從生物樣本提取核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了從生物樣本提取核酸的方法。從生物樣本提取核酸的方法包括：裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸，其中，裂解所述生物樣本進一步包括：利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對所述生物樣本進行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對所述沉淀進行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。利用該方法可以有效地從生物樣本中提取核酸。
【專利說明】從生物樣本提取核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物學(xué)，具體地，本發(fā)明涉及收集流體中微生物和提取核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]空氣是人類賴以生存的環(huán)境，也是微生物擴散與傳播疾病的介質(zhì)，空氣中微生物主要包括細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌等多種微生物，這是空氣污染的主要組成部分，這些微生物的產(chǎn)生與人類活動有密切的關(guān)系?？諝庵形⑸镏饕獊碓从谧匀唤绲乃w、土壤、動植物和人類，農(nóng)業(yè)活動、動物飼養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)、污水處理、發(fā)酵過程和食品生產(chǎn)廠等，空氣中微生物的多少是空氣質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。要了解空氣中的微生物就必須將微生物富集，以便觀察和分析，這就需要特殊設(shè)計的空氣微生物采樣器。
[0003]空氣微生物采樣方法主要分為自然沉降法和機器采樣法。自然沉降法是利用空氣微生物粒子的重力作用，在一定的時間內(nèi)，讓所處區(qū)域的空氣中微生物顆粒逐步沉降到帶有培養(yǎng)介質(zhì)的平皿內(nèi)的一種采樣方法。由于此方法是被動取樣，采樣條件難以控制，微生物粒子的漂移、擴散和沉降會受到風(fēng)力、電力、磁力、熱力、浮力和擴散力等各種力的干擾，因此這種采樣方法會造成很大的誤差。機器采樣法是用采樣器來采樣，根據(jù)采樣原理，采樣器可分為沉降式、撞擊式、離心撞擊式、過濾式、靜電式、氣旋式等。此外，還有溫差迫降類和生物類。各種采樣器的研制和使用大大推動了空氣微生物學(xué)的發(fā)展，但仍無一種采樣器是十全十美的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種從生物樣本中提取核酸的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種從生物樣本中提取核酸的方法。該提取方法包括:裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸，其中，裂解所述生物樣本進一步包括:利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對所述生物樣本進行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對所述沉淀進行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明實施例的從生物樣本提取核酸的方法，可以有效地從生物樣本中提取核酸，對微生物破壁的效果明顯，可以同時提取DNA和RNA，特別是RNA的完整性和純度都非常高， 同時這種方法也適用于各種環(huán)境樣品例如空氣中微生物的核酸的提取。
[0006]根據(jù)本發(fā)明實施例的從生物樣本提取核酸的方法可用于收集各種不同開放環(huán)境的空氣樣本，不僅覆蓋面廣而且操作簡便。另外，本發(fā)明中提供的提取空氣樣本核酸的方法非常有效。
[0007]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0009]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的收集流體中微生物的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，其中A、B和C分別顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的收集流體中微生物的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖；
[0010]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的收集流體中微生物的設(shè)備的過濾收集組件的立體分解示意圖；
[0011]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的從空氣樣本中提取RNA后用2100芯片檢測的結(jié)果圖；
[0012]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的空氣樣本核酸(DNA和RNA)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的電泳圖；
[0013]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的只采用溶菌酶提取空氣樣本IRNA提取后用2100芯片檢測的結(jié)果圖；
[0014]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的只采用溶菌酶空氣樣本I核酸(DNA和RNA)用
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的電泳圖；
[0015]圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明另一實施例的采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測從胃瘤樣本中提取的核酸片段大小，Nanodrop儀器檢測DNA濃度及純度；以及
