專利名稱：用于hpv檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多重核酸恒溫擴增技術，尤其涉及一種陣列式多重微流體恒溫擴增芯片。
背景技術：
人乳頭瘤病毒HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形DNA病毒。分高危險型和低危型，低危型HPV如HPV-6，11，13，32，34，40，42，43，44，53，54等與感染生殖器、肛門、口咽部、食道黏膜，特別是HPV6，11，發(fā)生率最為廣泛。高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要原因，而其中人乳頭瘤病毒16型、18型是與宮頸癌發(fā)生最密切、致病風險最高的2種高危型人乳頭瘤病毒，至少占宮頸癌的40%以上。及時快速地區(qū)分不同類型的重要HPV對于疾病的預防和治療具有至關重要的作用，無論對個人還是社會都具有重大的意義。環(huán)介導等溫核酸擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早由日本科學家發(fā)明，該技術具有靈敏度高、特異性好、反應速度快、反應結(jié)果可以直接肉眼判定等優(yōu)點，經(jīng)過近10年的學術研究，現(xiàn)以各種檢測試劑盒的形式進入市場。但是LAMP反應的“等溫模式”和其復雜的核酸探針使其很難在同一體系中實現(xiàn)一個樣品中多種目標物的同時檢測，即多重檢測。微流控技術是在微米尺度結(jié)構中操控納升至皮升體積流體的技術與科學，在該尺度下大幅度增強的層流效應、表面張力效應、毛細效應、熱傳導效應及擴散效應，使許多物理和化學過程發(fā)生了質(zhì)的變化，是當前正在急速發(fā)展的高新技術和科技前沿領域之一，是未來生命科學、化學與信息科學發(fā)展的重要技術平臺，該技術的應用可以實現(xiàn)LAMP反應的多重檢測模式
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種用于高危HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片，它包括毛細管通道、連接管道、加樣孔、若干擴增池和若干探針注入孔，所述加樣孔與毛細管通道相通，所有擴增池的一端均通過連接管道與毛細管通道連通，另一端各與一探針注入孔連通；其中，一個擴增池中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ ID N0.25- SEQID N0.28所示的DNA序列，另一個擴增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，所述陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度；其余擴增池I中分別包被上針對目標核酸片段的特異性探針；所述針對目標核酸片段的特異性探針由針對HPV-6，11的具有SEQ IDN0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針、針對 HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQ IDN0.18所示的DNA序列的探針和針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針中的一種或多種組成。進一步地，所述連接管道呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴增池相連，橫截面小的一端與毛細管通道相連，使微流體從毛細管通道平穩(wěn)均勻的流入擴增池，且不產(chǎn)生氣泡。所述擴增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細管通道的寬度和深度一般￡0.3mm都可以。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴增芯片可應用于快速合并檢測HPV6型和HPVll型的核酸，分型檢測HPV16型和HPV18型的核酸。


圖1是陣列式多重微流體恒溫擴增芯片的結(jié)構示意 圖中，擴增池1、連接管道2、毛細管通道3、加樣孔4、探針注入孔5。
具體實施例方式如圖1所示， 本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴增芯片包括毛細管通道3、加樣孔4、若干擴增池I和若干探針注入孔5，加樣孔4與毛細管通道3相通，所有擴增池I的一端均通過連接管道2與毛細管通道3連通，另一端各與一探針注入孔5連通。一個擴增池I中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ ID N0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列，一個擴增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度。除上述分別置有陽性探針和陰性探針的擴增池I外，其余擴增池I中分別包被上針對目標核酸片段的特異性探針。如針對HPV-6，11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針，針對 HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13- SEQ ID N0.18所示的DNA序列的探針，針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。擴增池I的數(shù)量可以根據(jù)目標物檢測的需求設計，如三重、四重、五重或十重等，不受限制。毛細管通道3主要是利用其物理限域(低質(zhì)量傳遞系數(shù))的特性限制每個擴增池中的特異性核酸探針和反應產(chǎn)物在不同池中的交叉污染，同時也利用毛細管的拉力便于樣品和反應液的進樣。擴增池I和毛細管通道3之間用連接管道2連通，連接管道2呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴增池I相連，橫截面小的一端與毛細管通道3相連，使微流體從毛細管通道3平穩(wěn)均勻的流入擴增池4，且不產(chǎn)生氣泡。擴增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細管通道的寬度和深度一般￡0.3_都可以；連接管道2的空間尺寸根據(jù)擴增池I和毛細管通道3的尺寸來定，主要起到一種均勻連接效果。本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴增芯片通過以下步驟制備得到:
