專利名稱：一種蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以蝙蝠蛾菌擬青霉菌株液體發(fā)酵并從其發(fā)酵液中分離得到胞外酸性糖蛋白的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴的強(qiáng)壯、滋補(bǔ)藥材，其對(duì)于人類生產(chǎn)和生活真正巨大的價(jià)值在于它們能產(chǎn)生多種在生物技術(shù)及醫(yī)藥保健上有重要價(jià)值的生理活性物質(zhì)。它們的生理活性豐富多彩，可抗菌、抗腫瘤、抗血小板凝結(jié)、抗福射、改善和提高記憶力、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力、鈣離子拮抗、對(duì)腦和心臟在常壓缺氧下有保護(hù)作用、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等。由于天然冬蟲夏草嚴(yán)格的寄生性與特殊的生態(tài)環(huán)境要求，其資源極其有限，價(jià)格昂貴。近年來(lái)，隨著冬蟲夏草無(wú)性型研究的進(jìn)展，有關(guān)蟲草無(wú)性型多糖的研究才開(kāi)展起來(lái)。冬蟲夏草可以通過(guò)生物工程的方法進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，對(duì)人工培養(yǎng)的冬蟲夏草菌絲體，經(jīng)化學(xué)、藥理研究，證明與天然蟲草基本一致，經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，被醫(yī)藥界公認(rèn)為可以作為冬蟲夏草的替代品，中華人民共和國(guó)2000年版藥典已有明確的規(guī)定。同時(shí)，蟲草無(wú)性型發(fā)酵液中也富含蛋白質(zhì)、維生素、鋅、銅等微量元素以及蟲草酸(D —甘露醇)、蟲草素(3'-脫氧腺嘌呤核苷)、多糖類、生物堿類、環(huán)狀肽類、SOD酶類等多種生物活性物質(zhì)。其中，多糖類作為冬蟲夏草所含的生理活性物質(zhì)中最重要最豐富的類群之一，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生理功能，是冬蟲夏草開(kāi)發(fā)研究的一個(gè)重要突破口，具有良好的應(yīng)用前
旦
-5^ O蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)是蟲草無(wú)性型的一種,本菌株于2002年分離自青海省玉樹(shù)地區(qū)的天然蟲草子實(shí)體中，并由中科院菌種保藏中心鑒定。由于蟲草分布的廣泛性和無(wú)性型菌株的多樣性，不同科研機(jī)構(gòu)對(duì)無(wú)性型蟲草的研究有很大差異，而關(guān)于利用該菌株液體發(fā)酵并從發(fā)酵液中分離胞外酸性糖蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在提供一種制備蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的方法，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案如下(I)從保存于土豆斜面培養(yǎng)基上的母種中挖取菌絲體塊(大小為O. 5cmX0. 5cm),接種于種子培養(yǎng)基中(每只250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基IOOmL)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時(shí)，即可獲得種子液。種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30. 00，酵母膏6. 00，磷酸二氫鉀I. 50，硫酸鎂O. 50，麥芽汁10. 00，土豆汁10. 00，pH 6.5。(2)取步驟(I)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(每只500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基200mL)，接種量為1% (V/V)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120小時(shí)后，將發(fā)酵產(chǎn)物離心分離(離心分離條件4000rmp，15min)獲得蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):蔗糖50. 86，酵母膏2. 00，硫酸銨6. 61，磷酸二氫鉀I. 36，硫酸鎂 O. 05，土豆汁 15. 00，麥芽汁 15. 00，pH 6. 5 ；