[0016]圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明又一實施例的采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測從牙菌斑樣本中提取的核酸片段大小，Nanodrop儀器檢測DNA濃度及純度。
【具體實施方式】
[0017]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0018]本發(fā)明提供了一種從生物樣本中提取核酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該提取核酸的方法包括以下步驟:裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，裂解所述生物樣本進一步包括:利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對所述生物樣本進行消化；將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及利用裂解液，對所述沉淀進行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一個示例，優(yōu)選地，所述溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的比例為1:1:lo發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過采用溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的組合，能夠有效地對生物樣本進行消化，從而能夠以顯著高于現(xiàn)有技術(shù)的效率，從生物樣本尤其是從空氣中所收集的微生物中提取核酸。為此，根據(jù)本發(fā)明實施例的從生物樣本提取核酸的方法，可以有效地從生物樣本中提取核酸，尤其是對微生物破壁的效果明顯，可以同時提取DNA和RNA，特別是RNA的完整性和純度都非常高，同時這種方法也適用于各種環(huán)境樣品例如空氣中微生物的核酸的提取。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以用于本發(fā)明的裂解液的類型并不受特別限制根據(jù)本發(fā)明的一些實施例， 所述裂解液可以含有200mmol/L NaCl, 100mmol/LTris-HCl, pH
8.0, 2.0%SDS, 50mmol/L EDTA, 0.5%Triton X-100。根據(jù)本發(fā)明的一個實例，所述裂解液中可以進一步含有蛋白酶K。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述裂解是在50-55攝氏度下進行的。由此，可以進一步提高裂解生物樣品尤其是從微生物樣品的效率，從而進一步提高從生物樣品提取核酸的效率。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實施例，從該裂解產(chǎn)物中分離核酸進一步包括:對所述裂解產(chǎn)物進行離心，收集第一上清液；將含有酚、氯仿和異戊醇的混合物與所述第一上清液按照等體積混合，進行離心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、氯仿和異戊醇的混合物中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ;將含有氯仿和異戊醇的混合物與所述第二上清液按照等體積混合，進行離心后，收集第三上清液；以及將含有異丙醇和醋酸鈉的混合物與所述第三上清液按照0.7:1的體積比混合，進行離心后，收集核酸沉淀。由此，可以進一步顯著地提高所得到核酸樣品的純度。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以利用本發(fā)明的方法提取核酸的樣品來源并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所采用的生物樣本是從流體收集的微生物樣本。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過下列方法從流體收集微生物樣本:
[0022]在壓力差的作用下，使含有微生物的流體通過濾膜，其中，所述濾膜進樣側(cè)的壓力高于所述濾膜出樣側(cè)的壓力，所述濾膜的孔徑使得所述微生物被截留在所述濾膜上。由此，可以有效地從流體中收集微生物樣本，從而進一步提高從生物樣品提取核酸的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以利用本發(fā)明的方法進行處理的微生物樣本類型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些實例，所述微生物可以為選自細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌的至少之一。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的流體類型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，可以采用的流體為氣體，例如可以為空氣。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以有效地從氣體例如空氣中收集微生物樣品。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實施例，壓力差是通過所述出樣側(cè)形成空氣的定向流動形成的，其最佳壓力范圍是高于lOOOPa，并且不超過3000Pa。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)壓力差不超過1000Pa時，流體尤其是空氣將難以有效地通過濾膜，從流體尤其是空氣中收集生物樣本尤其是微生物的效率將顯著降低，而當(dāng)壓力超過3000Pa時，生物樣本尤其是微生物樣本將難以停留在濾膜上，從而收集生物樣本尤其是微生物的效率也將顯著降低。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個示例，所述濾膜的孔徑大小并不受特別限制，可以為0.1~10微米。根據(jù)本發(fā)明的實例，所述濾膜的種類也不受特別限制，可以為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選醋酸纖維膜，因為醋酸纖維膜具有很高的流速和熱穩(wěn)定性以及非常低的吸附，非常適合除菌過濾。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述醋酸纖維膜的孔徑可以為0.22微米。
