專利名稱：一種水稻稻瘟病抗性基因RMg7或RMg8或RMg9及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種水稻稻瘟病抗性基因RMg7或RMg8或RMg9及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從第一個(gè)植物抗病基因Hml在1992年被Johal和Briggs從玉米中分離以來(Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)，到目前為止，已經(jīng)超過50個(gè)植物抗病基因從不同的植物中得以克隆和分離，其中主要類型的抗病基因?yàn)镹BS-LRR結(jié)構(gòu)類型(Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat,即核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)蛋白)的抗病基因；另外還有少部分抗病基因主要為eLRR-TM-pkinase、eLRR-TM、STK等類型。這些抗病基因分別編碼對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌、卵菌、甚至線蟲和昆蟲等的抗性蛋白。
由于植物病害每年給農(nóng)、林生產(chǎn)帶來巨大的損失，合理有效地防治植物病害是保障農(nóng)、林可持續(xù)發(fā)展所必須解決的關(guān)鍵問題之一。大量實(shí)踐證明，開發(fā)和利用已有的植物抗病種質(zhì)資源是防治植物病害的最為有效的方法之一(Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)。傳統(tǒng)的抗病品種培育，通常是將優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種與抗病性強(qiáng)的材料雜交，然后通過不斷的回交選育，最后得到抗病且優(yōu)質(zhì)的新品種。盡管這一方法十分有效，但極其耗時(shí)，當(dāng)新品種培育出來之后，可能對(duì)病原囷新進(jìn)化廣生的株系或小種表現(xiàn)為感病(Tanksley etal. 2007);經(jīng)典的圖位克隆方法利用抗病和感病的品種雜交，然后對(duì)大量的分離后代接種病菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，最后在精確遺傳定位的基礎(chǔ)上進(jìn)行克隆。這種方法取得了很好的效果，在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用(如抗白葉枯病基因Xa21的分離和利用，Song et al. 1995)，但因其周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、分離和等位性檢測(cè)較難等原因，不適合大量克隆抗病基因的需要。同時(shí)，因抗病基因獨(dú)特的遺傳方式，也使該方法的應(yīng)用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因?yàn)槔?，該類基因在基因組中通常成簇(genecluster)分布(Wang et al. 1999;Liu et al. 2002; Lin et al. 2007),在不同品種的同源染色體間的位置和結(jié)構(gòu)也多呈不對(duì)稱分布，等位關(guān)系不明確，拷貝數(shù)變異大(Yang etal. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。這些遺傳現(xiàn)象，大大增加了圖位克隆的難度，嚴(yán)重影響了抗病基因的克隆效率。近年來，隨著植物抗病及抗病相關(guān)基因分子水平研究的突破性的進(jìn)展，使我們對(duì)植物抗病及抗病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、功能、起源、變異及保存的認(rèn)識(shí)有了根本性的變化。即植物抗病基因，主要是ー類含有LRR結(jié)構(gòu)域的基因，其中又以NBS-LRR (核酸結(jié)合-富含亮氨酸)類型抗病基因?yàn)橹?。由于這些基因在結(jié)構(gòu)與功能上都具有高度的相似性，結(jié)合其獨(dú)特的遺傳與進(jìn)化特征，為快速的克隆與鑒定這些基因提供了便利，也為高效地利用抗病種質(zhì)資源提供了新的機(jī)遇。水稻iOryza sativa)是世界上最重要的糧食作物之一，同時(shí)也是我國(guó)最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到嚴(yán)重的病蟲害的侵?jǐn)_，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。其中，稻瘟病是分布最廣、危害水稻最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響到水稻的產(chǎn)量，全球毎年由稻痕病引起的水稻產(chǎn)量損失占11-30% (約合I. 57億美元,http://www. fungalgenomics.ncsu. edu)，直接威脅到稻農(nóng)增收和國(guó)家的糧食安全。無論在世界還是在我國(guó)，解決稻瘟病難題一直也是保障水稻持續(xù)生產(chǎn)的ー個(gè)優(yōu)先研究的課題。稻瘟病防治的最大困難之ー是病菌本身變異與分化速度快(凌忠專等，2004)。新的稻痕病菌生理小種層出不窮，已有的抗病基因(Plant disease resistance, R基因)很快喪失抗性，而尋■找新的抗病材料越來越難，水稻稻痕病對(duì)水稻生產(chǎn)的威脅也越來越大。對(duì)應(yīng)易變的病原菌，水稻必須擁有很多抗病基因。從已經(jīng)定位的70-80個(gè)基因位點(diǎn)來看，水稻抗稻瘟病基因數(shù)量眾多。但是，到目前為止已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因僅14個(gè)。雖然已經(jīng)定位的基因可以通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法加以利用，這ー選育過程繁瑣、耗時(shí)，當(dāng)新品種培育出來之后，可能對(duì)新產(chǎn)生的變異菌株表現(xiàn)為感病，克隆并直接轉(zhuǎn)化抗病基因可能是最直接有效的培育抗病品種的途徑。在這樣的背景下，使用新的思路，研究開發(fā)出能夠抗稻瘟病基因的新技術(shù)，就顯得尤為重要并且具有難以估量的價(jià)值。、
