玉米芯生物催化米根霉液體發(fā)酵玉米淀粉高效制備葡萄糖的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物催化米根霉液體發(fā)酵玉米淀粉高效制備葡萄糖的方法，該方法通過在米根霉(Rhizopus?oryzae)液體發(fā)酵體系中添加由玉米芯制備的生物催化劑實現(xiàn)葡萄糖產(chǎn)量提高1-1.6倍，生成時間縮短2-4倍(以不加玉米芯生物催化劑為對照)。本發(fā)明包括以下內(nèi)容：玉米芯生物催化劑的制備，采用米根霉液體發(fā)酵體系實現(xiàn)玉米淀粉高效制備葡萄糖。
【專利說明】玉米芯生物催化米根霉液體發(fā)酵玉米淀粉高效制備葡萄糖
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通過添加玉米芯生物催化劑在米根霉液體發(fā)酵體系中實現(xiàn)由玉米淀粉高效制備葡萄糖的方法，屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
二、【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖是淀粉最重要的下游產(chǎn)品之一，同時也是玉米的重要深加工產(chǎn)品。在美國，以玉米為原料生產(chǎn)的淀粉糖已全面代替蔗糖，廣泛進(jìn)入了工業(yè)加工及家庭食用等各個領(lǐng)域。我國的玉米資源非常豐富，在1999年已達(dá)1.2億噸，居世界第二。玉米便于運(yùn)輸和貯藏，可周年生產(chǎn)，淀粉含量高，葡萄糖產(chǎn)量高，已逐漸成了我國制造淀粉的主要原料。玉米淀粉的產(chǎn)量接近我國淀粉總產(chǎn)量的90%，已成為制造葡萄糖的理想原料。因此，深入研究玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的機(jī)理，以期提高葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，同時縮短生產(chǎn)周期，對于促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，具有重要意義。
[0003]現(xiàn)代淀粉加工工業(yè)中葡萄糖的生產(chǎn)工藝為將淀粉經(jīng)高溫連續(xù)蒸煮糖化后，加入淀粉酶和糖化酶使淀粉液化糖化生成葡萄糖，此過程存在能耗大，淀粉酶和糖化酶需要外源制備以及酶制劑利用效率低等問題。本發(fā)明模擬霉菌的降解淀粉的自然過程，采用能夠合成和分泌各種淀粉降解酶類的米根霉為發(fā)酵菌種，玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過程中所需淀粉降解酶的種類、數(shù)量和活性完全由米根霉自身的代謝調(diào)控系統(tǒng)控制所以能夠?qū)崿F(xiàn)不需添加外源酶制劑和發(fā)酵過程經(jīng)濟(jì)高效低能耗。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種通過添加玉米芯生物催化劑在米根霉液體發(fā)酵體系中實現(xiàn)玉米淀粉高效制備葡萄糖的方法，該方法能夠使葡萄糖產(chǎn)量提高1-1.6倍，葡萄糖生成時間縮短2-4倍。`
[0005]本發(fā)明包括下列步驟:
[0006]1、玉米芯生物催化劑的制備:
[0007]將玉米芯粉碎為40目后，按照1: 40的比例加蒸餾水，煮沸20-30分鐘，4層紗布過濾。過濾液冷卻后，定容為原體積。在4°C下，8000-14400KD的透析袋中透析，透析液為中性緩沖液，每隔4-6小時換一次透析液，24小時后，取出透析袋中液體，濃縮至原體積。此液體即為玉米芯催化劑。
[0008]2、米根霉液體發(fā)酵體系實現(xiàn)玉米淀粉高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖
[0009]米根霉液體發(fā)酵體系由以下部分組成:
[0010]發(fā)酵菌種為米根霉(Rhizopus oryzae),其形態(tài)和rDNA ITS序列見附圖1,2和核苷酸序列表。圖1為米根霉在PDA培養(yǎng)基上生長的圖片，菌落大小:遍布整個培養(yǎng)皿；菌絲顏色:白；匍匐菌絲:致密，平整；菌落質(zhì)地:呈蛛絲網(wǎng)狀；氣生菌絲:接觸到平皿蓋，豐盈，呈頂端分支；孢子:生長在頂端分支頂上；孢子囊顏色:菌絲接種到平板上后第二天長出孢子囊為白色，三天后為黑色。圖2為米根霉菌絲、孢子囊、孢囊梗和孢囊孢子的顯微鏡圖片(xlO)，菌絲:發(fā)達(dá)，無橫隔有分支，顯微鏡下顯示灰白色；孢子囊:球型，直徑80-175 μ m;孢囊梗:直立或稍彎曲長500-1000 μ m,褐色，壁粗糙，直徑5-15 μ m,幼期短，成熟后長。囊軸:呈半球型或卵圓型，淡褐色，壁光滑，直徑35-96 μ m ;孢囊孢子:球型，卵形或橢圓形大小不一，直徑1.8-7.2 μ m ;褐色或淡褐色，有線紋；假根:根狀或手指狀分支，部分與孢囊梗對生，褐色；匍匐菌絲:呈爬行擴(kuò)散形生長，呈灰褐色。核苷酸序列表為米根霉rDNA ITS序列。
