專利名稱：一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系及其建立方法
技術領域：
本發(fā)明涉及未分化的非人類細胞，具體涉及一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。
背景技術：
參環(huán)毛蝴Pheretima aspergiIIum(E. Perrier)來源于矩蝴科環(huán)毛蝴屬，是《中華人民共和國藥典》2010版“地龍”項下收載的4種原動物之一。因其主產(chǎn)于廣東和廣西兩地，故被稱為“廣地龍”。由于廣地龍療效確切，藥材加工精細講究而被業(yè)內(nèi)公認為品質(zhì)最優(yōu)。中藥地龍在《中華人民共和國藥典》收錄品種還有柿盲環(huán)毛Pheretima pectinifera (Michaelsen)、威廉環(huán)毛蝴Pheretima guillelmi (Michaelsen)以及通俗環(huán)毛蝴PheretimaV μ lgaris (Chen)的干燥體，后三種習稱“滬地龍”。地龍性寒、味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱息風、通經(jīng)絡、平喘、利尿之功。主治高熱驚癇，氣虛兩滯，半身不遂，肺熱哮喘，小便不利及熱痹等癥。近20年來，國內(nèi)外有關地龍的化學成分、藥理作用、臨床應用的研究報道相對較多。大量研究表明，地龍不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，還含有多種藥理活性成分，其藥理作用幾乎涉及人體各個系統(tǒng)，主要有降壓、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增強免疫、抗?jié)?、解熱?zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、平喘、抗菌等作用。由此可見，地龍不論作為藥品還是營養(yǎng)保健品開發(fā)利用，在經(jīng)濟、社會和生態(tài)方面都有巨大的效益潛力。目前地龍藥材大多仍靠野生資源，加上不同環(huán)境條件以及采收加工技術等的影響，造成藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，特別是重金屬超標一直難以控制的問題。近年，在國家科技部“十五”國家重大科技攻關項目“廣地龍規(guī)范化養(yǎng)殖研究”的資助下，我們曾隨機抽取12批在我國市場上銷售的廣地龍藥材進行了重金屬含量調(diào)查，由中國廣州分析測試中心的檢測報告(編號2004093019)表明其中7批次的鎘(Cd2+)含量超過中華人民共和國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部發(fā)布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中規(guī)定的限量，其超過的倍數(shù)從23倍至143倍不等。由此可見，市場上廣地龍重金屬超標問題令人堪憂，已嚴重制約其出口量和臨床用藥安全。為進一步深化參環(huán)毛蚓的重金屬富集機制，制定降低或消除廣地龍重金屬超標的研究，建立參環(huán)毛蚓的細胞系是至關重要的一個環(huán)節(jié)，目前關于蚯蚓細胞培養(yǎng)報道并不多，還存在大量空白，僅涉及到的品種是正蝴科Lumbricidae的陸正蝴Lumbricus terrestis和赤子愛勝蚓Eisenia foetida，且為70年代和90年代的初步嘗試，距今時間較久，研究進展方面見到零星報道?！稄V州中醫(yī)藥大學學報》2011年5月第28卷第3期刊載了題為“參環(huán)毛蚓細胞原代培養(yǎng)滅菌方法的研究” 一文，該文所公開的參環(huán)毛蚓細胞原代培養(yǎng)滅菌方法雖然也是常見的動物細胞培養(yǎng)方法，但是在培養(yǎng)過程及后續(xù)的觀察中發(fā)現(xiàn)其存在細胞傳代時分裂增長慢，且容易出現(xiàn)早期細胞凋亡的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種改進的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，該細胞系不僅長時間保藏成活率高、活力好，而且在傳代培養(yǎng)時仍然表現(xiàn)出快速分裂增長的活性。
本發(fā)明解決上述問題的技術解決方案是一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，其特征在于，其保藏號為CCTCC一C201294。上述參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的建立方法由以下步驟組成(I)將收集野外采集的參環(huán)毛蚓置于實驗室泥土(溫度28°C、PH=4. 5、土壤含水量21. 5%)中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周后，置于墊有用蒸餾水濕潤的濾紙的燒杯中，保持適宜的溫度28 0C，濕度60%，每天換濾紙I次，吐泥3 4天；(2)取吐泥3 4天后的參環(huán)毛蚓于超凈臺上，用75%酒精體表消毒后解剖，將獲得的腸道部位用LBSS緩沖液沖洗，再用抗生素組合液滅菌2 3min ;棄抗生素組合液得到的腸道部分先加入體積為腸道體積的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后棄去酶解液，再加入體積為腸道體積的10倍的Collagenase Type I酶解液酶解20分鐘,過100目的細胞篩除去較大的組織碎片，然后以1000r/min離心5min,棄上清,收集細胞；其中，·所述的抗生素組合液是將青霉素鈉、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素組合液中，青霉素鈉的濃度為200U/ml，硫酸鏈霉素的濃度為400 μ g/ml，硫酸慶大霉素的濃度為300U/ml，兩性霉素B的濃度為5 μ g/ml ；所述的Thermolysin酶解液是將Thermolysin粉末加入到濃度為IOm mol/ml的HEPES溶液中過濾滅菌混合制成,所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的濃度為25 μ g/mL ；所述的Collagenase Type I 酶解液是將 Collagenase Type I 粉末加入到 HBSS(Ix)溶液中過濾滅菌而成，所制的Collagenase Type I酶解液中Collagenase Type I的濃度為O. 