專利名稱：一種從液體樣本中快速提取總rna的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從液體樣本中快速提取總RNA的試劑及方法。
背景技術(shù)：
近年來，在基因研究的相關(guān)技術(shù)中，作為生物體內(nèi)重要遺傳物質(zhì)，RNA已越來越多的成為被研究的對象?？俁NA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在進行實時熒光定量PCR、cDNA文庫的構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗時均需要高質(zhì)量RNA，因此RNA的提取是分子生物學(xué)研究的一個關(guān)鍵步驟。有關(guān)動植物組織中RNA提取方法的報道已經(jīng)很多，常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、異硫氰酸胍法、CTAB-LiCL法及國內(nèi)外各生物公司的總RNA提取試劑盒等。目前 普遍使用的是根據(jù)RNA在酸性酚溶液中的溶解度不同，組織或細(xì)胞用變性液處理后，在用酸性酚和氯仿抽提的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，該方法的優(yōu)點是具有強烈的蛋白變性劑，它能強烈抑制材料及提取液中的Rnase的活性。早在1987年Chomaczynski等就建立了異硫氫酸胍/苯酚/氯仿一步法提取總RNA，該方法得到了廣泛應(yīng)用，數(shù)家公司據(jù)此開發(fā)出RNA提取試劑盒。然而液體樣本中總RNA提取一直是一個比較困難的問題，因為液體樣本本身大多都是水，RNA含量少，所以提取RNA相對較為困難?，F(xiàn)在大部分血液總RNA的提取方法都需要分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞，然后裂解紅細(xì)胞，倒掉上清液，再從白細(xì)胞中提取總RNA，最后還要用DNase酶進行基因組DNA的消化，整個操作時間甚至需要幾個小時才能完成，即使有RNA提取出來，大都也都降解了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種使用方便高效、重復(fù)性好的快速提取液體樣本總RNA的試劑和方法，所述液體樣本包括來源于人、動物、植物、酵母、細(xì)菌、病毒培養(yǎng)液等任何液體形式的樣品。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明所述的從液體樣本中快速提取總RNA的試劑，其組分按重量份計包括異硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸鈉10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸銨5 20份，十二烷基肌氨酸鈉O. I 10份。本發(fā)明提供的一種用上述試劑從液體樣本中快速提取總RNA的方法，其特征在于包括如下步驟步驟[I]按照3 I的體積比加入所述試劑和液體樣本后震蕩混勻，室溫下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解；步驟[2]按照每O. 75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 2mL氯仿，然后劇烈震蕩并在室溫下孵育5分鐘幫助有機相和水相分層；步驟[3]4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[2]后所得的混合液15分鐘，然后取含有RNA的上層水相；步驟[4]在經(jīng)所述步驟[3]后所得的含有RNA的水相中加入異丙醇，加入的量按照每O. 75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 5mL計算，然后室溫孵育10分鐘使RNA沉淀；步驟[5]4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[4]后所得的混合液10分鐘，然后棄上清；步驟[6]用75%乙醇漂洗經(jīng)所述步驟[5]后所得的RNA沉淀；步驟[7]真空干燥經(jīng)所述步驟[6]后得到的RNA5分鐘,然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。
本發(fā)明的積極效果在于本發(fā)明所述試劑中含有強烈的蛋白變性劑，能迅速變性蛋白，使RNase變性，不能對RNA降解。使用本發(fā)明所述的方法能夠更加快速方便的提取液體樣本中的總RNA，且重復(fù)性好，省去了在處理樣品前離心去除液體的步驟，對于血液樣本，用上述試劑和方法無需分離紅細(xì)胞，直接對血液進行裂解，既簡化步驟，又避免白細(xì)胞的損失，總RNA產(chǎn)品得率高，穩(wěn)定性好，且其裂解后得到的混合液還可以用來運輸所提取RNA，以避免在運輸過程中RNA的降解。


圖I為按照下述實施例I提取人的全血總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道I與2 :全血樣本在_80°C保存一個月后的提取結(jié)果；泳道M :標(biāo)準(zhǔn)的Hela細(xì)胞RNA。圖2為利用實驗室常用方法和下述實施例2中的方法提取雞胚成纖維細(xì)胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道I :利用實驗室常用方法提取的RNA ;泳道2 :利用實施例2所述方法提取的RNA ;泳道M =Marker0圖3為按照下述實施例3所述方法提取的HIV-IRNA進行RT-PCR實驗的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種從液體樣本中快速提取總RNA的試劑及方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們應(yīng)當(dāng)都被視為包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的試劑及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的試劑和方法進行改動或者適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明所述的從液體樣本中提取總RNA的試劑，其組分按重量份計包括異硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸鈉10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸銨5 20份，十二烷基肌氨酸鈉O. I 10份。其中作為優(yōu)選，按重量份數(shù)計，異硫氰酸胍30份，醋酸12份，醋酸鈉20份，苯酚30份，硫氰酸銨12份，十二烷基肌氨酸鈉5份，充分溶解后常溫保存。本發(fā)明所述的液體樣本包括來源于人、動物、植物、酵母、細(xì)菌、病毒培養(yǎng)液等任何液體形式的樣品。
