專利名稱：檢測(cè)艾滋病相關(guān)支原體的引物、探針組合及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)艾滋病相關(guān)支原體的熒光定量PCR弓I物和探針及試劑盒。艾滋病相關(guān)支原體分別為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
背景技術(shù)：
艾滋病相關(guān)支原體通常指穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。這三種支原體在HIV感染及·AIDS的發(fā)展過(guò)程中起著輔助因子或者促進(jìn)因子的作用，與艾滋病的發(fā)病具有顯著的相關(guān)性，因此稱為艾滋病相關(guān)支原體(參考文獻(xiàn)Montagnier L, Blanchard A. Mycoplasmas asco-factors in infection due to the human immunodeficiency virus[J]. Clin infectDis, 1993，17:5309.)。如果診斷出艾滋病患者帶有穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體，在現(xiàn)有的治療方案上進(jìn)行針對(duì)性治療，就能夠減少感染機(jī)會(huì)，也就可以在一定程度上延長(zhǎng)患者的生命。目前國(guó)內(nèi)臨床對(duì)于上述3種支原體的診斷技術(shù)十分有限，造成部分?jǐn)y帶艾滋病相關(guān)支原體的患者不能及時(shí)有效診斷和治療，加重了艾滋病病毒對(duì)機(jī)體免疫抑制，增大了機(jī)會(huì)感染其他病原，嚴(yán)重威脅艾滋病患者生命。及時(shí)有效診斷艾滋病感染者是否感染上述3種艾滋病相關(guān)支原體對(duì)于艾滋病的輔助治療十分有效，但常規(guī)的病原體分離培養(yǎng)方法較難實(shí)施。這是因?yàn)榘滩∠嚓P(guān)支原體的生長(zhǎng)速度緩慢，分離培養(yǎng)困難，既增加了診斷成本，又延誤了確診時(shí)機(jī)，因此臨床上不使用分離培養(yǎng)作為檢測(cè)手段。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)成熟的艾滋病相關(guān)支原體血清學(xué)檢測(cè)試劑盒。盡管臨床對(duì)艾滋病相關(guān)支原體在艾滋病發(fā)展進(jìn)程中的作用及其臨床檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越重視，但是目前已報(bào)道的PCR檢測(cè)技術(shù)主要為普通PCR技術(shù)。國(guó)內(nèi)對(duì)于艾滋病相關(guān)支原體檢測(cè)主要依靠PCR方法(參考文獻(xiàn)糜祖煌，趙季文，秦玲.淋病患者AIDS相關(guān)支原體的分離培養(yǎng)與核酸檢測(cè)[J].中國(guó)人獸共患病雜志，2003，19 (3) :79-81.賈成梅，施素潔，羊海濤，等.從艾滋病患者和HIV感染者中分離2株支原體[J].中國(guó)人獸共患病雜志，2003, 19(6) :77-79. )。PCR檢測(cè)靈敏度一般，且對(duì)于3種支原體分別進(jìn)行檢測(cè)和電泳判讀結(jié)果耗時(shí)費(fèi)力，極大的增加了臨床檢測(cè)工作量和檢測(cè)成本，降低了檢測(cè)效率。因此，急需建立一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)技術(shù)來(lái)提高臨床對(duì)艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種能同時(shí)檢測(cè)3種檢測(cè)艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒和診斷試劑，以克服上述不足。本發(fā)明首先提供一種用于同時(shí)檢測(cè)艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR引物組合，所述艾滋病相關(guān)支原體分別為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的穿透支原體的ftsZ基因、發(fā)酵支原體的ftsZ基因和梨支原體的rpoB基因中保守區(qū)域使用Beacon Desinger7軟件設(shè)計(jì)探針和引物。探針類型均為TaqMan探針，其中穿透支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQl ；發(fā)酵支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQl ;梨支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)R0X，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ2。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的引物組合中，檢測(cè)穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA (SEQ ID NO. I)Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG (SEQ ID NO. 2)；檢測(cè)發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC (SEQ ID NO. 3)·Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC (SEQ ID NO. 4)；檢測(cè)梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC (SEQ ID NO. 5)Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG (SEQ ID NO. 6)。本發(fā)明提供了與上述引物組合配合使用的熒光探針組合，其中與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2 (SEQ ID NO. 9)。本發(fā)明還提供了上述引物組合和熒光探針組合在制備艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。具體地，上述應(yīng)用是將Platium quantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I, 50mMMgCl2 2. Ou I ；Platium TaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 l.Oul ；Mfer-F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ;Mfer-PO. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ;Mpi-PO. I u 1，無(wú)核酸酶水0. 35 ill ;待測(cè)樣品DNA模板5. 0 構(gòu)成25 u I的檢測(cè)反應(yīng)體系；上述引物和探針濃度均為25 u M0具體地，上述應(yīng)用中，試劑盒的工作條件為95°C預(yù)變性3min，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，57°C -60°C退火15s，40個(gè)循環(huán)；然后終止反應(yīng)。優(yōu)選地，試劑盒的工作條件中退火溫度為59°C。本發(fā)明提供一種艾滋病相關(guān)支原體的診斷試劑，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物組合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasmapirum)。本發(fā)明還提供一種艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)試劑盒，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物組合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasmapirum)。
本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽(yáng)性模板，所述陰性模板為無(wú)核酸酶水，所述陽(yáng)性模板為艾滋病相關(guān)支原體穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體基因組DNA。進(jìn)一步地，所述的試劑盒中，其25 ill的檢測(cè)反應(yīng)體系的具體配置為=Platiumquantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I,50mM MgCl2 2.0 U I ；Platium TaqO. 25 U I ；dNTP 混合溶液 I. 0 ii I ；Mfer-F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各