2mg/mL ；(3)往收集的細胞中加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為lxl05/ml接種于透氣培養(yǎng)瓶中，置于28°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時，觀察細胞生長情況，當細胞貼壁面積達到80%時，吸去細胞培養(yǎng)液，用LBSS沖洗I 2遍；如果培養(yǎng)到第五天細胞貼壁面積還達到80%，便進行半量更換液培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；其中所述的培養(yǎng)液由91. 55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin試劑、O. 75%的濃度為40000U/ml的硫酸慶大霉素、O. 2%的青霉素鈉試齊[J、0. 4%的硫酸鏈霉素試劑、O. 1%的兩性霉素B試劑組成，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200 μ g/ml ；所述的青霉素鈉試劑是將青霉素鈉溶解到LBSS中制成，其中青霉素鈉在試劑的濃度為 100000U/ml ；所述的硫酸鏈霉素試劑是將硫酸鏈霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸鏈霉素在試劑中的濃度為800000 μ g/ml ；所述的兩性霉素B試劑是將兩性霉素B溶解到DMSO中制成，其中兩性霉素B在試劑中的濃度為5000 μ g/ml ；(4)然后，刮下上皮樣細胞克隆區(qū)域以外的細胞群，再往培養(yǎng)瓶加入傳代培養(yǎng)液淹沒貼壁面的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到上皮樣細胞克隆區(qū)域達到85%以上，即得到所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系；其中所述的傳代培養(yǎng)液是由體積百分比為91. 5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的濃度為2000ng/ml EGF溶液；1%的濃度為200 μ g/ml insulin試劑；I. 45%青霉素-鏈霉素溶液(lx)，其中， 所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200 μ g/ml。由于本發(fā)明所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的構建方法在現(xiàn)有技術的基礎上作了較大的改進，尤其是抗生素組合液、酶解液和培養(yǎng)液進行大幅度的改良，使得所建立的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系不僅其中成活的細胞數(shù)顯著提高，而且細胞的生命力強、傳代培養(yǎng)分裂 增長速度快。


圖I為樣品和對照品OD值直方圖。圖2為樣品和對照品的冷凍復蘇后的OD值直方圖。圖3為對照品的原代至第五代細胞的生長曲線圖。圖4為樣品的原代至第七代細胞的生長曲線圖。
具體實施例方式例I (建立的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系)I、試劑(I)抗生素組合液該組合液是將青霉素鈉、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素組合液中，青霉素鈉的濃度為200U/ml，硫酸鏈霉素的濃度為400 μ g/ml，硫酸慶大霉素的濃度為300U/ml，兩性霉素B的濃度為5 μ g/ml。(2)Thermolysin酶解液該酶解液是將Thermolysin粉末加入到濃度為IOm mol/ml的HEPES溶液中過濾滅菌混合制成,所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的濃度為 25 μ g/mLo(3)Collagenase Type I酶解液該酶解液是將Collagenase Type I粉末加入到HBSS (Ix)溶液中過濾滅菌而成，所制的Collagenase Type I酶解液中Collagenase TypeI的濃度為O. 2mg/mL。(4)培養(yǎng)液該培養(yǎng)液由91. 55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin試劑、O. 75%的濃度為40000U/ml的硫酸慶大霉素、O. 2%的青霉素鈉試劑、O. 4%的硫酸鏈霉素試劑、O. 1%的兩性霉素B試劑組成，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200 μ g/ml ；所述的青霉素鈉試劑是將青霉素鈉溶解到LBSS中制成，其中青霉素鈉在試劑的濃度為 100000U/ml ；所述的硫酸鏈霉素試劑是將硫酸鏈霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸鏈霉素在試劑中的濃度為800000 μ g/ml ；所述的兩性霉素B試劑是將兩性霉素B溶解到DMSO中制成，其中兩性霉素B在試劑中的濃度為5000 μ g/ml。