專利名稱：一種大蔥細胞質(zhì)雄性不育檢測的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域，尤其涉及一種大蔥細胞質(zhì)雄性不育檢測的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大蔥(Alliumfistulosum L. var. giganteum Makino),植物學(xué)分類屬于百合科(Liliaceae)、蔥屬(Allium)、蔥種(f istulosum)中的一個變種(var. giganteum Makino)。以葉鞘抱合而成的肥大假莖(蔥白)為主要產(chǎn)品，因在蔥中植株高大而得名。大蔥在蔥蒜類蔬菜中占有非常重要的位置，是中國人日常生活中不可缺少的重要蔬菜作物之一。在中國普遍栽培，全國常年栽培大蔥約計50多萬hm2，年產(chǎn)大蔥1760多萬 t。大蔥主要分布在中國的秦嶺-淮河以北地區(qū)。其中，山東、河南、河北、遼寧等省份栽培較為集中，單產(chǎn)水平也較高。大蔥營養(yǎng)成分豐富，據(jù)測定每百克大蔥含蛋白質(zhì)I 2. 4g，脂肪O. 3g，碳水化合物
6 8. 6g,熱量32千卡，粗纖維O. 5g, I丐12mg,磷46mg,鐵O. 6mg,胡蘿卜素I. 2mg,硫胺素O. 08mg,核黃素O. 05mg,尼克酸O. 5mg,抗壞血酸14mg,所含胡蘿卜素高于瓜菜類和豆菜類蔬菜。另外，大蔥還含有揮發(fā)性的硫化丙烯等芳香物質(zhì)，既可作為蔬菜和調(diào)味品，也具有良好的藥用效果。大蔥的管狀葉和假莖(蔥白)均可食用，生食或熟食皆宜。大蔥是非常重要的香辛類蔬菜，其味辛，性溫，食用可開胃消食、殺菌防病等。據(jù)明代李時珍《本草綱目》記載，蔥之莖白、根須、葉、汁、花均可入藥，對大蔥不同部位的性質(zhì)和治病作用已進行了詳細闡述，記有54個藥方，可治10余種疾病。主治傷寒寒熱，除肝邪氣，治霍亂轉(zhuǎn)筋，利大小便，解耳鳴?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為大蔥具有刺激血液循環(huán)等功效。對痢疾桿菌、葡萄球菌等有殺滅作用。因為大蔥生長周期較長，開花期較短，單果結(jié)籽數(shù)較少，自交衰退較明顯等特點，所以開展大蔥育種難度較大，從而限制了大蔥育種研究工作的開展，國內(nèi)外從事大蔥育種研究的人員較少，因此，大蔥育種研究相對滯后。長期以來，我國大蔥育種一直以選種為主，各地栽培的大蔥名產(chǎn)品種和推廣的新品種，主要是采用選種方法育成。自上世紀(jì)70年代日本和我國才陸續(xù)開展了大蔥雄性不育系及其利用研究，開始了大蔥一代雜種選育，但是，一代雜種選育進展緩慢，至今在生產(chǎn)上沒有得到較大面積推廣。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所、章丘市農(nóng)業(yè)局、遼寧省農(nóng)科院園藝系等單位，利用自然群體中的不育株，通過4-5代回交，先后育成大蔥雄性不育系和相應(yīng)保持系。陳立東、王景峰等育成了超早熟大蔥雄性不育系603A、626A ;張啟沛、魏佑營等育成了大蔥不育系4A、5A、225A、237A ;佟成富、唐成英等育成了大蔥不育系244A[佟成富，唐成英，崔連偉.大蔥雄性不育系244A及其雜交種遼蔥二號(9746F1)的選育及利用.全國蔬菜遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集，2002. 301-307];陳運起、高莉敏等育成了大蔥雄性不育系9801A、9802A 等。
為加快大蔥雄性不育系選育進程，蓋樹鵬、孟祥棟等(2004)利用RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記初步建立了大蔥不育系、保持系分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)體系[蓋樹鵬，孟祥棟等.大蔥雄性不育分子標(biāo)記輔助選擇的研究.分子植物育種，2004，2 (2) :223-228]?？梢詼p少工作量，縮短部分大蔥品種的育種年限，但是不能在廣泛的育種材料中實現(xiàn)苗期選擇。加強生物技術(shù)與常規(guī)育種的結(jié)合生物技術(shù)的發(fā)展給園藝植物遺傳育種帶來了巨大的變化，分子標(biāo)記技術(shù)已成為育種研究的重要組成部分。但是，要使分子標(biāo)記成為育種的一種常規(guī)手段，尚有許多問題有待解決。如重要性狀基因的精細定位，檢測過程的自動化，飽和遺傳圖譜的構(gòu)建等。生物技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合，將有力的推動大蔥遺傳育種學(xué)的發(fā)展。加快雄性不育系與一代雜種選育優(yōu)良雄性不育系選育是選育一代雜種、利用雜種優(yōu)勢的重要前提，從大蔥制種田發(fā)現(xiàn)不育株后，通過回交或體細胞雜交、細胞器轉(zhuǎn)移、細胞質(zhì)基因工程等技術(shù)轉(zhuǎn)育成更多的優(yōu)良雄性不育系，進而培育出優(yōu)勢明顯的一代雜種。