本發(fā)明就是采用一種高效、快速的抗病基因的克隆方法，采用用生物信息學(xué)方法篩選潛在的抗病基因，并利用分子生物學(xué)技術(shù)大量、快速克隆候選抗病基因，最終在水稻中得到多個(gè)具有稻瘟病抗性的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離水稻高抗品種中的稻瘟病抗性基因RMg7，RMg8和RMg9及包含調(diào)控這三個(gè)基因的啟動(dòng)子的DNA片段。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述稻瘟病抗性基因RMg7，RMg8和RMg9所編碼的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供含有上述抗性基因的載體。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及克隆和鑒定ー種包含RMg7，RMg8和RMg9基因的DNA片段，這些基因編碼的蛋白能使水稻對(duì)稻瘟病菌所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。其中，所述片段分別如序列表SEQ ID NO: I, SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 7所示或者基本上相當(dāng)于SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID N0:1, SEQ IDN0:4和SEQ ID N0:7所示序列的亞片段。這些DNA序列都編碼ー種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:8所示。所分離、克隆的RMg7，RMg8和RMg9抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。他們的蛋白都包含兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域NBS和LRR區(qū)域，RMg7蛋白的N端具有明顯的CC結(jié)構(gòu)域，C-末端為20個(gè)LRR重復(fù)，RMg8蛋白的N端也為明顯的CC結(jié)構(gòu)域，C端為27個(gè)LRR重復(fù)，RMg9蛋白的C端為21個(gè)LRR重復(fù)。根據(jù)本發(fā)明提供的RMg7，RMg8和RMg9基因序列信息(SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過以下方法獲得與RMg7，RMg8和RMg9等同的基因(I)通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2)以RMg7，RMgS和RMg9基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)獲得；(3)根據(jù)RMg7，RMg8和RMg9基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲?。?4)在RMg7,RMg8和RMg9基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得該基因。本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因RMg7，RMg8和RMg9具有重要的應(yīng)用價(jià)值。將所述的RMg7，RMg8和RMg9基因序列用任何一種轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入水稻或其他植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對(duì)所述基因或其調(diào)控序列適當(dāng)修飾，也可以用其它啟動(dòng)子取代所述基因原有的啟動(dòng)子，從而拓寬抗譜或增強(qiáng)抗性。本發(fā)明具有如下有益效果將克隆的抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入感病的植物中，有助于獲得新的抗病植物?？寺〉目共』蚰茉诓煌奈锓N間轉(zhuǎn)移并利用，從而能夠克服傳統(tǒng)抗病育種中遠(yuǎn)緣雜交的困難。此外，可以用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗病基因，縮短育種周期。本發(fā)明還能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用上述DNA片段獲得的抗病轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子， 以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他植株。


圖I是本發(fā)明流程示意圖。圖IA :抗稻瘟病候選位點(diǎn)的確定；圖IB-E :抗稻瘟病基因的分離與克?。粓DIF-G :抗稻瘟病基因的遺傳轉(zhuǎn)化；圖IH :轉(zhuǎn)化體的鑒定。圖2為實(shí)施例一中稻瘟病抗性基因RMg7的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR檢測(cè)電泳圖，圖2A為CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道1_6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，泳道8為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物；圖2B為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1-6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道I為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，泳道8為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物；