(5)傳代培養(yǎng)液該傳代培養(yǎng)液是由體積百分比為91. 5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的濃度為2000ng/ml EGF溶液；1%的濃度為200 μ g/ml insulin試劑；I. 45%青霉素-鏈霉素溶液(lx)，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ；所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中insulin的濃度為200 μ g/ml。
2、建立方法(I)將收集野外采集的參環(huán)毛蚓置于實驗室泥土(溫度28°C、PH=4. 5、土壤含水量21. 5%)中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周后，置于墊有用蒸餾水濕潤的濾紙的燒杯中，保持適宜的溫度28 0C，濕度60%，每天換濾紙I次，吐泥3 4天；(2)取吐泥3 4天后的參環(huán)毛蚓于超凈臺上，用75%酒精體表消毒后解剖，將獲得的腸道部位用LBSS緩沖液沖洗，再用抗生素組合液滅菌2 3min ;棄抗生素組合液得到的腸道部分先加入體積為腸道體積的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后棄去酶解液，再加入體積為腸道體積的10倍的Collagenase Type I酶解液酶解20分鐘,過100目的細胞篩除去較大的組織碎片，然后以1000r/min離心5min,棄上清,收集細胞；(3)往收集的細胞中加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為lxl05/ml接種于透氣培養(yǎng)瓶中，置于28°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時，觀察細胞生長情況，當細胞貼壁面積達到80%時，吸去細胞培養(yǎng)液，用LBSS沖洗I 2遍；如果培養(yǎng)到第五天細胞貼壁面積還達到80%，便進行半量更換液培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；(4)然后，刮下上皮樣細胞克隆區(qū)域以外的細胞群，再往培養(yǎng)瓶加入傳代培養(yǎng)液淹沒貼壁面的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到上皮樣細胞克隆區(qū)域達到85%以上，即得到參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。由上述方法所得到的細胞系于2012年7月6日送至地址在中國.武漢.武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC-C201294，分類命名為參環(huán)毛蚓腸細胞系 IEC-6-P. A0例2 (參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的效果)本例所用的樣品和對照品如下樣品例I所得到的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。對照品采用《廣州中醫(yī)藥大學學報》2011年5月第28卷第3期刊載了題為“參環(huán)毛蚓細胞原代培養(yǎng)滅菌方法的研究”一文所述方法構建的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系。I、存活細胞計數(shù)(I)試劑(I. I)臺盼藍染色液該染色液是把臺盼藍粉末加入雙蒸水中制備形成40g/L的染色母液，在使用時加入PBS稀釋至4g/L。(I. 2) MTT試劑該試劑是把MTT粉末加入到PBS完全溶液，O. 22umL濾膜過濾形成濃度為5mg/ml的MTT試劑。(I. 3)培養(yǎng)液與例I所述的培養(yǎng)液相同。(2)實驗方法(2. I)制備細胞懸液A、樣品細胞懸液取樣品加入到培養(yǎng)液中制備形成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度為2x105-5x105個/mL，在細胞計數(shù)板上上計數(shù)；B、對照品細胞懸液取對照品加入到培養(yǎng)液中制備形成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度為 2x105-5x105 個 /mL ；(2. 2)臺盼藍染色將樣品和對照品細胞懸液分別按細胞懸液臺盼藍染液=9:1的比例與臺盼藍染液混合，染色Imin ； (2. 3)顯微鏡計數(shù)用移液槍吸取經(jīng)步驟(2. 2)染色后細胞懸液，滴一滴在血細胞計數(shù)板的蓋玻片的邊沿，待細胞懸液充滿細胞計數(shù)區(qū)域時，按常規(guī)的細胞計數(shù)方法，記錄下計數(shù)板中間和四個角的五個區(qū)域中的細胞總數(shù)。五個區(qū)域中染成藍色為死細胞，未染色為活細胞。將所述五個區(qū)域中活細胞數(shù)和死細胞數(shù)記錄于下表I中；下表I中細胞存活率由下式(I )計算得到，細胞存活率(％)=活細胞數(shù)/(死細胞數(shù)+活細胞數(shù))xlOO°/o。表I樣品和對照品中細胞的成活率
權利要求
1.一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，其特征在于，其保藏號為CCTCC一C201294。