[0026]為了方便理解，下面對可以用于實施從流體尤其是空氣收集生物樣本尤其是微生物的設(shè)備進行描述。
[0027]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還提出了一種用于從流體尤其是空氣中收集微生物的設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參考圖1A~C，該設(shè)備1000發(fā)明的實施例，收集流體中微生物的設(shè)備1000包括:本體100、過濾收集組件200以及負(fù)壓發(fā)生組件300。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實施例，本體100內(nèi)限定有負(fù)壓腔110，負(fù)壓發(fā)生裝置300設(shè)置在負(fù)壓腔110內(nèi)，用于在負(fù)壓腔110內(nèi)形成負(fù)壓，過濾收集組件200設(shè)置在負(fù)壓腔110的至少一偵牝以便使得流體可以 通過過濾收集組件200進入負(fù)壓腔110。[0029]根據(jù)本發(fā)明實施例的用于收集流體中微生物的設(shè)備采用了非自然沉降的富集方式，可以克服被動取樣，防止微生物的漂移、擴散和受到風(fēng)力、電力、磁力、熱力、浮力和擴散力等各種里的干擾。尤其是，通過采用主動式的直接吸入過濾收集方法，可實現(xiàn)對全部微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒等在內(nèi)的一次性同步收集，這克服了現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基采樣方法的缺陷，從而有效地收集流體中微生物樣本。在現(xiàn)有的培養(yǎng)基采樣方法，由于營養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式差異，會造成空氣微生物收集的局限性。
[0030]需要說明的是，雖然在附圖中所給出的設(shè)備是立式的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，也可以采用其他形式，例如臥式。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的實施例，負(fù)壓發(fā)生組件300的類型并不受特別限制，例如可以為抽真空裝置。另外，參考圖1B和C，負(fù)壓發(fā)生組件300進一步包括葉片320 ;驅(qū)動裝置310，所述驅(qū)動裝置320與所述葉片310通過連接桿330相連，用于驅(qū)動所述葉片轉(zhuǎn)動。從而通過葉片310的轉(zhuǎn)動，驅(qū)動負(fù)壓腔110內(nèi)空氣的流動，可以在負(fù)壓腔內(nèi)形成局部負(fù)壓，從而驅(qū)動流體通過過濾收集組件200進入負(fù)壓腔110。根據(jù)本發(fā)明的示例，在與所述過濾收集組件相對的側(cè)壁上形成有通孔120。由此，可以在葉片310的轉(zhuǎn)動過程中，將負(fù)壓腔110中的氣體排出負(fù)壓腔110，從而可以在負(fù)壓腔110中形成持續(xù)穩(wěn)定的負(fù)壓，從而有效地提高了收集生物樣本尤其是微生物樣本的效率。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一些實例，所述葉片310與過濾收集組件200相對設(shè)置，并且過濾收集組件可拆卸地與所述殼體相連。由此，可以進一步有效地通過葉片旋轉(zhuǎn)帶動空氣流動，并從通孔120將空氣排出，從而在負(fù)壓腔110種形成負(fù)壓，簡單方便地形成負(fù)壓。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的實施例，收集流體中微生物的設(shè)備1000進一步包括:限位部件400，所述限位部件400設(shè)置在所述本體110上，用于對所述過濾收集組件200進行限位。根據(jù)本發(fā)明的一些實例，限位部件400可移動地設(shè)置在所述本體110上。由此，可以對過濾收集組件200的位置進行限定。
[0034]參考圖2根據(jù)本發(fā)明的示例，過濾收集組件200包括:濾膜22 ;膜前收集網(wǎng)格槽21 ;和膜后網(wǎng)式襯墊23，其中，所述濾膜22設(shè)置在所述膜前收集網(wǎng)格槽21和所述膜后網(wǎng)式襯墊23之間。根據(jù)本發(fā)明的實施例，濾膜22的孔徑大小并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以為0.1~10微米。所述濾膜的種類也不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的一個實例，所述濾膜優(yōu)選為醋酸纖維膜。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的實施例，過濾收集組件200進一步包括:密封框架24，所述密封框架24設(shè)置于膜前收集網(wǎng)格槽21和膜后網(wǎng)式襯墊23之間，用于對收集網(wǎng)格槽24與膜后網(wǎng)式襯墊22進行密封。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該密封框架24的材質(zhì)并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的示例，所述框架可以為橡膠框架。由此，可保證膜前收集網(wǎng)格槽24與膜后網(wǎng)式襯墊22的密封連接。
[0036]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者 ，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Illumina公司。
[0037]實施例1
[0038]1、樣本收集前準(zhǔn)備
[0039]根據(jù)圖1C和圖2所示結(jié)構(gòu)，取一塊新的醋酸纖維素膜，將過濾收集組件與殼體連接，準(zhǔn)備好收集裝備。
