專利名稱：一種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆乳清多肽的制備，具體涉及生產(chǎn)豆類分離蛋白及豆制品產(chǎn)生的乳清廢水的深加工，更具體地說是ー種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
大 乳清蛋白存在于加工大 分尚蛋白和 制品過程中排放的廢水中，生廣I噸的分離蛋白會(huì)排放20 30m3的乳清廢水。初步估算，每加工I噸的分離蛋白所排放的乳清廢水中含有乳清蛋白為70kg左右，因此，深入開發(fā)應(yīng)用豆類乳清，對(duì)于豆類綜合利用和環(huán)境保護(hù)方面都具有積極意義。近年來已有利用大豆分離蛋白加工抗腫瘤多肽和抗疲勞大豆多肽的報(bào)道，如劉娜等在中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)上發(fā)表的論文《大豆寡肽抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研 究》，戚穎欣等在食品科學(xué)雜志上發(fā)表的《大豆多肽對(duì)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究》，所用原料均為分離蛋白或多肽。目前尚未見到利用大豆類乳清水解多肽開發(fā)保肝和抗氧化食品的報(bào)道。已有的關(guān)于酶法水解乳清蛋白制備多肽的研究，如專利CN101519426A用堿性蛋白酶水解乳清蛋白，得到具有較高生理活性的多肽片段，分子量分布在100 2800Da之間；專利CN101785521A采用蛋白酶U和蛋白酶A復(fù)合水解得到乳清水解多肽，產(chǎn)物抗原性低、苦味小。這些酶法水解乳清多肽的特點(diǎn)是，①在水解前均對(duì)乳清蛋白進(jìn)行熱處理使其變性，加大能源耗費(fèi)；②這些方法中酶都是一次性直接大量加入的，這樣容易破壞水解時(shí)底物與酶的平衡關(guān)系，有相當(dāng)一部分酶在加入后根本沒有機(jī)會(huì)參與反應(yīng)而在罐內(nèi)慢慢降低酶活甚至失效(溫度、PH值及時(shí)間會(huì)使酶活部分喪失)；況且一次性投入大量的酶會(huì)造成前期反應(yīng)過快，過早產(chǎn)生大量游離氨基酸而使得多肽得率有所降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法。該方法酶解時(shí)間短、能耗較低，且使得IOOODa以下小分子乳清多肽得率高，游離氨基酸含量較低。本發(fā)明提供的ー種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法，包括以下步驟I)、將大豆乳清水用常規(guī)方法進(jìn)行絮凝沉淀，除去沉淀物，控制上清液的乳清蛋白的含量在4 5gL，每升上清液加入O. 5g I. 5g半胱氨酸，在22-40°C保溫靜置6 12h ;2)、在pH2 3、溫度40°C 55°C條件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500活力單位(U)的酸性蛋白酶，分2 3次加入，每次加酶后水解I 2. 5小時(shí)；3)、在pH2 3、35°C 45°C條件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500U的胃蛋白酶，分2 3次加入，每次加酶后水解I 2小時(shí)；4)、滅酶、離心、過濾、濃縮、干燥，得到大豆乳清多肽。所述的酸性蛋白酶可以是3. 350酸性蛋白酶或537酸性蛋白酶，優(yōu)選3. 350酸性蛋白酶。所述的大豆可以是黑豆、黃豆或青豆。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果I.在本發(fā)明水解乳清蛋白之前，加入半胱氨酸處理，目的是用半胱氨酸改變?nèi)榍宓胺肿觾?nèi)部的ニ硫鍵，使蛋白質(zhì)容易被進(jìn)ー步水解；此外，利用半胱氨酸具有的還原能力和特殊的理化性質(zhì)，當(dāng)其與乳清蛋白結(jié)合后，會(huì)使乳清蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而增強(qiáng)抗肝損傷和抗氧化活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的乳清蛋白熱處理相比，半胱氨酸處理能有效提高酶解效率，多肽得率能提高8% 17%，同時(shí)也能降低耗能，符合綠色節(jié)能的宗旨。2.先用酸性蛋白酶進(jìn)行一次水解，然后用胃蛋白酶進(jìn)行二次水解，這種復(fù)合酶水解，可以得到更多的小分子小黒豆乳清多肽。與用單酶水解和其他酶的復(fù)合水解相比，IOOODa以下小肽所占比例達(dá)到80%以上，且游離氨基酸含量少，抗氧化功能更強(qiáng)。
3.先分批加入酸性蛋白酶，然后分批加入胃蛋白酶所得的多肽與一次性加入蛋白酶水解相比，游離氨基酸含量明顯降低。4.體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，該多肽具有明顯的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和的作用，其總氧化性與Vc相近。動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該大豆乳清多肽不但具有保肝和預(yù)防化學(xué)性肝損傷的保健作用，而且還能起到延緩皮膚衰老、恢復(fù)皮膚彈性等美容效果。經(jīng)人體試食發(fā)現(xiàn)，該大豆乳清多肽ロ感好，沒有任何副作用。本發(fā)明制備的大豆乳清多肽既可以用于功能性食品和化妝品，也可以用于一般食品。