(3)將步驟(2)中獲得的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液，50°C減壓濃縮至原體積的1/2，加3倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀12小時(shí)，用80%乙醇洗滌3次后，離心分離(離心分離條件4000rmp, 15min),獲得胞外粗多糖。(4)將步驟(3)制得的胞外粗多糖通風(fēng)揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用Sevag法(氯仿正丁醇=4 I)脫蛋白3次后，將水相溶液冷凍干燥獲得粗多糖冷凍干粉。(5)將步驟(4)所得粗多糖溶解后，上樣于DEAE-52纖維素柱，并分別用去離子水、O. Imol/LNaCI和O. 3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，將收集的O. 3mol/L NaCl洗脫組分進(jìn)行減壓濃縮，去離子水透析72小時(shí)，濃縮后冷凍干燥，即得到胞外酸性糖蛋白組分。制備的胞外酸性糖蛋白為灰白色粉末，其中多糖含量80. 56%，蛋白質(zhì)含量18. 76%。(6)將步驟(5)所得胞外酸性糖蛋白用分子排阻色譜檢測(cè)其分子量分布情況，用紅外光譜分析特征基團(tuán)組成，用紫外光譜掃描確定其是否具有蛋白質(zhì)組分。 2、根據(jù)專利要求I所述的一種具有生物活性胞外酸性糖蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):蔗糖50. 86，酵母膏2. 00，硫酸銨6. 61，磷酸二氫鉀I. 36，硫酸鎂O. 05，土豆汁15. 00，麥芽汁15. 00，pH 6. 5。制備的蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白為灰白色粉末，其中多糖含量80. 56%，蛋白含量18. 76%，容易吸潮。該酸性糖蛋白的紅外吸收光譜表明其具有多糖、羧基、硫酸基和氨基的特征吸收峰。該胞外酸性糖蛋白的紫外吸收掃描表明其含有蛋白的吸收峰。對(duì)該胞外糖蛋白的分子量進(jìn)行測(cè)定，表明其分子量分布在20-80kD之間。


圖I培養(yǎng)基組成對(duì)蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白產(chǎn)量的影響圖2蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的紅外吸收?qǐng)D譜圖3蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白糖的紫外掃描圖譜
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例I :(I)從保存于土豆斜面培養(yǎng)基上的母種中挖取出菌絲體塊(大小為O. 5cmX0. 5cm)，接種于種子培養(yǎng)基中(每只250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基IOOmL)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時(shí)，即可獲得種子液。種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30. 00，酵母膏6. 00，磷酸二氫鉀I. 50，硫酸鎂O. 50，麥芽汁10. 00，土豆汁10. 00，pH 6. 5，。(2)取步驟(I)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(每只500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基200mL)，接種量為1% (V/V)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120小時(shí)后，將發(fā)酵產(chǎn)物離心分離(離心分離條件4000rmp，15min)獲得蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):蔗糖50. 86，酵母膏2. 00，硫酸銨6. 61，磷酸二氫鉀I. 36，硫酸鎂O. 05，土豆汁 15. 00，麥芽汁 15. 00，pH 6. 5 ；(3)將步驟(2)中獲得的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液，50°C減壓濃縮至原體積的1/2，加3倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀12小時(shí)，用80%乙醇洗滌3次后，離心分離(離心分離條件4000rmp, 15min),獲得胞外粗多糖。(4)將步驟(3)制得的胞外粗多糖通風(fēng)揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用Sevag法(氯仿正丁醇=4 I)脫蛋白3次后，將水相溶液冷凍干燥獲得粗多糖冷凍干粉。(5)將步驟(4)所得粗多糖溶解后，上樣于DEAE-52纖維素柱，并分別用去離子水、
O.Imol/LNaCI和O. 3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，將收集的O. 3mol/L NaCl洗脫組分進(jìn)行減壓濃縮，去離子水透析72小時(shí)，濃縮后冷凍干燥，即得到胞外酸性糖蛋白組分。制備的胞外酸性糖蛋白為灰白色粉末，其中多糖含量80. 56%，蛋白質(zhì)含量18. 76%。(6)將步驟(5)所得胞外酸性糖蛋白用分子排阻色譜檢測(cè)其分子量分布情況，用紅外光譜分析特征基團(tuán)組成，用紫外光譜掃描確定其是否具有蛋白質(zhì)組分。 實(shí)施例2 蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(I)蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的發(fā)酵條件優(yōu)化單因素篩選試驗(yàn)①部分因素設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件顯著因素的篩選。蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白發(fā)酵條件因素以及代碼為葡萄糖(X1),玉米粉(X2)，酵母膏(X3)，硫酸銨(X4)，KH2PO4 (X5)，MgSO4 (X6)，土豆汁(X7)，麥芽汁(X8)的中心點(diǎn)(O)分別為(g/L) =30,10,2,6,1,0. 5，10，10，步長(zhǎng)分別為=10,5,1,1,0. 5,0. 2，5，5。20 組試驗(yàn)的蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的產(chǎn)量見(jiàn)表I。表I發(fā)酵培養(yǎng)基顯著性條件篩選
