專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚(yú)類(lèi)分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法。
背景技術(shù)：
羅非魚(yú)(Tilapia)原產(chǎn)于非洲，該魚(yú)上世紀(jì)50年代引入我國(guó)，得到了較快發(fā)展，現(xiàn)在我國(guó)已是世界上最大的羅非魚(yú)生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。我國(guó)主要養(yǎng)殖的羅非魚(yú)品種有尼羅羅非魚(yú)iOreochromis niloticus),奧利亞羅非魚(yú)iOreochromis aureus)和奧尼雜交羅非魚(yú)等。由于不同品種的羅非魚(yú)有很大的形態(tài)特征重疊，這使形態(tài)上鑒別不同羅非魚(yú)品種非常困難。另外，羅非魚(yú)品種間很容易雜交，且雜種可育，雜交種形態(tài)又與親本很相似，因此，很容易造成羅非魚(yú)種質(zhì)混雜，導(dǎo)致優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀退化，這也是目前制約我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的突出問(wèn)題。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)在DNA水平上尋找不同羅非魚(yú)品種的差異，可以快速、準(zhǔn) 確鑒別不同羅非魚(yú)品種，為羅非魚(yú)的品種鑒定、種質(zhì)保護(hù)等提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)，在羅非魚(yú)種質(zhì)鑒定、保種和選育中有極大的應(yīng)用價(jià)值。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法，包括以下步驟
(1)采集待鑒別的羅非魚(yú)的血液、鰭條或其他組織樣品，采用DNA提取法提取基因組
DNA ；
(2)用步驟(I)獲得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3 )對(duì)步驟(2 )的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；
(4)根據(jù)PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及奧利亞羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)雜交魚(yú)尼羅羅非魚(yú)電泳檢測(cè)結(jié)果有I條178bp的條帶，奧利亞羅非魚(yú)有I條187bp的條帶，尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)的雜交魚(yú)有2條條帶，分別為178bp和187bp。步驟(2)中，PCR擴(kuò)增采用的正義引物序列為5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反義引物為5' AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3' ACR體系總體積20 μ ，其中含IOX反應(yīng)緩沖液 2 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L,上下游引物各 O. 2 μ mol/L，Taq 酶 O. 5U，DNA模板100 ng 200 ng,用滅菌雙蒸懼水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為94O 2min ；94°C50s，50°C退火 50s，72°C 50min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5 min，4°C保存。步驟(3)中，電泳檢測(cè)的方法可采用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。本發(fā)明的有益效果運(yùn)用本發(fā)明所述的方法，可以在分子水平快速準(zhǔn)確地同時(shí)將奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)區(qū)別開(kāi)來(lái)。


圖I為奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其兩者的雜交魚(yú)PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，
其中M :分子量標(biāo)準(zhǔn)
1-8 :奧尼羅非魚(yú)
9-14 :尼羅羅非魚(yú)(早)X奧利亞羅非魚(yú)(古)
15-20 :尼羅羅非魚(yú)( ) X奧利亞羅非魚(yú)(早)
21-28 :尼羅羅非魚(yú)； 圖2為待檢奧利亞羅非魚(yú)PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，
其中M :分子量標(biāo)準(zhǔn) 1-36 :待檢奧尼羅非魚(yú)
37-39 :尼羅羅非魚(yú)(早)X奧利亞羅非魚(yú)( );
圖3為待檢尼羅羅非魚(yú)PCR電泳檢測(cè)結(jié)果，
其中M :分子量標(biāo)準(zhǔn) 1-36 :待檢尼羅羅非魚(yú)
37-39 :尼羅羅非魚(yú)(早)X奧利亞羅非魚(yú)( )。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中基因組DNA參照文獻(xiàn)提取(薩姆布魯克J，拉塞爾D W著.分子克隆試驗(yàn)指南[Μ]. 3版.黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等，譯.北京科學(xué)出版社，2002 :463-471)。實(shí)施例I