[0011]發(fā)酵方式為液體搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米淀粉與玉米芯催化劑的比例為I: 50。發(fā)酵條件:接種量為I %米根霉液體孢子液，孢子數(shù)約為IO6個/毫升。溫度為250C，轉(zhuǎn)速為 120-180r/min，培養(yǎng) 5-7 天。
[0012]有益效果
[0013]1、由于玉米淀粉顆粒大，結(jié)構(gòu)致密而且支鏈淀粉含量高，所以較其它淀粉難于液化糖化，本發(fā)明通過加入玉米芯生物催化劑能夠大幅提高玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效率(葡萄糖產(chǎn)量提高1-1.6倍，生成時間縮短2~4倍)，具有廣闊的應(yīng)用前景。[0014]2、現(xiàn)代淀粉加工工業(yè)中葡萄糖的生產(chǎn)工藝為將淀粉經(jīng)高溫連續(xù)蒸煮糖化后，加入淀粉酶和糖化酶使淀粉液化糖化生成葡萄糖，而淀粉酶和糖化酶需由霉菌另行制備。本發(fā)明直接利用霉菌液體發(fā)酵制備葡萄糖，玉米淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過程中所需淀粉降解酶的種類、數(shù)量和活性完全由霉菌自身的代謝調(diào)控系統(tǒng)控制所以不需添加外源酶制劑，能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵全程經(jīng)濟(jì)高效，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
[0015]3、本發(fā)明采用玉米芯制備生物催化劑，其來源廣泛，價格低廉能夠大幅降低生產(chǎn)成本。
四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1米根霉在PDA培養(yǎng)基上生長的圖片
[0017]圖2米根霉菌絲、孢子囊、孢囊梗和孢囊孢子的顯微鏡圖片(XlO)
[0018]圖3處理組和對照組在發(fā)酵20天中葡萄糖的生成量核苷酸序列表米根霉rDNA-1TS 序列
五、【具體實施方式】
[0019]下面的實施例可以更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0020]實施例
[0021]1、實驗儀器與試劑
[0022]I)實驗儀器
[0023]HYG-A全溫?fù)u瓶柜，太倉實驗設(shè)備廠
[0024]LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海益恒實驗設(shè)備有限公司
[0025]Sff-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司
[0026]U-1800 分光光度計，HITACHI
[0027]電熱手提式壓力蒸汽消毒器，上海醫(yī)用核子儀器廠
[0028]生物顯微鏡，尼康H600L
[0029]2)實驗試劑
[0030]玉米淀粉(≥99%，聯(lián)合利華有限公司)[0031]葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)
[0032]2、實驗設(shè)計
[0033]在本實施例中，設(shè)兩個實驗組，分別為處理組和對照組，每組3個平行。處理組為加玉米芯生物催化劑的米根霉液體搖瓶發(fā)酵體系，對照組為不加玉米芯生物催化劑的米根霉液體搖瓶發(fā)酵體系，處理組和對照組含有相同量的玉米淀粉，在發(fā)酵第1，5，10和20天，每天取樣測定兩組發(fā)酵液中的葡萄糖含量。
[0034]3、實驗方法
[0035]I)馬鈴薯葡萄糖(PDA)斜面培養(yǎng)基:
[0036]馬鈴薯塊200_300g、葡萄糖20g、酵母膏5g、瓊脂20g、水1000ml。馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，將馬鈴薯塊放入水中，煮沸15分鐘，用紗布過濾，榨出所有液體，補(bǔ)足1000ml水量，加入葡萄糖，酵母膏，瓊脂，加熱至瓊脂完全溶解后，分裝于試管中，121°C，20分鐘高壓滅菌后，取出試管，傾斜放置，使試管內(nèi)培養(yǎng)基呈斜面，靜置至凝固。
[0037]2)米根霉孢子液制備:
[0038]取4°C保藏于PDA斜面培養(yǎng)基的米根霉菌種，在無菌超凈臺中，用接種環(huán)勾取菌絲，在(PDA)斜面培養(yǎng)基上劃蛇形，25°C，培養(yǎng)3-4天，直到可見長滿黑點(diǎn)點(diǎn)霉菌孢子囊。取I個試管斜面(長滿黑點(diǎn)點(diǎn)霉菌孢子囊)加5毫升無菌水，用接種環(huán)刮洗到無菌小三角瓶(加玻璃珠)中，震蕩后鏡檢計數(shù)，用無菌水稀釋至孢子數(shù)約為106個/毫升。