權(quán)利要求
1.一種蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)從保存于土豆斜面培養(yǎng)基的母種中挖取菌絲體塊(大小為O.5cmX0. 5cm),接種于種子培養(yǎng)基中(每只250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基IOOmL)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時(shí)，即可獲得種子液。種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30. 00，酵母膏6.00，磷酸二氫鉀I. 50，硫酸鎂O. 50，麥芽汁10. 00，土豆汁10. 00，ρΗ6· 5。
(2)取步驟(I)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(每只500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基200mL)，接種量為1% (V/V)，于17°C下靜止培養(yǎng)12小時(shí)后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120小時(shí)后，將發(fā)酵產(chǎn)物離心分離(離心分離條件4000rmp，15min)獲得蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):蔗糖50. 86，酵母膏2. 00，硫酸銨6. 61，磷酸二氫鉀I. 36，硫酸鎂O. 05，土豆汁 15. 00，麥芽汁 15. 00，ρΗ6· 5 ； (3)將步驟(2)中獲得的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液，50°C減壓濃縮至原體積的1/2，加3倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀12小時(shí)，用80%乙醇洗滌3次后，離心分離(離心分離條件4000rmp, 15min),獲得胞外粗多糖。
(4)將步驟(3)制得的胞外粗多糖通風(fēng)揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用Sevag法(氯仿正丁醇=4 I)脫蛋白3次后，將水相溶液冷凍干燥獲得粗多糖冷凍干粉。
(5)將步驟(4)所得粗多糖溶解后，上樣于DEAE-52纖維素柱，并分別用去離子水、O. Imol/LNaCI和O. 3mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，將收集的O. 3mol/L NaCl洗脫組分進(jìn)行減壓濃縮，去離子水透析72小時(shí)，濃縮后冷凍干燥，即得到酸性糖蛋白組分。制備的酸性糖蛋白為灰白色粉末，其中多糖含量80. 56%，蛋白質(zhì)含量18. 76%。
(6)將步驟(5)所得酸性糖蛋白用分子排阻色譜檢測(cè)其分子量分布情況，用紅外光譜分析特征基團(tuán)組成，用紫外光譜掃描確定其是否具有蛋白質(zhì)組分。
2.根據(jù)專利要求I所述的一種蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):蔗糖50. 86，酵母膏2. 00，硫酸銨6. 61，磷酸二氫鉀I. 36，硫酸鎂O. 05，土豆汁15. 00，麥芽汁15. 00, pH6. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白的制備方法。該方法包括通過(guò)蝙蝠蛾擬青霉菌株的一級(jí)種子培養(yǎng)，接種發(fā)酵，獲得蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液，所得的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、去離子水復(fù)溶、脫蛋白、冷凍干燥、DEAE-52柱層析等工序分離出蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白。本發(fā)明的工藝方法具有工藝簡(jiǎn)單、提取條件溫和、成本低、對(duì)環(huán)境友好，易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，所得到的蝙蝠蛾擬青霉胞外酸性糖蛋白可用作藥品和保健食品原料。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102936609SQ20121043409
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者曾曉雄, 武忠偉 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)