2.一種建立權利要求I所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系的方法，該方法由以下步驟組成 Cl)將收集野外采集的參環(huán)毛蚓置于實驗室泥土 (溫度28 °C、PH=4. 5、土壤含水量.21. 5%)中，用蒸餾水養(yǎng)殖2周后，置于墊有用蒸餾水濕潤的濾紙的燒杯中，保持適宜的溫度.28 0C，濕度60%，每天換濾紙I次，吐泥3 4天； (2)取吐泥3 4天后的參環(huán)毛蚓于超凈臺上，用75%酒精體表消毒后解剖，將獲得的腸道部位用LBSS緩沖液沖洗，再用抗生素組合液滅菌2 3min ;棄抗生素組合液得到的腸道部分先加入體積為腸道體積的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后棄去酶解液,再加入體積為腸道體積的10倍的Collagenase Type I酶解液酶解20分鐘,過100目的細胞篩除去較大的組織碎片，然后以1000r/min離心5min,棄上清,收集細胞；其中， 所述的抗生素組合液是將青霉素鈉、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素組合液中，青霉素鈉的濃度為200U/ml，硫酸鏈霉素的濃度為.400 μ g/ml，硫酸慶大霉素的濃度為300U/ml，兩性霉素B的濃度為5 μ g/ml ； 所述的Thermolysin酶解液是將Thermolysin粉末加入到濃度為IOm mol/ml的HEPES溶液中過濾滅菌混合制成，所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的濃度為25 μ g/mL ； 所述的 Collagenase Type I 酶解液是將 Collagenase Type I 粉末加入到 HBSS (Ix)溶液中過濾滅菌而成，所制的Collagenase Type I酶解液中Collagenase Type I的濃度為 O. 2mg/mL ； (3)往收集的細胞中加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為IxlOVml接種于透氣培養(yǎng)瓶中，置于.28°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時，觀察細胞生長情況，當細胞貼壁面積達到80%時，吸去細胞培養(yǎng)液，用LBSS沖洗I 2遍；如果培養(yǎng)到第五天細胞貼壁面積還達到80%，便進行半量更換液培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；其中所述的培養(yǎng)液由91. 55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin試劑、O. 75%的濃度為40000U/ml的硫酸慶大霉素、O. 2%的青霉素鈉試劑、.O.4%的硫酸鏈霉素試劑、O. 1%的兩性霉素B試劑組成，其中， 所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ； 所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中 insulin 的濃度為 200 μ g/ml ； 所述的青霉素鈉試劑是將青霉素鈉溶解到LBSS中制成，其中青霉素鈉在試劑的濃度為 100000U/ml ； 所述的硫酸鏈霉素試劑是將硫酸鏈霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸鏈霉素在試劑中的濃度為800000 μ g/ml ； 所述的兩性霉素B試劑是將兩性霉素B溶解到DMSO中制成，其中兩性霉素B在試劑中的濃度為5000 μ g/ml ； (4)然后，刮下上皮樣細胞克隆區(qū)域以外的細胞群，再往培養(yǎng)瓶加入傳代培養(yǎng)液淹沒貼壁面的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到上皮樣細胞克隆區(qū)域達到85%以上，即得到所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系；其中所述的傳代培養(yǎng)液是由體積百分比為91. 5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的濃度為2000ng/ml EGF溶液；1%的濃度為200 μ g/ml insulin試劑；I. 45%青霉素-鏈霉素溶液(lx)，其中， 所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的濃度為IOm mol/ml的HEPES緩沖溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的濃度為2000ng/ml ； 所述的insulin試劑是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin試劑中 insulin 的濃度為 200 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系，其特征在于，其保藏號為CCTCC—C201294。本發(fā)明所述的參環(huán)毛蚓腸上皮細胞系不僅其中成活的細胞數(shù)高，而且細胞的生命力強、傳代培養(yǎng)分裂增長速度快，可用于藥品或營養(yǎng)保健品的開發(fā)。
文檔編號C12N5/07GK102888380SQ20121033469
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權日2012年9月11日
發(fā)明者李薇, 侯雪芹, 林小樺, 喻良文, 盧瑞珊, 吳文如 申請人:廣州中醫(yī)藥大學