一種誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物。本發(fā)明提供了一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的方法，具體地，首先將NeuroD1基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroD1的假病毒顆粒，并通過NeuroD1假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。所獲得的神經(jīng)元細(xì)胞及其組合物，能夠在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病等的治療中有潛在價值。
【專利說明】一種誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元細(xì)胞的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著十分廣闊的應(yīng)用前景，胚胎干細(xì)胞具有全面分化的潛能，成為研究的熱點， 但干細(xì)胞的研究面臨倫理上眾多質(zhì)疑，嚴(yán)重的影響了對于干細(xì)胞的研究。
[0003]1997年英國科學(xué)家Wilmut等人將羊體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核的卵母細(xì)胞中并發(fā)育成成熟的個體——著名的多利羊，從而在實踐中證實了體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成為全能干細(xì)胞的可能性，但卵母細(xì)胞通常難以獲得，對卵母細(xì)胞的顯微操作技術(shù)要求非常高，這無疑影響了干細(xì)胞的研究。
[0004]2006年，日本科學(xué)家Takahashi和Yamanaka發(fā)現(xiàn)4個轉(zhuǎn)錄因子(0ct_4、Sox_2、Klf4和c-Myc)共同作用小鼠皮膚細(xì)胞后，能夠成功的將其誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)分化為可以向三個胚層分化的多能干細(xì)胞，2007年Takahashi和Yamanaka利用這四個轉(zhuǎn)錄因子成功的將人的表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成多功能干細(xì)胞。Takahashi和Yamanaka所用的技術(shù)被稱為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS)技術(shù)，他們的研究使人類向再生醫(yī)學(xué)及疾病治療的夢想又邁進(jìn)了一步。盡管Takahashi和Yamanaka的研究成為了干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的一個里程碑，但在實際操作中必須經(jīng)歷從體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得多功能干細(xì)胞，再從多功能干細(xì)胞基礎(chǔ)上定向分化為目的靶細(xì)胞。整個過程步驟多、周期長，失敗率高，所分化的細(xì)胞還具有腫瘤形成的潛在危險，這些問題不利于該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。
[0005]2010年Wernig實驗室首次在Nature上報道了通過小鼠的體細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得具有功能性的類似神經(jīng)元細(xì)胞，開啟了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究的新篇章。作者首先對神經(jīng)組織進(jìn)行基因分析，獲得了 19個特異的基因，構(gòu)建并包裝成為慢病毒顆粒；通過用這19個基因慢病毒感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)數(shù)日后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元特異性基因Tujl表達(dá)；隨后將基因范圍縮小至Brn2、Ascll和Mytll (簡稱BAM)三個基因上；檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞的一些特征:基因表達(dá)，免疫熒光，突觸電位等；實驗結(jié)果表明，通過誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞可以獲得具有神經(jīng)元形態(tài)和功能的類神經(jīng)元細(xì)胞。2011年Wernig實驗室通過Brn2、Ascll、Mytll和NeuroDl四個轉(zhuǎn)錄因子，將人的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成功能性神經(jīng)元細(xì)胞。這些研究簡化了從體細(xì)胞誘導(dǎo)到多功能干細(xì)胞再定向分化為神經(jīng)元的繁瑣途徑，為神經(jīng)生物學(xué)研究提供了更為有效的工具。
[0006]帕金森病主要是因位中腦部位〃黑質(zhì)〃區(qū)中的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病變，多巴胺的合成減少、抑制乙酰膽堿的功能降低而造成的，病變之后，神經(jīng)元數(shù)量減少、功能下降，該區(qū)域?qū)荒z質(zhì)細(xì)胞所“占領(lǐng)”，如果能夠讓這些膠質(zhì)細(xì)胞再變回為神經(jīng)元細(xì)胞，那么也許對于帕金森病的治療有一定的幫助作用。
[0007]綜上，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)簡便有效誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的為提供一種簡便有效的誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物。
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種NeuroDl基因或NeuroDl蛋白的用途，用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物。
[0011]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種假病毒顆粒，所述假病毒顆粒具有以下特征:
[0012](a)攜帶外源的NeuroDl的編碼序列；