種類(lèi)確定的奧利亞羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)各8尾，尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)6尾，尼羅羅非魚(yú)早X奧利亞羅非魚(yú) 雜交魚(yú)6尾，從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。每尾魚(yú)取30 μ L血細(xì)胞抽提基因組DNA，分別以提取得到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正義引物序列為5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反義引物為AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3;，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μ L，其中含10X反應(yīng)緩沖液2 μ LjMgCl2 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L,上下游引物各 O. 2 μ mol/L，Taq 酶 O. 5U，DNA100 ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為94°C 2min ；94°C 50s，50°C退火50s，72°C 50min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。如圖I所示，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，奧利亞羅非魚(yú)都只有一條187bp的條帶；尼羅羅非魚(yú)都只有一條178bp的條帶；尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)6尾和尼羅羅非魚(yú)早X奧利亞羅非魚(yú) 雜交魚(yú)6尾都有兩條條帶，一條為178bp，另一條為187bp，由電泳圖譜可將奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)以及奧利亞羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)的雜交羅非魚(yú)區(qū)別開(kāi)來(lái)。實(shí)施例2
待檢奧利亞羅非魚(yú)36尾，以尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)3尾作為對(duì)照，從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。剪取每尾魚(yú)尾鰭并抽提基因組DNA，采用如實(shí)施例I所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. O %的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，36尾尼奧利亞羅非魚(yú)都只一條187bp的條帶，3尾尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)有兩條條帶，一條為178bp,另一條為187bp。根據(jù)電泳結(jié)果可判定所檢測(cè)的36尾魚(yú)均為奧利亞羅非魚(yú)。實(shí)施例3
待檢尼羅羅非魚(yú)36尾，以尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)3尾作為對(duì)照，從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場(chǎng)采得。剪取每尾魚(yú)尾鰭并抽提基因組DNA，采用如實(shí)施例I所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，36尾尼羅羅非魚(yú)中34尾魚(yú)有一條178bp的條帶，2尾魚(yú)有兩條條帶，一條為178bp，另一條為 187bp，與尼羅羅非魚(yú) X奧利亞羅非魚(yú)早雜交魚(yú)條帶相同。根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果可判定所檢測(cè)的36尾魚(yú)中，34尾為尼羅羅非魚(yú)，2尾為雜交羅非魚(yú)。
權(quán)利要求
1.一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)采集待鑒別的羅非魚(yú)樣品，提取基因組DNA； (2)用步驟(I)獲得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)； (4)根據(jù)步驟(3)的電泳檢測(cè)結(jié)果，鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及奧利亞羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)雜交魚(yú)尼羅羅非魚(yú)電泳檢測(cè)結(jié)果有I條178bp的條帶，奧利亞羅非魚(yú)有I條187bp的條帶，尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)的雜交魚(yú)有2條條帶，分別為178bp和187bp。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增采用的正義引物序列為5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反義引物為5' ^ AAATGAAGAAACGCCCTCTT3' ο
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，PCR體系總體積20μ ，其中含 IOX 反應(yīng)緩沖液 2 μ L，Mg2+ 2 mmol/L，dNTP 200 μ mol/L，上下游引物各(λ 2 μ mol/L, Taq酶O. 5U, DNA模板100 ng 200 ng,用滅菌雙蒸懼水補(bǔ)足體積。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)的方法，包括以下步驟(1)采集待鑒別的羅非魚(yú)樣品，提取基因組DNA；(2)用步驟(1)獲得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；(4)根據(jù)PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果，鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及奧利亞羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)雜交魚(yú)尼羅羅非魚(yú)電泳檢測(cè)結(jié)果有1條178bp的條帶，奧利亞羅非魚(yú)有1條187bp的條帶，尼羅羅非魚(yú)和奧利亞羅非魚(yú)的雜交魚(yú)有2條條帶，分別為178bp和187bp。本發(fā)明有助于快速、準(zhǔn)確鑒別奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)及其雜交魚(yú)，在羅非魚(yú)種質(zhì)鑒定、保種和選育中有極大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864241SQ20121038434
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者李建林, 俞菊華, 唐永凱, 李紅霞, 徐跑 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心