1、芯片模板的制作:利用微加工技術(MEMS、光刻等)的方法制作芯片模板，模板結(jié)構與上述陣列式多重微流體恒溫擴增芯片相對應，模板材料可以為硅材料。2、芯片澆注，脫氣和固化:將二甲基硅氧烷和固化劑按質(zhì)量比5-12:1混合均勻后，小心傾倒于芯片模板上，真空脫氣30 min后80°C固化2h，所述固化劑是烷氧基硅烷，開加樣孔4和探針注入孔5后，通過等離子處理后，與玻片永久鍵合。3、功能化芯片:將目標核酸對應的探針，陽性探針和陰性探針分別通過冷凍干燥技術包被于芯片對應的擴增池I中，完成功能化芯片，該芯片可以在4°C左右長期保存。實施例我們利用此陣列式多重微流體恒溫擴增技術平臺，開發(fā)了一款五通道的人乳頭瘤HPV病毒6/11，16，18分型的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片。在此五槽道陣列式微流控恒溫擴增芯片中，我們在I，2，3擴增池中包被上針對四種重要HPV目的基因的特異性探針(Probe 6+11，Probe 16和Probe 18)，在擴增池4中包被陽性內(nèi)參核酸探針，擴增池5中作為陰性內(nèi)參。我們通入2 μ L樣品，再滴入 30 uL LAMP反應液，封閉反應孔，在63°C下恒溫反應I h (LAMP反應液成分見表I)。在包被有目標物探針的擴增池中出現(xiàn)了LAMP信號的肉眼可見的綠色。我們分別用HPV樣品對芯片進行驗證。結(jié)果如下:對于樣品HPV6/11, HPV 16和HPV18，在相應探針包被的擴增池中出現(xiàn)了綠色擴增信號，而陰性內(nèi)參對照池中沒有擴增信號的出現(xiàn)，結(jié)果符合預期，且沒有出現(xiàn)擴增池之間的交叉污染，檢測結(jié)果可靠。
表I LAMP反應液成分
權利要求
1.一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片，其特征在于，它包括毛細管通道(3)、加樣孔(4)、若干擴增池(I)和若干探針注入孔(5)，所述加樣孔(4)與毛細管通道(3)相通，所有擴增池(I)的一端均通過連接管道(2)與毛細管通道(3)連通，另一端各與一探針注入孔(5)連通；其中，一個擴增池(I)中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ IDN0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列，另一個擴增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，所述陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度；其余擴增池I中分別包被上針對目標核酸片段的特異性探針；所述針對目標核酸片段的特異性探針為針對HPV-6，11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12所示的DNA序列的探針、針對HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQID N0.18所示的DNA序列的探針或針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。
2.根據(jù)權利要求1所述用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片，其特征在于，所述連接管道(2)呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴增池(I)相連，橫截面小的一端與毛細管通道(3)相連，使微流體從毛細管通道(3)平穩(wěn)均勻的流入擴增池(I )，且不產(chǎn)生氣泡。
3.根據(jù)權利要求1所述用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片，其特征在于，所述擴增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細管通道的寬度和 深度一般￡0.3_都可以。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴增芯片，該芯片以聚二甲基硅氧烷為材料，利用微加工技術，通過澆注法制備而成。該芯片基本結(jié)構由三部分組成擴增池，連接管道和毛細管通道?？臻g陣列有序排列的系列擴增池通過冷凍干燥技術包被上核酸探針，利用擴增信號的空間區(qū)分來實現(xiàn)一個樣品中多重核酸目標物的同時檢測；毛細管通道通過毛細拉力實現(xiàn)反應液和樣品的注入，同時利用其自身的低質(zhì)量傳遞系數(shù)有效阻止核酸探針和擴增產(chǎn)物及信號在不同擴增池間的相互影響；擴增池和毛細管通道之間用連接管道連通，使流體平穩(wěn)均勻的流入擴增池。該芯片制作簡單，操作方便，為LAMP方法實現(xiàn)臨床多種病原體同時檢測提供了有效方案。
文檔編號C12Q1/70GK103114033SQ201210443488
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權日2012年11月8日
發(fā)明者方雪恩, 徐凌佳, 陳旭 申請人:杭州騰越生物科技有限公司