[0013](b)可感染膠質(zhì)細(xì)胞，并且在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源的NeuroDl轉(zhuǎn)錄因子。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的NeuroDl來源于人。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疹病毒、或痘病 毒。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的假病毒顆粒是如下制備的:
[0017]將攜帶NeuroDl的編碼序列的載體導(dǎo)入假病毒顆粒的包裝細(xì)胞中，從而形成假病
毒顆粒。
[0018]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件:
[0019]膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子、NeuroDl的編碼序列、終止密碼子。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子(GFAP，膠質(zhì)纖維酸性蛋白)和HRE-GFAP雜合啟動子(HRE，低氧反應(yīng)元件)。
[0021]在另一優(yōu)選例中，NeuroDl來源于哺乳動物，優(yōu)選人。
[0022]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明第三方面中所述的表達(dá)盒。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒載體。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
[0025]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物包括(i)藥學(xué)上可接受的載體以及(ii)本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或本發(fā)明第二方面所述的假病毒顆粒。
[0026]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種本發(fā)明第四方面所述表達(dá)載體或本發(fā)明第二方面所述的假病毒顆粒的用途，它們被用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
[0027]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞的方法，包括步驟:
[0028]在外源NeuroDl蛋白存在下，培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的外源NeuroDl蛋白包括在培養(yǎng)體系中添加的NeuroDl蛋白，或在所述膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源NeuroDl編碼序列而產(chǎn)生的外源NeuroDl蛋白。
[0030]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1顯示了用于構(gòu)建NeuroDl慢病毒載體的載體FUGW的結(jié)構(gòu)圖。
[0032]圖2顯示了被NeuroDl慢病毒感染后的U87細(xì)胞的免疫熒光圖(明視野200x，藍(lán)色為DAPI染色)。結(jié)果顯示，被感染的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)Tujl蛋白。
[0033]圖3顯示了未感染NEUR0D1慢病毒的U87細(xì)胞的免疫熒光圖(熒光視野200x，紅色為Tujl染色)。結(jié)果顯示，未表達(dá)Tujl蛋白。
【具體實施方式】
[0034]本發(fā)明人經(jīng)過長期深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，NeuroDl單基因可有效地誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明人將NeuroDl基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroDl的假病毒顆粒，并通過NeuroDl假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0035]啟動子
[0036]在本發(fā)明中，可用的啟動子沒有特別限制，為一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，有與NeuroDl模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性?？梢赃x自組成性因子、誘導(dǎo)性因子和組織特異性因子。更佳地為組織特異性啟動子，如膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子，可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性啟動遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。
[0037]NeuroD 1基因和蛋白
[0038]NeuroDl，神經(jīng)分化因子1，又名B細(xì)胞E盒轉(zhuǎn)錄激活因子2 (BETA-2)，屬于組織特異性的B類bHLH蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子，NeuroD-Ι基因是β細(xì)胞特異和有效表達(dá)胰島素基因所必需。
[0039]基因名稱:NEUR0D1物種:人源；轉(zhuǎn)錄本的Genbank編號:NM 002500。
[0040]NEUROD 1的氨基酸序列的登錄號為NP 002491.2，具體序列如下:
[0041]MTKSYSESGL MGEPQPQGPP SWTDECLSSQ DEEHEADKKE DDLEAMNAEE DSLRNGGEEE 60
[0042]DEDEDLEEEE EEEEEDDDQK PKRRGPKKKK MTKARLERFK LRRMKANARE RNRMHGLNM 120
[0043]LDNLRKVVPC YSKTQKLSKI ETLRLAKNYI WALSEILRSG KSPDLVSFVQ TLCKGLSQPT 180
[0044]TNLVAGCLQL NPRTFLPEQN QDMPPHLPTA SASFPVHPYS YQSPGLPSPP YGTMDSSHVF 240
[0045]HVKPPPHAYS AALEPFFESP LTDCTSPSFD GPLSPPLSIN GNFSFKHEPS AEFEKNYAFT 300
[0046]MHYPMTLAG AQSHGSIFSG TMPRCEIPI DNIMSFDSHS HHERVMSAQL NAIFHD356
[0047](SEQ ID N0.: 1)