隨著 大蔥育種研究的不斷深入，大蔥一代雜種選育與利用將進一步加快，大蔥一代雜種的推廣覆蓋率將迅速提高。日本的馬上武彥等(1985)，用大蔥雄性不育材料連續(xù)三次回交與7個品種雜交，觀察植株花粉和種子的育性，判定大蔥雄性不育的遺傳模式，研究結(jié)果認為大蔥雄性不育是受胞質(zhì)與核基因互作控制，雄性不育與保持系分別由兩對基因S(mSlmSlmS2mS2)和N(mslmslms2ms2)支配,雄性不育性可用于大蔥雜交育種。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展為植物遺傳標(biāo)記提供了一種基于DNA變異的新技術(shù)手段，即分子標(biāo)記技術(shù)。DNA分子標(biāo)記研究與應(yīng)用的迅速發(fā)展為植物遺傳育種注入新的活力，并使傳統(tǒng)育種技術(shù)發(fā)生了深刻的變化。DNA分子標(biāo)記的研究始于1980年，現(xiàn)已有數(shù)十種標(biāo)記技術(shù)。與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記有很多優(yōu)點。以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋技術(shù)大大加快了 DNA分子標(biāo)記的研究和利用，廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位和克隆、植物親緣關(guān)系鑒別及遺傳多樣性研究、分子標(biāo)記輔助選擇育種等領(lǐng)域。植物育種中分子標(biāo)記輔助選擇是通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷目標(biāo)基因是否存在的。通過不同分子標(biāo)記技術(shù)的分析可篩選出與目標(biāo)基因性狀緊密連鎖的DNA片段，這樣可以作為輔助育種的分子標(biāo)記。應(yīng)用這些分子標(biāo)記進行間接選擇，將得到事半功倍的作用，因為分子標(biāo)記輔助選擇不受植物生長發(fā)育的時期及環(huán)境的影響，不存在表達與否的問題。無論是與細胞質(zhì)位點還是與核基因連鎖的標(biāo)記的輔助選擇都可減少工作量，提高育種效率。利用與細胞質(zhì)位點連鎖的標(biāo)記可鑒別出單株的細胞質(zhì)類型，淘汰可育材料中S型細胞質(zhì)，只能從N型細胞質(zhì)類型的單株中選擇保持系，從而減少測交組合數(shù)和自交株數(shù)，減少工作量，避免盲目性，提高選擇效果。原有報道的通過提取大蔥線粒體DNA進行PCR擴增，得到2800bp片段的分子標(biāo)記不能在廣泛的大蔥材料中應(yīng)用，應(yīng)用范圍較窄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種大蔥細胞質(zhì)雄性不育檢測的試劑盒及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及一種用于大蔥細胞質(zhì)雄性不育檢測的試劑盒，其特征在于包括如下的SCAR (Sequence-characterized Amplified Region序列特異性擴增區(qū))標(biāo)記引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑。在本發(fā)明的另一個 優(yōu)選實施方式中，所述的試劑盒包括PCR擴增所需要的試劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的試劑盒包括對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。本發(fā)明另一方面還涉及上述試劑盒在大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述應(yīng)用包括用CTAB法提取大蔥總DNA，然后使用所述的SCAR標(biāo)記引物對所提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳以確定擴增產(chǎn)物的片段長度，根據(jù)檢測結(jié)果判斷所檢測的植株是否是細胞質(zhì)不育類型。本發(fā)明的試劑盒可以廣泛應(yīng)用于我國遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細胞質(zhì)的育性鑒定。本發(fā)明通過提取大蔥總DNA即可，避免了提取線粒體DNA的復(fù)雜操作，使操作過程更簡單有效。分子標(biāo)記輔助選擇操作簡單，節(jié)約成本和時間，為大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種體系奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式實施例I合成大蔥細胞質(zhì)雄性不育SCAR標(biāo)記的引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3'；反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。