專利名稱：一種海水中重金屬鎘污染的生物學(xué)靈敏檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋污染的生物探針監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，涉及水生動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)，具體的說(shuō)是一種新型、高效、靈敏的海水重金屬鎘的生物學(xué)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著我國(guó)采礦、冶煉、陶瓷、電鍍、顏料及電子工業(yè)的迅猛發(fā)展，使鎘、砷、汞等有害重金屬以工業(yè)“三廢”形式大量排放到自然界，不僅對(duì)耕地等土壤環(huán)境造成污染，還會(huì)隨水體的地表及地下徑流進(jìn)入海洋，對(duì)近岸水體造成嚴(yán)重污染。其中，我國(guó)環(huán)渤海區(qū)域 近岸海域水體重金屬鎘(Cd2+)的污染尤為嚴(yán)重。重金屬鎘的污染不僅具有范圍廣，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，不易在生物體內(nèi)分解排放和污染后難以發(fā)現(xiàn)等特點(diǎn)，且可沿食物鏈轉(zhuǎn)移進(jìn)而在人體內(nèi)富集，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害。因此，重金屬鎘的污染已經(jīng)成為全社會(huì)普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者面臨的重要研究命題之一。鎘(Cd)原子量112. 41，在周期表中屬II B族元素。鎘溶于酸但不溶于堿，其氧化態(tài)為Cd + 1和Cd + 2。鎘可形成多種配離子，如Cd(NH3)' Cd(CN)、CdCl等。鎘對(duì)動(dòng)植物毒性較大，被其污染的空氣和食物對(duì)人體危害嚴(yán)重。早在上世紀(jì)中期，日本富山縣神通川流域河岸出現(xiàn)的“痛痛病”，即患者出現(xiàn)腰、背、手、腳等關(guān)節(jié)有針刺般痛感，數(shù)年后骨骼嚴(yán)重畸形，骨脆易折，其原因是該河岸的冶煉廠等排放的含鎘物質(zhì)污染了水體，當(dāng)?shù)鼐用耖L(zhǎng)期飲用鎘污染的河水并食用鎘污染水種植的稻米，使鎘在體內(nèi)蓄積而中毒致病。2011年2月，國(guó)內(nèi)許多媒體報(bào)道，我國(guó)一些礦區(qū)殘留的重金屬鎘正通過(guò)污染土壤侵入稻米，抽樣調(diào)查顯示中國(guó)多地市場(chǎng)上約10%大米鎘含量超過(guò)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，引起了食品衛(wèi)生部門的高度重視。許多研究證明，鎘對(duì)植物體產(chǎn)生毒性的臨界值一般高于動(dòng)物和人體毒害臨界值，也就是說(shuō)，重金屬鎘對(duì)動(dòng)物及人體的危害比植物更為嚴(yán)重。許多研究表明，各種海洋動(dòng)物由于生境和食性的差別，其體內(nèi)重金屬蓄積的種類有所不同。例如以浮游生物為食的魚(yú)類、貝類等體內(nèi)的砷、鎘的含量較高，以固著藻類和有機(jī)質(zhì)碎屑為食的魚(yú)類和貝類等體內(nèi)鉻、銅的含量較高，以底棲小型動(dòng)物為食的魚(yú)類和貝類體內(nèi)鋅的含量較高，雜食性動(dòng)物體內(nèi)的鉛、鎳含量高。以上為本發(fā)明生物材料的選擇提供了基礎(chǔ)。目前，世界各國(guó)都十分重視重金屬鎘污染的環(huán)境檢測(cè)，不斷加強(qiáng)對(duì)采礦廢料、工業(yè)廢水、生活污水的監(jiān)測(cè)和處理，對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品和水產(chǎn)品中的有害物也有嚴(yán)格的衛(wèi)生檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)和定期監(jiān)測(cè)部門。但是，傳統(tǒng)的幾種檢測(cè)手段在靈敏度和穩(wěn)定性方面有明顯不足，最重要的是傳統(tǒng)方法沒(méi)有真正反映出生物體在鎘脅迫下其生理、生化反應(yīng)及代謝調(diào)節(jié)作用等方面的變化。本發(fā)明是基于重金屬鎘對(duì)軟體動(dòng)物青蛤產(chǎn)生毒害情況下，引起青蛤相關(guān)基因應(yīng)激表達(dá)而建立的一種快速、靈敏的水體重金屬鎘的有效監(jiān)測(cè)方法，也可以作為環(huán)境監(jiān)測(cè)部門評(píng)價(jià)水體重金屬鎘對(duì)生物產(chǎn)生毒害的早期觀測(cè)值。熱休克蛋白HSP70是一種在幾乎所有生物應(yīng)激細(xì)胞中都存在、并廣泛參與各種保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞功能的大分子，其具有穩(wěn)定新生多肽、幫助蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等重要作用。該蛋白的基因在重金屬脅迫下會(huì)大量誘導(dǎo)，以表達(dá)出應(yīng)激性蛋白使機(jī)體抵御不良環(huán)境。鑒于以上特征，該家族蛋白被認(rèn)為是水體環(huán)境環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要標(biāo)志物。使用生物標(biāo)志物作為監(jiān)測(cè)手段的優(yōu)點(diǎn)如下；首先，它反映的是生物實(shí)際的生理狀態(tài)，監(jiān)測(cè)的是個(gè)體免疫應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)指標(biāo)變化，這種變化通常要早于有害物在水體中蓄積水平的變化，因而能起到早期預(yù)測(cè)的作用，這也是生物標(biāo)志物最重要之處。另外，目前國(guó)內(nèi)水體重金屬生物標(biāo)志物方面的技術(shù)僅局限于測(cè)量應(yīng)激蛋白含量及活性。有關(guān)利用應(yīng)激性蛋白基因的表達(dá)過(guò)程作為重金屬鎘污染監(jiān)測(cè)方法方面，沒(méi)有任何正式的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有監(jiān)測(cè)技術(shù)中利用傳統(tǒng)儀器和生化方法測(cè)量的缺點(diǎn)與不足，提供一種快速、靈敏的水體重金屬鎘的高效分子生物學(xué)監(jiān)測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種監(jiān)測(cè)海水中重金屬鎘的熱休克蛋白HSP-70熒光PCR反應(yīng)的特異性引物，其特征在
于
擴(kuò)增引物
上游引物為HSP-70-RT-F :5’-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3’ ；