0.5u I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ；Mpi-P0. I u I，無(wú)核酸酶水 0. 35 u I ;待測(cè)樣品DNA模板5. 0 ill ;上述引物和探針濃度均為25 u M。

進(jìn)一步地，所述試劑盒的工作條件為95°C預(yù)變性3min，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，57°C -60°C退火 15s，40 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè)3種艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒是以三重?zé)晒釶CR方法為基礎(chǔ)進(jìn)行檢測(cè)的，包括以樣品總DNA為模板，利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值判定結(jié)果。本發(fā)明試劑盒每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NEG對(duì)照(陰性對(duì)照)和POS對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照)，兩種對(duì)照對(duì)于結(jié)果判讀起決定性作用有效擴(kuò)增NEG(―)和 POS ( + )無(wú)效擴(kuò)增NEG ( + )和POS ( + )提示體系污染無(wú)效擴(kuò)增NEG (—)和POS (—)提示體系錯(cuò)誤或者試劑失效。在對(duì)照有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測(cè)結(jié)果可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)；在檢測(cè)中兩種對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下Ct值小于等于36的標(biāo)本為陽(yáng)性結(jié)果；Ct值大于38的標(biāo)本為陰性結(jié)果；Ct值在36-38之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于38判定為陽(yáng)性擴(kuò)增，超過(guò)38判定為陰性擴(kuò)增。本發(fā)明試劑盒采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min，I個(gè)循環(huán)；95°C變性 15s，57。。-60°C退火 15s, 40 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明在實(shí)施例5對(duì)試劑盒的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度與普通PCR檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度高10-100倍。本發(fā)明針對(duì)三種艾滋病相關(guān)支原體的基因中保守區(qū)域設(shè)計(jì)多重特異性探針和引物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件優(yōu)化，建立了單個(gè)反應(yīng)可同時(shí)檢測(cè)這三種病原的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的方法以及以該方法為基礎(chǔ)構(gòu)建的靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)化了現(xiàn)有檢測(cè)三種病原支原體2/3以上的檢測(cè)工作量，并縮短檢測(cè)時(shí)間I小時(shí)左右。本發(fā)明提供的檢測(cè)三種艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒對(duì)于穿透支原體的檢測(cè)靈敏度為IO3拷貝，高于普通PCR 10倍；發(fā)酵支原體的檢測(cè)靈敏度為IO3拷貝，高于普通PCR 10倍；梨支原體的檢測(cè)靈敏度為IO2拷貝，高于普通PCR 100倍。且本發(fā)明試劑盒對(duì)臨床常見21種病原體以及人類染色體均無(wú)非特異擴(kuò)增，顯示出良好的特異度。


圖I為穿透支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中59 °C為最優(yōu)退火溫度。
圖2為發(fā)酵支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中59°C為最優(yōu)退火溫度。圖3為梨支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中57°C為最優(yōu)退火溫度。圖4為穿透支原體熒光PCR檢測(cè)體系的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為發(fā)酵支原體熒光PCR檢測(cè)體系 的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為梨支原體熒光PCR檢測(cè)體系的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為本發(fā)明三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法對(duì)三種艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果圖，其中圖7a為穿透支原體靈敏度結(jié)果，圖7b為發(fā)酵支原體靈敏度結(jié)果，圖7c為梨支原體靈敏度結(jié)果。其中I :108拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，2 :107拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，3 :106拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，4 :105拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，5 :104拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，6 :103拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，7 :102拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，8 10拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，9:陰性對(duì)照。圖8為普通PCR方法對(duì)三種支原體檢測(cè)靈敏度結(jié)果，其中圖8a為穿透支原體結(jié)果，圖8b為發(fā)酵支原體結(jié)果，圖8c為梨支原體結(jié)果；其中M Marker, I :陰性對(duì)照,2 108拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，3 :107拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，4:106拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，5 :105拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，6 :104拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，7 :103拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，8 :102拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒，9 :10拷貝陽(yáng)性質(zhì)粒。圖9為本發(fā)明對(duì)艾滋病相關(guān)支原體混合感染模擬標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果圖，其中圖9a為穿透支原體和發(fā)酵支原體雙重感染檢測(cè)結(jié)果，圖9b為穿透支原體和梨支原體雙重感染檢測(cè)結(jié)果，圖9c為發(fā)酵支原體和梨支原體雙重感染檢測(cè)結(jié)果，圖9d為穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體三重混合感染檢測(cè)結(jié)果；其中I :穿透支原體，2 :發(fā)酵支原體，3 :梨支原體，4 陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I三重?zé)晒釶CR引物和探針的設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的穿透支原體的ftsZ基因、發(fā)酵支原體的ftsZ基因和梨支原體的rpoB基因中保守區(qū)域使用Beacon Desinger7軟件設(shè)計(jì)探針和引物。