[0039]3)玉米芯生物催化劑的制備
[0040]取新鮮玉米芯粉·碎為40目，稱取30g，加1.2L蒸餾水，煮沸20_30分鐘，4層紗布過濾。過濾液冷卻后，定容為1.2L，裝入經(jīng)50%乙醇煮沸I小時并沖洗過的8000-14400KD的透析袋，封口。將透析袋浸入12L的透析液中，透析液為中性緩沖液。在4°C下，每隔4小時換一次透析液，24小時后，取出透析袋中液體，濃縮至1.2L，此液體即為玉米芯催化劑。
[0041]4)米根霉液體發(fā)酵玉米淀粉制備葡萄糖
[0042]處理組:稱取24g玉米淀粉，加入1.2L玉米芯生物催化劑，電爐上糊化后，分裝于12個250mL搖瓶中，硅膠塞封口，外面包一層牛皮紙，在高壓滅菌鍋中，121 °C，滅菌20分鐘，冷卻后，無菌超凈臺中，每個搖瓶接入ImL米根霉液體孢子液。置25°C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)20天。在第1，5，10和20天，取3個搖瓶，將搖瓶中發(fā)酵液過濾后，測定
葡萄糖含量。
[0043]對照組:稱取24g玉米淀粉，加入1.2L蒸餾水，電爐上糊化后，分裝于12個250mL搖瓶中，硅膠塞封口，外面包一層牛皮紙，在高壓滅菌鍋中，121°C，滅菌20分鐘，冷卻后，無菌超凈臺中，每個搖瓶接入ImL米根霉液體孢子液。置25°C恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min,培養(yǎng)20天。在第1，5，10和20天，取3個搖瓶，將搖瓶中發(fā)酵液過濾后，測定葡萄糖含量。
[0044]5)發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定
[0045]采用葡萄糖氧化酶-過氧化物法，將發(fā)酵液過濾后，取30 μ 1，與3mL工作液(含有等量的Rl和R2試劑)混勻，此管為樣本管；同時取30 μ I校準(zhǔn)液，與3mL工作液(含有等量的Rl和R2試劑)混勻，此管為校準(zhǔn)管，將樣本管和校準(zhǔn)管同時37°C加熱15min，0D505nm測定吸光值。葡萄糖含量(mmol/L)=樣本管吸光度㈧X校準(zhǔn)液濃度(5.5mmol/L)/校準(zhǔn)管吸光度。[0046]4、實驗結(jié)果
[0047]如圖3，在含有相同玉米淀粉的米根霉液體發(fā)酵體系中，處理組發(fā)酵液中葡萄糖含量在第5天時已達(dá)到最大值為92.3mmol/L,而對照組直到第20天才達(dá)到最大值為58.lmmol/L.由此可知，處理組的葡萄糖生成量比對照組提高了 1.59倍，轉(zhuǎn)化時間縮短了4倍。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明的特征為在米根霉液體發(fā)酵體系中添加玉米芯生物催化劑實現(xiàn)玉米淀粉高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖。
2.權(quán)利要求1所述的玉米芯生物催化劑的制備步驟為: 將玉米芯粉碎為40目后，按照1: 40的比例加蒸餾水，煮沸20-30分鐘，4層紗布過濾。過濾液冷卻后，定容為原體積。在4°C下，8000-14400KD的透析袋中透析，透析液為中性緩沖液，每隔4-6小時換一次透析液，24小時后，取出透析袋中液體，濃縮至原體積。此液體即為玉米芯催化劑。
3.權(quán)利要求1所述的玉米淀粉高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過程是由米根霉液體發(fā)酵體系實現(xiàn)的。 米根霉液體發(fā)酵體系由以下部分組成:發(fā)酵微生物為米根霉(Rhizopus oryzae)其形態(tài)和rDNA ITS序列見附圖1、2和核苷酸序列表。發(fā)酵方式為液體搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米淀粉與玉米芯催化劑的比例為1: 50。發(fā)酵條件:接種量為I %米根霉液體孢子液，孢子數(shù)約為1O6個/毫升。溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為120-180r/min，培養(yǎng)5-7天。
【文檔編號】C12P19/02GK103710407SQ201210369734
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月29日
【發(fā)明者】崔莉, 李大婧, 郁萌, 劉春泉, 高小女 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院