下游引物為 HSP-70-RT-R :5’ -CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3’ ；
作為內(nèi)參基因的青蛤β-actin基因特異性上下游引物 β -actin-S :5，-CACCACA ACTGCCGAGAG-3，； β -actin-A :5’-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3’。2.本發(fā)明所述的特異性引物檢測(cè)海水中重金屬鎘污染的生物學(xué)方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
(O以青蛤作為用于重金屬鎘污染監(jiān)測(cè)的指示生物樣品；
(2)樣品總RNA提取與純化采用通用的RNA提取方法和純化方法，從青蛤肝臟提取得到純化的肝臟總RNA ；
(3)cDNA第一鏈合成以青蛤肝臟中總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為25 μ L ；
(4)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)以上述合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)所述的特異性引物和內(nèi)參引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲取各管Ct值；
實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系設(shè)置如下
權(quán)利要求
1.一種用于監(jiān)測(cè)海水中重金屬鎘污染的熱休克蛋白HSP-70實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的特異性引物，其特征在于 上游引物為HSP-70-RT-F :5’-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3’ ； 下游引物為HSP-70-RT-R :5’-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3’ ； 作為內(nèi)參基因的青蛤β-actin基因特異性上下游引物為 β -actin-S :5，-CACCACAACTGCCGAGAG-3，； β -actin-A :5’-CCGATAGTGATGACCTGACC-3’。
2.一種采用權(quán)利要求I所述特異性PCR引物檢測(cè)海水中重金屬鎘的生物學(xué)方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行； (O以青蛤作為用于重金屬鎘污染監(jiān)測(cè)的指示生物樣本； (2)樣本總RNA提取與純化采用通用的RNA提取方法和純化方法，從青蛤肝臟提取得到純化的肝臟總RNA ； (3)cDNA第一鏈合成以青蛤肝臟中總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為.25 μ L ； (4)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)以上述合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)所述的特異性引物和內(nèi)參引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲取各管Ct值(Cycle threshold指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)); 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系設(shè)置如下mTI使用量I終濃度 SYBR PremixDimerEraser (2X )熒光 PCR 混合物_12. 5μ I_>< _ PCRForwardPrimer (10 μ Μ)正向引物O. 75 μ IO. 3 μ MX I PCRReversePrimer (ΙΟμΜ)反向引物0·75μ1O. 3 μ MX I Template (< IOOng)模板2μ1Χ2dH20滅菌蒸餾水_9μ I__ Total Volume 總體積25 μ IX 3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置如下； Hold (初期變性)=Cycle (循環(huán)數(shù))1.95 °C 30 秒 . 3Step PCR (擴(kuò)增)=Cycle (循環(huán)數(shù))40 .95 0C 5 秒 . 55 0C 30 秒 .72 0C 30 秒 Dissociation ； (5)青蛤肝臟HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算實(shí)時(shí)熒光PCR完成后，根據(jù)儀器自動(dòng)記錄的每管Ct值，使用以下公式計(jì)算； HSP70基因相對(duì)表達(dá)量=2_ΛΛα ；Δ Ct=Ct HSP70-Ct β -actin ； ΔΔ Ct=(CtHSP70-Ct β -actin)實(shí)驗(yàn)組-(CtHSP70_ Ct β -actin)對(duì)照組； . 2-δδ 計(jì)算實(shí)驗(yàn)組模板中Hsp70基因的量相對(duì)于對(duì)照組的變化量，取實(shí)驗(yàn)均值，即為青蛤肝臟HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效、簡(jiǎn)捷、靈敏檢測(cè)海水中重金屬鎘的生物學(xué)方法。具體是將青蛤分別置于含有重金屬鎘(Cd2+)和不含鎘(Cd2+)的海水中，在96h后解剖獲取青蛤肝臟組織，提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組青蛤HSP70(熱休克蛋白70)基因的表達(dá)量與對(duì)照組的差別，水體中的重金屬鎘(Cd2+)含量越高則熱休克蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量越大，并且可以觀察到分析儀器難以檢測(cè)出的水體中低濃度鎘(Cd2+)。本發(fā)明能夠作為一種常規(guī)生物技術(shù)監(jiān)測(cè)海水中重金屬鎘的污染程度及不同水域間的差異，它具有分析靈敏度高、對(duì)比性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以評(píng)價(jià)重金屬鎘(Cd2+)對(duì)水域及生物體的有害風(fēng)險(xiǎn)，避免勢(shì)態(tài)嚴(yán)重而造成不可挽回的損失。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102808036SQ201210316610
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者潘寶平, 張麗巖, 羅凱婭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)