圖I小鼠肝組織切片H. E染色圖，其中A基礎(chǔ)組，B模型組，C多肽組
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I將黑豆乳清水經(jīng)過常規(guī)絮凝后，離心除去絮凝沉淀；除沉的乳清水冷藏待用。該乳清水中，乳清蛋白的含量為4. 16g/L。取500mL黑豆乳清水(即相當(dāng)于取2. 08g乳清蛋白)，加入O. 3g半胱氨酸，攪勻，22°C放置12h ;然后將pH調(diào)至2. 0，稱取93mg3. 350酸性蛋白酶(酶活力4. 47萬U/g)，先將1/3的酸性蛋白酶加入乳清水，置于45°C水浴中進(jìn)行恒溫水解，調(diào)pH，保持pH2 ;水解2h后再加入1/3的酸性蛋白酶，再水解2h后加入最后1/3的酸性蛋白酶，繼續(xù)水解2h ;將水浴鍋的溫度調(diào)至37°C，保持pH2不變，稱取I. 26g的胃蛋白酶(酶活カ為3300U/g)，先加入O. 42g的胃蛋白酶水解lh，再加入O. 42g的胃蛋白酶水解2h，最后加入O. 42g的胃蛋白酶水解2h ；水解結(jié)束后，沸水浴中滅酶8min ;水解液在4000r/min離心IOmin,過濾,濾液經(jīng)3000Da超濾膜分離、收集超濾濾出液進(jìn)行濃縮和噴霧干燥，得到大豆乳清多肽。經(jīng)分析，多肽得率為91. 153% ；Superdex G-25凝膠色譜分析計(jì)算得知，樣品中小于IOOODa的多肽含量在90%以上。該水解液采用鄰苯三酚-分光光度法和硫酸亞鐵_分光光度法等方法進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明，此產(chǎn)品對(duì)對(duì)羥自由基(·0Η)的清除率高達(dá)99. 743%，對(duì)超氧陰離子自由基(Of ·)的清除率達(dá)到56. 056%將該多肽按照9g/kg mb ·(!和3g/kg mb *d的劑量飼喂小鼠30天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑豆乳清多肽能顯著降低CCl4急性肝損傷小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活力(ρ〈0· 05)以及肝臟中丙ニ醛(MDA)的含量(ρ〈0· 01)和甘油三酯(TG)的含量(？〈0.01)，且能明顯升高肝臟中谷胱甘肽(GSH)的含量(ρ〈0.01)，其中以大劑量組的效果最佳，能起到保肝護(hù)肝的作用。數(shù)據(jù)見表I和表2。表I黑豆乳清多肽對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響(s±s)
權(quán)利要求
1.一種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)、將大豆乳清水用常規(guī)方法進(jìn)行絮凝沉淀，除去沉淀物，控制上清液的乳清蛋白的含量在4 5g/L，每升上清液加入0. 5g I. 5g半胱氨酸，在22-40°C保溫靜置6 12h ; 2)、在pH2 3、溫度40°C 55°C條件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500活力單位(U)的酸性蛋白酶，分2 3次加入，每次加酶后水解I 2. 5小時(shí)； 3)、在pH2 3、35°C 45°C條件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500U的胃蛋白酶，分2 3次加入，每次加酶后水解I 2小時(shí)； 4)、滅酶、離心、過濾、濃縮、干燥，得到大豆乳清多肽。
2.如權(quán)利要求I所述的一種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法，其特征在于，所述的酸性蛋白酶是3. 350酸性蛋白酶或537酸性蛋白酶。全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制備方法，步驟包括將大豆乳清廢水進(jìn)行絮凝處理除雜后，按每升乳清水加入0.5g～1.5g半胱氨酸，然后在pH2～3、溫度40℃～55℃條件下，以每克蛋白加入1000-2500活力單位的酸性蛋白酶，水解5h～7h；之后按1000-2500U/g加入胃蛋白酶，在35～45℃、pH2～3條件下，水解3h～5h；水解液經(jīng)滅酶、離心、過濾、濃縮與干燥得到大豆乳清多肽。動(dòng)物試驗(yàn)證明，本發(fā)明大豆乳清多肽具很強(qiáng)的抗氧化和抗急性肝損傷作用。該多肽中，1000Da以下的小分子低聚肽占80%以上。人群試食口感好，沒有副作用，可以作為普通營養(yǎng)和保健食品的原料。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102732591SQ20121024126
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者樊迎, 王常青 申請(qǐng)人:山西大學(xué)