專利名稱：來(lái)源于新疆野蘋果的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)源于新疆野蘋果的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在自然環(huán)境中，植物生長(zhǎng)在開(kāi)放的系統(tǒng)中，經(jīng)常會(huì)遇到冷、熱、旱、澇、鹽堿、大氣污染等不良環(huán)境的影響。不良環(huán)境作用于植物，將會(huì)引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)，表現(xiàn)為代謝和生長(zhǎng)的可逆性抑制，嚴(yán)重時(shí)甚至引起不可逆?zhèn)?，?dǎo)致整個(gè)植株死亡。在各種環(huán)境脅迫中，干旱、低溫、高熱和高鹽等非生物脅迫對(duì)植物的影響尤為突出，表現(xiàn)為不同程度地對(duì)植物體內(nèi)水分狀況的影響，因此又成為水分脅迫，是制約植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量的最主要非生物性逆境因子。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，逐漸形成了一系列應(yīng)答逆境脅迫的生理、代謝以及防御系統(tǒng)。從植物中克隆與調(diào)控植物非生物脅迫抗性相關(guān)的基因?qū)樘岣咧参飳?duì)非生物脅迫的抗性奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一個(gè)調(diào)控植物非生物脅迫抗性和/或調(diào)控植物生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為MsDREB2C，來(lái)源于新疆野蘋果(Malussieversii (Ledeb. ) Roem.),是如下 a)或 b)的蛋白質(zhì)a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID No. 2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，SEQ ID No. 2由398個(gè)氨基酸殘基組成。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個(gè))RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個(gè))HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)中的MsDREB2C可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的MsDREB2C的編碼基因可通過(guò)將SEQ ID No. 1的第151-1347位核苷酸所示的DNA序列中缺失ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行ー個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼MsDREB2C的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
所述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)或4)所示的基因1)編碼 MsDREB2C 的 DNA 分子；2)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1347位核苷酸的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼MsDREB2C的DNA分子；4)與1)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼MsDREB2C的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 1 X SSC, 0. 1%SDS 各洗膜一次。其中，SEQ ID No. 1由1438個(gè)核苷酸組成，其編碼序列是第151-1347位，編碼SEQID No. 2所不的蛋白質(zhì)。下述1) -4)中的任ー種生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍1)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的表達(dá)盒；2)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組載體；3)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組微生物；4)含有編碼MsDREB2C的核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。上述生物材料中，1)所述的含有編碼MsDREB2C的核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)MsDREB2C的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止MsDREB2C轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)ー步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。2)所述的含有編碼MsDREB2C的核酸分子的重組載體具體可為在載體pCB302_3的多克隆位點(diǎn)插入MsDREB2C編碼基因得到的表達(dá)MsDREB2C的重組表達(dá)載體。3)所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。其中，細(xì)菌可來(lái)自埃希氏菌屬(Escherichia),歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes),假單胞菌屬(Pseudomonas),芽胞桿菌屬(Bacillus)等。4)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不包括植物的繁殖材料。本發(fā)明還保護(hù)編碼MsDREB2C的核酸分子、編碼MsDREB2C的核酸分子或上述任一種生物材料在調(diào)控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少ー種。本發(fā)明還提供了ー種培育抗非生物脅迫和/或生長(zhǎng)增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗非生物脅迫和/或生長(zhǎng)增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入編碼MsDREB2C的核酸分子得到所述轉(zhuǎn)基因植物的步驟所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比，對(duì)非生物脅迫的抗性提高和/或生長(zhǎng)增加；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少ー種。上述應(yīng)用和方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述生長(zhǎng)可為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和/或生埴生長(zhǎng)。所述營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)可為根系的生長(zhǎng)、莖的生長(zhǎng)和/或葉的生長(zhǎng)。所述根系的生長(zhǎng)具體可體現(xiàn)在主根長(zhǎng)度和/或側(cè)根數(shù)量上，所述葉的生長(zhǎng)具體可體現(xiàn)為葉面積上(葉長(zhǎng)和/或葉寬增加)。所述植物為種子植物，所述生殖生長(zhǎng)可體現(xiàn)在種