[0048]應(yīng)理解，在本發(fā)明中，術(shù)語“NeuroDl基因和蛋白”不僅包括野生型和突變型的NeuroDl基因和蛋白，還包括NeuroDl蛋白的活性片段或活性衍生蛋白(以及相應(yīng)的編碼序列)，只要所述活性片段或活性衍生蛋白仍具有野生型NeuroDl蛋白的基本功能(例如保留≥50%,≥70%以上野生型Neurol蛋白活性)。
[0049]NeuroDl基因可用常規(guī)方法(如PCR或全合成)獲得，然后導(dǎo)入載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，從而表達(dá)獲得NeuroDl蛋白。此外，NeuroDl基因或克隆還可購買獲得，例如可購自O(shè)riGene公司(貨號SC118625)購得。[0050]病毒載體
[0051]在本發(fā)明中，一種優(yōu)選的載體是病毒載體。本發(fā)明的病毒載體可以將膠質(zhì)細(xì)胞直接誘導(dǎo)形成神經(jīng)元。
[0052]用于本發(fā)明的病毒載體沒有特別限制，可以是任何能夠利用病毒具有傳送其基因組的特點，將遺傳物質(zhì)帶入其他細(xì)胞，進(jìn)行感染的病毒載體。可發(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體。
[0053]—種優(yōu)選的病毒載體是慢病毒載體。在本發(fā)明的一個實例中，通過PCR技術(shù)將NeuroDl基因構(gòu)建到FUGW慢病毒載體上，從而形成FUGW-NEUR0D1慢病毒載體。
[0054] 一種特別優(yōu)選的病毒載體是假病毒顆粒。在本領(lǐng)域中，制備假病毒顆粒的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如采用包裝細(xì)胞來生產(chǎn)假病毒顆粒。
[0055]在本發(fā)明的一個實例中，一種NeuroDl慢病毒載體的包裝方法包括:將載體系統(tǒng)中的FUGW-NEUR0D1慢病毒載體、pCMV_dR8.2dvpr載體和pCMV_VSV_G載體共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即可在宿主細(xì)胞中包裝獲得NEUR0D1慢病毒顆粒。宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0056]體外誘導(dǎo)方法
[0057]本發(fā)明還提供了一種體外的、非治療性的將膠質(zhì)細(xì)胞直接誘導(dǎo)成神經(jīng)元的方法。一種通過NeuroDl慢病毒顆粒誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的方法包括步驟:通過NeuroDl慢病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞，感染后的細(xì)胞維持培養(yǎng)20天以上，從而形成神經(jīng)元。
[0058]經(jīng)誘導(dǎo)所形成的神經(jīng)元細(xì)胞，可通過免疫熒光進(jìn)行檢測，例如，用神經(jīng)元特異性蛋白Tujl的抗體來檢測，從而鑒別出神經(jīng)元細(xì)胞。
[0059]藥物組合物以及給藥方式
[0060]本發(fā)明還提供一種可用于將非神經(jīng)元細(xì)胞(如膠質(zhì)細(xì)胞)誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的組合物。本發(fā)明的藥物組合物還可治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病。
[0061]本發(fā)明藥物組合物包括本發(fā)明上述的表達(dá)載體或假病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。
[0062]在本發(fā)明的藥物組合物，通常含有106_1012PFU/ml的假病毒顆粒，較佳地107-1012PFU/ml的假病毒顆粒，更佳地109-10nPFU/ml的假病毒顆粒。
[0063]“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0064]術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。
[0065]通常，將所述表達(dá)載體或假病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體混合后，即可獲得的本發(fā)明的藥物組合物。
[0066]本發(fā)明所述的組合物的給藥方式?jīng)]有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于):靜脈注射、皮下注射、腦部注射等。
[0067]本發(fā)明的有益效果包括:
[0068]1.本發(fā)明僅需包裝NeuroDl —個轉(zhuǎn)錄因子至病毒載體，即可將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元細(xì)胞，解決了只有將多個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入載體才能獲得功能性神經(jīng)元的步驟。
[0069]2.本發(fā)明簡化了將體細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞，再定向分化為神經(jīng)元的繁瑣途徑。
[0070]3.啟動子為膠質(zhì)細(xì)胞識別特異性啟動子，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄僅在膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行，避免了感染其他細(xì)胞的可能。
[0071]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0072]實驗材料
[0073]1.載體:
[0074]載體名稱:FUGW(購自Addgene公司，貨號14883)
[0075]兀件順序:Ubiquitinpromoter-MCS-GFP-ffRE
[0076]克隆位點:BamHI/AgeI
[0077]載體圖譜:如圖1所示。
[0078]2.擴(kuò)增引物:
[0079]正向:
[0080]aggtcgactc tagaggatcc cgccaccatg accaaatcgt acagcga(SEQ ID N0.:2)
[0081]反向:`
[0082]agtccatggt ggcgaccgga tcatgaaata tggcattgag c(SEQ ID N0.:3)
[0083]3.細(xì)胞
[0084]3.1.293T 細(xì)胞:
[0085]購自美國ATCC。細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，細(xì)胞密度為1.2X107細(xì)胞/20ml (0.6X109/L)時，重新接種于15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
[0086]3.2 膠質(zhì)細(xì)胞 U87:
[0087]購自美國ATCC。用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，細(xì)胞密度為1.2X107細(xì)胞/20ml (0.6X109/L)時，重新接種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)
[0088]實施例1
[0089]NeuroDl慢病毒載體的構(gòu)建:
[0090](1)以通過NEUR0D1 cDNA克隆為模板，通過擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得大小
1.1Kb左右的PCR產(chǎn)物。
[0091 ] (2)對PCR產(chǎn)物和病毒載體進(jìn)行BamHI和Agel的雙酶切。
[0092](3)過T4 DNA連接酶(購自Takara公司)連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0093](4)通過對轉(zhuǎn)化子的鑒定，挑選陽性克隆送測，以測序序列和預(yù)期序列一致的作為正確克隆，命名為FUGW-NEUR0D1慢病毒載體。
[0094]實施例2
[0095]NeuroDl慢病毒載體的包裝:
[0096](1)制備慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒的DNA溶液(FUGW-NEUR0D1慢病毒載體 20 μ g，pCMV-dR8.2 dvpr 載體(購自 Addgene) 15 μ g, pCMV-VSV-G 載體(購自Addgene) 10 μ g,與相應(yīng)體積的Opti_MEM混合均勻稀釋,調(diào)整總體積為2.5ml,在室溫下溫育5分鐘。
[0097](2)取 100 μ lLipofectamine2000 (購自 invitrogen)試劑在另一管中與 2.4mlOpt1-MEM(購自invitrogen)混合稀釋,在室溫下溫育5分鐘。
[0098](3)把(1)中所述稀釋后的DNA與(2)中所述稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，5分鐘內(nèi)輕輕地顛倒混勻。室溫下溫育20min。
[0099](4)將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。
[0100](5)每瓶細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25ml，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0101](6)收集轉(zhuǎn)染48小時后的293T細(xì)胞上清液。于4°C，4000g離心lOmin，除去細(xì)胞碎片。以0.45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中并蓋上蓋子，將過濾杯插到濾過液收集管中。組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。在4000g離心約10-15分鐘。離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。
[0102](7)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長期保存。所獲得的病毒命名為NEUR0D1慢病毒顆粒。
[0103]實施例3
[0104]NeuroDl慢病毒誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞；
[0105](1)當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞U87密度達(dá)50%~60%時進(jìn)行病毒感染，感染前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
[0106](2)根據(jù)U87細(xì)胞的Μ0Ι值(M0I=5)，加入適宜量的NEUR0D1慢病毒(加入病毒數(shù)=細(xì)胞數(shù)X Μ0Ι值)。12h后觀察細(xì)胞狀態(tài):如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。
[0107](3)培養(yǎng)基更換:當(dāng)U87細(xì)胞被NEUR0D1慢病毒感染后三天時，使用帶有N27因子(Invitrogen, 17504-044,)的 Neurobasal 培養(yǎng)基(Invitrogen, 12348-017)逐步替換原有的培養(yǎng)基。替換方法，每次保留1/2的原有培養(yǎng)基，加入1/2的新鮮的帶有N27因子的Neurobasal培養(yǎng)基，每三天更換一次培養(yǎng)基，確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。
[0108](4)細(xì)胞維持:病毒感染后的U87細(xì)胞需要持續(xù)培養(yǎng)20天以上，在此期間需要對細(xì)胞進(jìn)行定期換液。
[0109]實施例4
[0110]對所誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的免疫熒光檢測；
[0111]將持續(xù)培養(yǎng)20天以上的感染后U87細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗，實驗步驟如下:
[0112](1)洗滌:用TBS輕輕清洗細(xì)胞，洗三次，以去除細(xì)胞中的雜質(zhì)；
[0113](2)固定步驟:新鮮配好的4%多聚甲醛固定常溫20分鐘；
[0114](3)洗滌:預(yù)冷的TBS洗三遍，每遍5分鐘；
[0115](4)透膜:吸干液體，用0.2%Triton-X室溫10分鐘。
[0116](5)洗滌:TBS洗三遍，每遍5分鐘；[0117](6)封閉:加 200μ 12%BSA，室溫 1 小時。
[0118](7) 一抗孵育:β 3-Tubulin (TU-20)Mouse mAb (Cell Signaling Technology,#4466)，加100 μ 1 一抗(1:200),用1%BSA配抗體，4度過夜，或者37度2小時。
[0119](8)洗滌:洗一抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈。
[0120]以下步驟均在暗室操作
[0121](9) 二抗孵育:(暗室操作)Alexa Fluor 546 Donkey Ant1-MouseIgG(Invitrogen，A10036)，加 100 μ 1 二抗(1:500)，閉光，室溫孵育 1 小時。
[0122](10)洗滌:(暗室操作)洗二抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈，避光。
[0123](11)封片:(暗室操作)用VECTASHIEIjy的DAPI染色劑(4’，6- 二脒基-2-苯基口引哚4’，6-diamidino-2-phenylindole,是一種能夠與DNA強力結(jié)合的突光染料)(H-1200)(3ng/mL)，室溫10分鐘；注意:盡量不要有氣泡；玻片放上后就不能再移動。