[0040]2、樣本收集
[0041]將空氣富集裝置開關(guān)打開，在1000Pa〈H≤3000Pa壓力下，分別在兩個釀酒廠的車間內(nèi)連續(xù)開機抽氣3天，抽氣結(jié)束后，取出網(wǎng)格槽內(nèi)濾膜，在超凈臺內(nèi)，撕下濾膜收集菌體,收集得空氣樣本I和空氣樣本2。
[0042]3、空氣樣本核酸提取
[0043]將收集到的菌體與撕下來的表層濾膜一起置于50mL離心管中，向其中加入20mLΤΕ,200μ L 1011^/11^溶菌酶、20(^1^ 10mg/mL 蝸牛酶和 200 μ L 10mg/mL 溶壁酶，吹吸混勻，37°C溫育過夜，消化同時用混勻儀混勻(過夜消化)；將所得消化液在4°C 9000r/min下離心IOmin,棄去上清液；向沉淀中加入6mL TENS裂解液(200mmol/L NaCl, IOOmmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 2.0%SDS, 50mmol/L EDTA, 0.5%Triton X-100)和 20mg/mL 蛋白酶 K300 μ L，顛倒混勻，55°C溫浴lh，每隔15min顛倒混勻一次；將裂解后樣品在4°C 1000Or/min條件下離心IOmin,留取上清液,棄去沉淀；向所得上清液中加入等體積的酹:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，然后在4°C 12000r/min下離心IOmin ;轉(zhuǎn)移所得上清液至新管，向其中加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),充分混勻,在4°C 12000r/min下離心IOmin ;將所得上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，向其中加入0.7倍體積異丙醇和100 μ L 5Μ醋酸鈉，沉淀2h后,在4? 13000rpm條件下離心30min ;棄去所得上清液,用冰預(yù)冷的75%乙醇漂洗沉淀二次，在4°C 13000rpm條件下離心5min ;棄去上清液,風(fēng)干,沉淀用30 μ L無菌水溶解,若只提取RNA，可加入I μ L無RNA酶的DNA酶I來溶解沉淀；然后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，Nanodrop儀器和2100芯片分別檢測所提取核酸的DNA和RNA濃度及純度。
[0044]4、空氣樣本提取結(jié)果
[0045]圖3顯示了從空氣樣本中提取RNA后用2100芯片檢測的結(jié)果圖；圖4顯示了空氣樣本核酸(DNA和RNA)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的電泳圖。
圖3示出了:
【權(quán)利要求】
1.一種從生物樣本提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: 裂解所述生物樣本，以便得到含有核酸的裂解產(chǎn)物；以及 從所述裂解產(chǎn)物中分離所述核酸， 其中，裂解所述生物樣本進一步包括: 利用含有溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的混合物，對所述生物樣本進行消化； 將消化產(chǎn)物離心，收集沉淀；以及 利用裂解液，對所述沉淀進行裂解，以便得到所述含有核酸的裂解產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶、蝸牛酶和溶壁酶的質(zhì)量比為1:1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有200mmol/LNaCl,100mmoL/L Tris-HCl,pH 8.0,2.0%SDS,50mmol/L EDTA，0.5%Triton X-100， 任選地，所述裂解液中進一步含有蛋白酶K， 任選地，所述裂解是在50~55攝氏度下進行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述裂解產(chǎn)物中分離核酸進一步包括: 對所述裂解產(chǎn)物進 行離心，收集第一上清液； 將含有酚、氯仿和異戊醇的混合物與所述第一上清液按照等體積混合，進行離心后，收集第二上清液，其中，所述含有酚、氯仿和異戊醇的混合物中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ； 將含有氯仿和異戊醇的混合物與所述第二上清液按照等體積混合，進行離心后，收集第二上清液；以及 將含有異丙醇和醋酸鈉的混合物與所述第三上清液按照0.7:1的體積比混合，進行離心后，收集核酸沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣本是通過下列步驟從流體中收集的微生物樣本: 在壓力差的作用下，使含有微生物的流體通過濾膜， 其中， 所述濾膜進樣側(cè)的壓力高于所述濾膜出樣側(cè)的壓力， 所述濾膜的孔徑使得所述微生物被截留在所述濾膜上， 任選地，所述流體為氣體， 任選地，所述氣體為空氣， 任選地，所述壓力差是通過所述出樣側(cè)空氣的定向流動形成的，優(yōu)選，所述壓力差為1000Pa〈H ≤ 3000Pa, 任選地，所述微生物為選自細(xì)菌、真菌、病毒和放線菌的至少之一。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾膜的孔徑為0.1~10微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述濾膜為選自尼龍膜濾膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和醋酸纖維膜的至少之一。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述濾膜為醋酸纖維膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述醋酸纖維膜的孔徑為0.22微米。
【文檔編號】C12N15/10GK103725670SQ201210389988
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月15日
【發(fā)明者】郭晶, 章文蔚, 肖亮, 李子華 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院