子重量上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述調(diào)控植物非生物脅迫抗性為調(diào)控?cái)M南芥非生物脅迫抗性，所述調(diào)控植物生長(zhǎng)為調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)。所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因擬南芥。所述生殖生長(zhǎng)體現(xiàn)在花薹高度、花薹數(shù)量和/或種子重量上。上述方法中，所述受體植物可為擬南芥，所述生長(zhǎng)増加為花薹數(shù)量増加和/或種
子重量増加。其中所述MsDREB2C基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，以達(dá)到更好的表·達(dá)效果1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述MsDREB2C基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV，MCMV和AMV)。所述MsDREB2C基因可通過(guò)MsDREB2C基因表達(dá)盒或含有所述MsDREB2C基因表達(dá)盒的MsDREB2C基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。 本發(fā)明中所述MsDREB2C基因表達(dá)盒均可含有所述MsDREB2C基因和啟動(dòng)所述MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所述MsDREB2C基因表達(dá)盒均指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)ー步，所述MsDREB2C基因表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP" ,Chao等人(1999)Plant Physioll20:979-992);來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1 (PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻ニ唑-7-硫代羥酸S-甲酷)誘導(dǎo));西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸￥酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (美國(guó)專利5，057，422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國(guó)專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMB0 J. 4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見(jiàn)，例如Odell 等人(I985)Nature 313:810 ；Rosenberg 等人(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mo1. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 GenesDev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ；Joshi 等人(1987)Nucleic AcidRes.，15:9627)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述MsDREB2C基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S)，終止所述MsDREB2C基因轉(zhuǎn)錄的終止子為N0S終止子?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述MsDREB2C基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)橘x予對(duì)抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因hyg。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述MsDREB2C基因通過(guò)含有所述MsDREB2C基因表達(dá)盒的MsDREB2C基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。所述MsDREB2C基因表達(dá)載體是載體PCB302-3的多克隆位點(diǎn)插入MsDREB2C編碼基因得到的表達(dá)MsDREB2C的重組表達(dá)載體 pCB302-3-MsDREB2C。所述MsDREB2C基因表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, MethodforPlant Molecular Biology VIII, Academy Press,New York,pp. 411-463;GeisersonandCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。當(dāng)所述目的植物為擬南芥等雙子葉植物時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因植物與受體植物相比，具有如下1)-11)中的至少ー種特性1)抗熱脅迫；2)抗干旱脅迫；3)抗冷脅迫；4)主根長(zhǎng)度增加；5)側(cè)根數(shù)量増加；6)葉長(zhǎng)增加；7)葉寬増加；8)葉片重量；9)花薹數(shù)量増加；10)種子重量増加；11)花薹高度降低。所述方法還包括從導(dǎo)入SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的編碼基因的植株中篩選表達(dá)所述編碼基因的植株，得到所述轉(zhuǎn)基因植物的步驟。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)證明，導(dǎo)入SEQ ID No. 2所示的MsDREB2C的編碼基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥與受體擬南芥相比，具有如下1)-11)的特性1)抗熱脅迫；2)抗干旱脅迫；3)抗冷脅迫；4)主根長(zhǎng)度增加；5)側(cè)根數(shù)量増加；6)葉長(zhǎng)增加；7)葉寬增加；8)葉片重量；9)花薹數(shù)量増加；10)種子重量増加；11)花薹高度降低。說(shuō)明MsDREB2C及其編碼基因可用于調(diào)控植物非生物脅迫抗性以及植物生長(zhǎng)。


圖1為pCB302-3_MsDREB2C重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖譜。Μ 為 DNA Marker III，1，2 為重組質(zhì)粒 pCB302_3_MsDREB2C 酶切結(jié)果。圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定圖譜。Μ為DNA Marker III ;WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；V:擬南芥col/pCB302_3 ；1，2，3，4 為擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系。圖3 為 T3 代擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系 L_1、L_2 和 L-3 中 MsDREB2C 基因表達(dá)檢測(cè)。WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖4 為 T3 代擬南芥 col/pCB302-3-MsDREB2C 株系 L_l、L-2 和 L-3 在 1/2MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表型分析。在1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)11天，測(cè)量主根長(zhǎng)度，側(cè)根數(shù)量(B，D，E)，其中，側(cè)根數(shù)量為每厘米主根長(zhǎng)度上的側(cè)根數(shù)；在1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)21天，測(cè)量植株高度和鮮重(C，F(xiàn)，G)。