[0124](12)拍照:使用熒光顯微鏡拍照:
[0125]NEUROD 1慢病毒感染后的U87細(xì)胞，再維持20天以上時，通過神經(jīng)元特異性蛋白Tujl的免疫熒光實驗，結(jié)果表明U87細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)Tujl蛋白(如圖2)，說明此時的U87細(xì)胞已經(jīng)具備了神經(jīng)元的特性。而未感染NEUR0D1慢病毒的U87細(xì)胞則無法檢測到Tujl的表達(dá)(如圖3)。
[0126]這表明，NEUR0D1慢病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白，使得所誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞具備了神經(jīng)元特性。
[0127]實施例5
[0128]構(gòu)建膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的表達(dá)盒和載體
[0129]GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子是已知的可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動子。在本實施例中，以構(gòu)建好的FUGW-NEUR0D1慢病毒載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的慢病毒載體。具體的方法如下:
[0130]FUGff-NEUROD 1載體中用于啟動NEUROD 1的ub i qui t in啟動子從載體中通過酶切的方法切除，插入PCR擴(kuò)增獲得的膠質(zhì)特異性啟動子-GFAP啟動子或HRE-GFAP啟動子，從而獲得含有以下表達(dá)盒的NEUROD 1慢病毒載體:
[0131](a)GFAP啟動子-NeuroDl的編碼序列-終止密碼子；
[0132](b) HRE-GFAP雜合啟動子-NeuroDl的編碼序列-終止密碼子。
[0133]所述的表達(dá)盒可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)NeuroDl蛋白。
[0134]測試結(jié)果表明，含該組織特異性表達(dá)盒的慢病毒載體感染膠質(zhì)細(xì)胞后，同樣可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白(Tujl蛋白)，使得所誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞具備了神經(jīng)元特性。此外，該含該組織特異性表達(dá)盒的慢病毒載體感染表皮細(xì)胞后，不表達(dá)外源的NeuroDl蛋白。
[0135]討論:
[0136]本發(fā)明提供了一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的方法，具體地，首先將NeuroDl基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroDl的假病毒顆粒，并通過NeuroDl假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)退行性疾病是由于神經(jīng)元衰老和死亡后膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)了主導(dǎo)地位，從而阻斷了神經(jīng)元之間的電生理反應(yīng)。NEUROD 1慢病毒可以將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)形成神經(jīng)元細(xì)胞，NEUR0D1病毒載體在神經(jīng)退行性疾病(例如帕金森病等)的治療中具有潛在價值，通過將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元后將中斷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修復(fù)，從而減輕病人的痛苦。
[0137]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種NeuroDl基因或NeuroDl蛋白的用途,其特征在于,用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
2.一種假病毒顆粒，其特征在于，所述假病毒顆粒具有以下特征:(a)攜帶外源的NeuroDl的編碼序列；(b)可感染膠質(zhì)細(xì)胞，并且在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源的NeuroDl轉(zhuǎn)錄因子。
3.如權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒，其特征在于，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疫病毒、或痘病毒。
4.一種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件:膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子、NeuroDl的編碼序列、終止密碼子。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述的膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子；和/或NeuroDl來源于哺乳動物，優(yōu)選人。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒載體；更佳地，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括(i)藥學(xué)上可接受的載體以及(?)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒。
9.一種權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
10.一種誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟:在外源NeuroDl蛋白存在下，培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/861GK103667190SQ201210330915
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】高博, 盛一, 謝勝華, 吳慶, 徐述 申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司