bp的DNA序列，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp (如附圖3，泳道3)，抗性純合子電泳結(jié)果只顯示這一條帶，抗性雜合子電泳有750bp和IOOObp兩個(gè)條帶(如附圖3，泳道4)。r15_3突變是由第32號(hào)外顯子上插入了約4000bp的片段形成，擴(kuò)增產(chǎn)物約為5000bp (如附圖3，泳道5)，抗性純合子電泳結(jié)果只顯示這一條帶，抗性雜合子電泳有5000bp和IOOObp兩個(gè)條帶(如附圖3，泳道6)。敏感個(gè)體PCR擴(kuò)增片段只有IOOObp (如附圖3，泳道7)。實(shí)施例2下面說(shuō)明本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案用于棉鈴蟲(chóng)種群內(nèi)鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)缺失突變基因頻率的檢測(cè)方法第一步單頭棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)基因組DNA的提取。(I)直接從田間采集棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或采用高壓汞燈誘集棉鈴蟲(chóng)成蟲(chóng)，將得到的試蟲(chóng)浸泡在95%的乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)抽取100頭棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)個(gè)體供基因頻率檢測(cè)。(2)采用市售的DNA提取試劑盒提取幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的基因組DNA。本方法采用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司的AxyPr印基因組DNA小量試劑盒。(3)取棉鈴蟲(chóng)3-4齡幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的腹部組織30毫克，于1. 5mL離心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸緩沖液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均勻。收集350 μ L組織勻漿液于2mL離心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，渦漩振蕩I分鐘后，短暫離心，再將其置于56度水浴10分鐘。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),渦漩振蕩30秒，12，OOOXg離心10分鐘。(6)將DNA制備管置于另一 2mL離心管中，將(5)中的上清液移至制備管中，12，000 Xg離心I分鐘。(7)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，加入500 μ L洗滌液(Buffer W1),12，000 Xg離心I分鐘。(8)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，加入700 μ L去鹽液(Buffer W2),12，000 Xg離心I分鐘。(9)棄濾液，將制備管放回原來(lái)的2mL離心管，12，OOOXg離心I分鐘。(10)棄濾液，將制備管放到另一潔凈的1. 5mL離心管，在制備管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 離心 I 分鐘，得到基因組 DNA 溶液，-20
度保存?zhèn)溆?。第二步，?duì)第一步中提取的基因組DNA模板進(jìn)行鈣粘蛋白特定基因片段的PCR擴(kuò)

(I)根據(jù)棉鈴蟲(chóng)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)32號(hào)外顯子缺失后的序列特征，設(shè)計(jì)出特異性PCR引物，可以通過(guò)擴(kuò)增同時(shí)檢測(cè)出基因組DNA水平上三種不同的插入或缺失。上游引物A 的序列為TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1) 下游引物B 的序列為CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立總反應(yīng)體積為25 μ L的PCR反應(yīng)體系。
權(quán)利要求
1.棉鈴蟲(chóng)對(duì)CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測(cè)方法，其特征在于設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)，檢測(cè)棉鈴蟲(chóng)種群內(nèi)各個(gè)體鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)是否存在由于三種不同的插入或缺失導(dǎo)致胞內(nèi)區(qū)32號(hào)外顯子缺失55個(gè)氨基酸的情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于該方法包含以下三個(gè)步驟 第一步提取棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)的基因組DNA ； 第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR擴(kuò)增上一步提取的棉鈴蟲(chóng)基因組DNA ； 第三步將上一步PCR獲得產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖譜準(zhǔn)確鑒定棉鈴蟲(chóng)個(gè)體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個(gè)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述的分子檢測(cè)方法還包括根據(jù)第三步的結(jié)果判斷種群內(nèi)抗性基因頻率。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述的根據(jù)電泳圖譜準(zhǔn)確鑒定棉鈴蟲(chóng)個(gè)體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個(gè)體的方法是如果電泳結(jié)果只顯示2500bp條帶，則表明該棉鈴蟲(chóng)為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導(dǎo)致的mRNA缺失突變的抗性純合子；如果電泳結(jié)果顯示2500bp和IOOObp兩個(gè)條帶，則該棉鈴蟲(chóng)為抗性雜合子；如果電泳結(jié)果只顯示750bp條帶，則表明該棉鈴蟲(chóng)為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA缺失而導(dǎo)致的mRNA第32號(hào)外顯子缺失突變的抗性純合子；如果電泳結(jié)果顯示750bp和IOOObp兩個(gè)條帶,則表明該棉鈴蟲(chóng)為抗性雜合子；如果電泳結(jié)果只顯示5000bp條帶，則表明該棉鈴蟲(chóng)為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導(dǎo)致的mRNA缺失突變的抗性純合子；如果電泳結(jié)果顯示5000bp和IOOObp兩個(gè)條帶，則表明該棉鈴蟲(chóng)為抗性雜合子；如果電泳結(jié)果只顯示lOOObp，則表明該棉鈴蟲(chóng)為CrylAc毒素敏感個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法共分3個(gè)主要步驟，第一步分別提取棉鈴蟲(chóng)樣品的基因組DNA；第二步進(jìn)行特定鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)片段的PCR擴(kuò)增；第三步將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳圖譜，可以準(zhǔn)確鑒定基因型，并以此判斷不同種群的抗性基因頻率。本發(fā)明方法不需飼養(yǎng)試蟲(chóng)，節(jié)省勞動(dòng)力和資源，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出棉鈴蟲(chóng)的基因型，單個(gè)試蟲(chóng)僅需數(shù)小時(shí)，采集鑒定田間種群的抗性個(gè)體頻率也只需幾周時(shí)間，鑒定結(jié)果可及時(shí)對(duì)棉鈴蟲(chóng)的有效抗性治理提供正確指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103014159SQ201210524000
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者吳益東, 張浩男, 楊亦樺, 武淑文 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)