選擇已知基因型的個體材料共220份，對大蔥DNA提取采用北京天根生產(chǎn)的植物基因組CTAB法提取試劑盒(也可以使用其它常規(guī)的CTAB法提取試劑盒進行提取)以及試劑盒中所述方法進行提取；PCR擴增在美國伯樂TC-XP-D型基因擴增儀上進行，20 μ L體系，其中 2x Taq MasterMixlO μ L, Primerl、2 (10umol/L)各 I. O μ L，樣品 DNAl μ L，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性2min，94°C變性30sec，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存；PCR產(chǎn)物在I. 2 %瓊脂糖凝膠進行電泳分離分析，溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)自動成像；特異條帶回收純化，按照Gel Extract ion Kit使用說明；連接、轉(zhuǎn)化、鑒定按照PGM-T克隆試劑盒說明；DNA序列測定委托北京博尚生物技術(shù)有限公司完成。對已知育性的220份材料進行PCR驗證(見表I)，按照本發(fā)明實施例中的方法，所有的不育系中均擴增出大小為607bp的片段，而保持系中沒有擴增產(chǎn)物，PCR結(jié)果與田間判斷相吻合。說明應(yīng)用這對引物完全可以鑒別大蔥細胞質(zhì)雄性不育類型，據(jù)此得知擴增出的607bp片段與雄性不育有一定的聯(lián)系。對以上大蔥細胞質(zhì)雄性不育系980238A、200501A中擴增出的特異片段經(jīng)過回收、轉(zhuǎn)化、克隆和測序，得到的結(jié)果一致，序列全長607bp，核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，兩端含有引物序列，其堿基組成為A+T = 55%,C+G = 45%。表I大蔥不育系和保持系單株驗證結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于大蔥細胞質(zhì)雄性不育檢測的試劑盒，其特征在于包括如下的SCAR標(biāo)記引物 正向引物WMS607L :5' -CATAAGACTTGCCCTGAG-3'； 反向引物WMS607R :5' -TTCGCTATGTTCTATGTGAG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑，所述的試劑優(yōu)選的是北京天根生產(chǎn)的的植物基因組提取試劑盒中的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括PCR擴增所需要的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，所述的試劑盒包括對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。
5.權(quán)利要求1-4任意一項所述的試劑盒在大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括用CTAB法提取大蔥總DNA，然后使用所述的SCAR標(biāo)記引物對所提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳以確定有無擴增產(chǎn)物以及擴增產(chǎn)物的片段長度，根據(jù)檢測結(jié)果判斷所使用的大蔥是否屬于細胞質(zhì)不育系O
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大蔥細胞質(zhì)雄性不育的檢測試劑盒及其大蔥輔助選擇育種中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括SCAR標(biāo)記引物正向引物WMS607L5′CATAAGACTTGCCCTGAG 3′；反向引物WMS607R5′TTCGCTATGTTCTATGTGAG 3′。本發(fā)明的試劑盒可以廣泛應(yīng)用于我國遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細胞質(zhì)的育性鑒定。本發(fā)明通過提取大蔥總DNA即可，避免了提取線粒體DNA的復(fù)雜操作，使操作過程更簡單有效。分子標(biāo)記輔助選擇操作簡單，節(jié)約成本和時間，為大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種體系奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102851379SQ20121034897
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者高莉敏, 陳運起, 董飛, 孔素萍 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所