本發(fā)明所述的從液體樣本中快速提取總RNA的方法，包括如下步驟步驟[I]按照3 I的體積比加入所述試劑和液體樣本后震蕩混勻，室溫下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解；步驟[2]按照每O. 75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 2mL氯仿，然后劇烈震蕩并在室溫下孵育5分鐘幫助有機相和水相分層；步驟[3] 4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[2]后所得的混合液15分鐘，然后取含有RNA的上層水相；步驟[4]在經(jīng)所述步驟[3]后所得的含有RNA的水相中加入異丙醇，加入的量按照每O. 75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 5mL計算，然后室溫孵育10分鐘使RNA沉淀；步驟[5] 4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[4]后所得的混合液10分鐘，然后棄上 清；步驟[6]用75%乙醇漂洗經(jīng)所述步驟[5]后所得的RNA沉淀；步驟[7]真空干燥經(jīng)所述步驟[6]后得到的RNA5分鐘,然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。為進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提取RNA的方法進行詳細(xì)說明。實施例I :本發(fā)明所述從液體樣本中快速提取總RNA的試劑按重量份數(shù)計，取異硫氰酸胍30份，醋酸12份，醋酸鈉20份，苯酚30份，硫氰酸銨12份，十二烷基肌氨酸鈉5份，充分溶解后常溫保存。利用上述配方配置的試劑按照本發(fā)明中所述快速提取總RNA的方法提取人全血RNA。實施例2 :本發(fā)明所述從液體樣本中快速提取總RNA的試劑按重量份數(shù)計，取異硫氰酸胍10份，醋酸5份，醋酸鈉10份，苯酚10份，硫氰酸銨5份，十二烷基肌氨酸鈉O. I份，充分溶解后常溫保存。利用上述配方配置的試劑按照本發(fā)明中所述快速提取總RNA的方法提取人全血RNA。實施例3 :本發(fā)明所述從液體樣本中快速提取總RNA的試劑按重量份數(shù)計，取異硫氰酸胍50份，醋酸20份，醋酸鈉30份，苯酚50份，硫氰酸銨20份，十二烷基肌氨酸鈉10份，充分溶解后常溫保存。利用上述配方配置的試劑按照本發(fā)明中所述快速提取總RNA的方法提取人全血RNA。按照上述實施例I、實施例2及實施例3所述的試劑處理相同的人全血樣本，進行比較。檢測值如下表
吸光度A260/A280 得率
實施例I O18ug/mL
權(quán)利要求
1.一種從液體樣本中快速提取總RNA的試劑，其特征在于其組分按重量份數(shù)計包括異硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸鈉10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸銨5 20份，十二烷基肌氨酸鈉O. I 10份。
2.按照權(quán)利要求I所述的一種從液體樣本中快速提取總RNA的試劑，其特征在于所述液體樣本包括來源于人、動物、植物、酵母、細(xì)菌、病毒培養(yǎng)液的液體形式的樣品。
3.一種用權(quán)利要求I所述的試劑從液體樣本中快速提取總RNA的方法，其特征在于包括如下步驟 步驟[I]按照3 I的體積比加入所述試劑和液體樣本后震蕩混勻，室溫下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解； 步驟[2]按照每O. 75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 2mL氯仿，然后劇烈震蕩并在室溫下孵育5分鐘幫助有機相和水相分層； 步驟[3]4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[2]后所得的混合液15分鐘，然后取含有RNA的上層水相； 步驟[4]在經(jīng)所述步驟[3]后所得的含有RNA的水相中加入異丙醇，加入的量按照每O.75 ImL步驟[I]中加入的本發(fā)明所述試劑加入O. 5mL計算，然后室溫孵育10分鐘使RNA沉淀； 步驟[5]4°C 12000rpm下離心經(jīng)所述步驟[4]后所得的混合液10分鐘，然后棄上清； 步驟[6]用75%乙醇漂洗經(jīng)所述步驟[5]后所得的RNA沉淀； 步驟[7]真空干燥經(jīng)所述步驟[6]后得到的RNA5分鐘，然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種方便、高效、重復(fù)性好的提取液體樣本總RNA的試劑和方法，包括從來源于人、動物、植物等任何液體形式的樣品中提取總RNA。本發(fā)明提供的一種提取液體樣本總RNA的試劑，其組分按重量份數(shù)計異硫氰酸胍10～50份，醋酸5～20份，醋酸鈉10～30份，苯酚10～50份，硫氰酸銨5～20份，十二烷基肌氨酸鈉0.1～10份。本發(fā)明提供的液體樣本總RNA提取方法，不需要在處理樣本前離心去除液體的步驟，對于全血樣本來說，不需要分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞，不需要進行另外的紅細(xì)胞裂解步驟。整個過程操作簡單，方便快捷。采用本發(fā)明獲得的總RNA產(chǎn)品得率高，穩(wěn)定性好，可以滿足下游分子生物學(xué)實驗。
文檔編號C12N15/10GK102876663SQ20121038043
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者周志圖 申請人:北京百泰克生物技術(shù)有限公司