探針類型均為TaqMan探針，其中穿透支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQl ;發(fā)酵支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQl ;梨支原體探針5’標(biāo)記熒光基團(tuán)R0X，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ2。檢測(cè)穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA (SEQ ID NO. I)Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG (SEQ ID NO. 2)；檢測(cè)發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC (SEQ ID NO. 3)Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC (SEQ ID NO. 4)；檢測(cè)梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC (SEQ ID NO. 5)
Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG (SEQ ID NO. 6)。本發(fā)明提供了與上述引物組合配合使用的熒光探針組合，其中與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQI (SEQ ID NO. 8)與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2 (SEQ ID NO. 9)。
··
實(shí)施例2三重?zé)晒舛縋CR退火溫度的優(yōu)化本發(fā)明分別對(duì)穿透支原體(Mycoplasma penetrans) ATCC55252、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans) ATCC19989 和梨支原體(Mycoplasma pirum) ATCC25960 進(jìn)行單重?zé)晒釶CR檢測(cè)(圖I 3)，并改變退火溫度，選擇最優(yōu)化的多重體系退火溫度。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，穿透支原體和發(fā)酵支原體最優(yōu)反應(yīng)退火溫度為59°C，梨支原體的最優(yōu)退火溫度為57°C，在此溫度下體系擴(kuò)增效果最好。綜合考慮上述因素將三重?zé)晒舛縋CR體系檢測(cè)的退火溫度范圍設(shè)定為57°C 60°C。實(shí)施例3三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系為
Mfer-F25f..iM 0.8ul
Mfer-R25^.iM 0.8ul
Mfer-P ( HEX )25^.iM 0.4ul
Mpen-F25f..iM 0.5ul
Mpen-R25{iiVl 0.5ul
Mpen-P ( FAM )25{iiV! 0.2u.I
Mpi-F25{.lM 0.3ul
Mpi-R25{.lM 0.3u.I
Mpi-P ( ROX )25)iiM 0.1^1
Platium quantitative PCR super , 7 ^ ,
Mix UDG41
MgCl250mM 2.0[,il
權(quán)利要求
1.一種用于同時(shí)檢測(cè)艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR引物組合，所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
2.如權(quán)利要求I所述的引物組合，其中檢測(cè)穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTAMpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG ； 檢測(cè)發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATCMfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC ； 檢測(cè)梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATCMpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG。
3.與權(quán)利要求2所述引物組合配合使用的熒光探針組合，其特征在于，與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2。
4.權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的熒光探針組合在制備艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于,將Platiumquantitative PCR super MixUDG12. 5u l,50mM MgCl22. 0 u I ；Platium TaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 l.Oul ；Mfer-F 和Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和Mpi-F各0.3 ill ；Mpi-P0. lul，無(wú)核酸酶水0. 35 u I ;待測(cè)樣品DNA模板5. 0 構(gòu)成25 yl的檢測(cè)反應(yīng)體系；上述引物和探針濃度均為25 PM。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，試劑盒工作條件為95°C3min，I個(gè)循環(huán)；950C 15s，57°C -60°C 15s, 40個(gè)循環(huán)；然后終止反應(yīng)。
7.一種艾滋病相關(guān)支原體的診斷試劑，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasmapenetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
8.一種艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasmapenetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其25Ul的檢測(cè)反應(yīng)體系的具體配置為Platium quantitative PCR super Mix UDG12. 5 u I, 50mM MgCl22. Oul ；PlatiumTaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 I. 0 yl ;Mfer_F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ；Mpi-P0. I yl，無(wú)核酸水.0.35 u I ;待測(cè)樣品DNA模板5. 0 ill ;上述引物和探針濃度均為25 u M。
10.如權(quán)利要求8或9所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其工作條件為95°C 3min，I個(gè)循環(huán)；95°C 15s，57°C -60°C 15s,40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)對(duì)艾滋病相關(guān)支原體(穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體)基因序列分析和比對(duì)，提供了適于同時(shí)檢測(cè)這3種艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR檢測(cè)的引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-9所示，本發(fā)明還提供了對(duì)艾滋病相關(guān)支原體進(jìn)行檢測(cè)的方法和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)試劑具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的檢測(cè)能力。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102787165SQ20121024508
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者何利華, 孟凡亮, 張建中, 張慧芳, 王艷冬, 肖迪, 趙飛 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所