平均值和標(biāo)準(zhǔn)差取自3次重復(fù)，毎次重復(fù)至少20株幼苗(Student’ st-test, #Ρ〈0· 01, *Ρ〈0· 05) ；WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖5為T3代擬南芥col/pCB302-3-MsDREB2C株系L_l、L-2和L-3在土壤中培養(yǎng)的表型分析。植株在1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)11天后轉(zhuǎn)移至土中生長(zhǎng)11天(A)，24天(B)，60天(C)。24天測(cè)量葉長(zhǎng)，葉寬，葉重(D，F(xiàn)，H)以及60天測(cè)量花薹高度，花薹數(shù)量，種子重量(E，G，I)。轉(zhuǎn)基因株系及野生型擬南芥平均值及標(biāo)準(zhǔn)差取自20棵植株(D，E，F(xiàn)，G);平均值及標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)自三次重復(fù)，每次重復(fù)選取10片葉子稱重和10棵植株稱種子重量(Student’ st-test, #Ρ〈0· 01, *Ρ〈0· 05) ；WT :哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖6為T3代擬南芥col/pCB302-3-MsDREB2C株系L_1、L-2和L-3對(duì)非生物脅迫抗性照片。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。其中，Prybest DNA 聚合酶、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RNase-Free DNase I、限制性內(nèi)切酶BamH I與Xba I，T4DNA連接酶，購(gòu)自TAKARA公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，DNA Marker購(gòu)自中科瑞泰北京生物技術(shù)有限公司。氨節(jié)青霉素、硫酸卡鈉酶素、利福平購(gòu)自北京新經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京匯 天東方科技有限公司，離心柱型質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰恒生物技術(shù)有限公司。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105購(gòu)自北京博大泰恒生物技術(shù)有限公司。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105購(gòu)自北京博大泰恒生物技術(shù)有限公司。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Analysis of the genome sequenceof the flowering plantArabidopsis thaliana. NATURE. VOL 408. 14DECEMBER 2000· www. nature, com)、雙兀植物轉(zhuǎn)化載體 pCB302_3 (Chengbin Xiang, etal. A mini binaryvector series for planttransformation. Plant Molecular Biology 40:711 - 717，1999)公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例l、MsDREB2C基因的克隆及轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建一、MsDREB2C 基因的克隆以新疆野蘋果(Malus sieversii (Ledeb. ) Roem.)水培苗為材料,CTAB法提取其葉片總RNA，以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，在5'和3'非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增新疆野蘋果MsDREB2C cDNA全長(zhǎng)。
リ丨物名稱リ丨物げ列
!:) 1 -FS'-GGATa 丁 (:Γ ..(7
(F劃線為海切位點(diǎn)βωηΗ I )
Ρ1-R51- TCTAGAAATCTGTTTCTTTGCTTTCG-3t
(ド劃線為陶切位點(diǎn)Xba I )PCR反應(yīng)體系如下在200ul離心管中加入下列組分(25ul體系)
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)氣基酸序列如SEQID No. 2所不的蛋白質(zhì)； b)將SEQID No. 2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為如下I)-4)中任一所述的基因 1)編碼權(quán)利要求I所述蛋白的DNA分子； 2)其編碼序列是SEQID No. I的第151-1347位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白的DNA分子； 4)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求I所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任一種生物材料 1)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的表達(dá)盒； 2)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體； 3)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組微生物； 4)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)在調(diào)控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和/或生殖生長(zhǎng)。
6.權(quán)利要求2或3所述的核酸分子在調(diào)控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和/或生殖生長(zhǎng)。
7.權(quán)利要求4所述的生物材料在調(diào)控植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和/或生殖生長(zhǎng)。
8.培育抗非生物脅迫和/或生長(zhǎng)增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入權(quán)利要求3所述核酸分子得到所述轉(zhuǎn)基因植物的步驟所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相t匕，對(duì)非生物脅迫的抗性提高和/或生長(zhǎng)增加；所述非生物脅迫為熱脅迫、干旱脅迫和冷脅迫中的至少一種；所述生長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和/或生殖生長(zhǎng)。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述的核酸分子全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)源于新疆野蘋果的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID No.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物非生物脅迫抗性和/或植物生長(zhǎng)相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白及其基因具有調(diào)控植物非生物脅迫抗性和調(diào)控植物生長(zhǎng)的功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102952182SQ20121051756
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者李天紅, 趙凱, 沈欣杰, 廖雄, 王琪, 劉琳琳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)