圖3為實(shí)施例一中稻瘟病抗性基因RMg7的轉(zhuǎn)化植株的抗性鑒定圖，圖3A為對(duì)照植株新2號(hào)的抗性鑒定圖，圖3B為轉(zhuǎn)基因植株新2號(hào)的抗性鑒定 圖4為實(shí)施例二中稻瘟病抗性基因RMg8的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR檢測(cè)電泳圖，圖4A為CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道1_3及5_7為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道4為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物，泳道8為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；圖4B為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1-3及5-7為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道4為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物，泳道8為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；
圖5為實(shí)施例一中稻瘟病抗性基因RMg8的轉(zhuǎn)化植株的抗性鑒定圖，圖5A為對(duì)照植株新2號(hào)的抗性鑒定圖，圖5B為轉(zhuǎn)基因植株新2號(hào)的抗性鑒定 圖6為實(shí)施例三中稻瘟病抗性基因RMg9的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR檢測(cè)電泳圖，圖6A為CaMV 35S啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道1_5為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；圖6B為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1-5為轉(zhuǎn)化體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6為受體的非轉(zhuǎn)化體PCR產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；
圖7為實(shí)施例一中稻瘟病抗性基因RMg9的轉(zhuǎn)化植株的抗性鑒定圖，圖7A為對(duì)照植株臺(tái)北309的抗性鑒定圖，圖7B為轉(zhuǎn)基因植株臺(tái)北309的抗性鑒定具體實(shí)施例方式水稻抗稻痕病候選基因的確定以水稻全基因組測(cè)序品種93-11和日本晴為基礎(chǔ)，首先鑒定基因組中所有的NBS-LRR類型的抗病基因，在系統(tǒng)進(jìn)化樹的基礎(chǔ)上，我們隨機(jī)選取了 60個(gè)候選的抗稻瘟病基因位點(diǎn)，通過引物設(shè)計(jì)、在抗稻瘟病的水稻品種中進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因、抗性鑒定等過程，最后通過10個(gè)來源于中國(guó)大陸分布所有水稻主產(chǎn)區(qū)的稻瘟病菌系統(tǒng)鑒定，鑒定出3個(gè)具有特異性抗性的抗稻瘟病基因。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例一稻瘟病抗性基因RMg7 (0sllg37780_GM)的克隆及鑒定
1、抗稻瘟病候選位點(diǎn)RMg7的確定(1)多以基因家族和基因簇的形式存在，在日本晴和93-11中各有9和11個(gè)相近的拷貝；(2)在其LRR區(qū)域，特別是xxLxLxx區(qū)域具有較高的Ka/Ks值；
2、稻瘟病抗性基因RMg7的分離與克隆利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序品種日本晴(Nipponbare)和93-11為參考序列，設(shè)計(jì)引物(引物兩端皆帶有酶切位點(diǎn)AscI)。正向引物序列為SEQ ID NO: 10，反向引物序列為SEQ ID NOill0以抗病水稻品種Tet印，谷梅2號(hào)和Q2436為模板，利用長(zhǎng)片段PCR技術(shù)(Long-PCR)擴(kuò)增候選基因片段。PCR程序如下95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復(fù)性45秒，68°C延伸5. 5分鐘，共35個(gè)循環(huán)，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收。3、雙功能基礎(chǔ)載體的準(zhǔn)備將稀有酶切位點(diǎn)AscI導(dǎo)入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)BamHI和SalI之間，取代酶切位點(diǎn)XbaI，構(gòu)成基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300_AscI。4、候選抗性基因與基礎(chǔ)載體的連接用限制性內(nèi)切酶AscI，同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物與基礎(chǔ)載體質(zhì)粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300-AscI。5、候選抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化將攜有候選基因的雙功能載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將候選基因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號(hào)，TP309和Co39中。最后一共獲得20株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。6、PCR分子檢測(cè)以轉(zhuǎn)化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動(dòng)子的特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR反應(yīng)。潮霉素抗性基因的正向引物序列為SEQ ID N0:16，反向引物序列為SEQ ID NO: 17, CaMV35S啟動(dòng)子的正向引物序列為SEQ ID NO: 18，反向引物序列為 SEQ ID NO: 19。7、轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定選擇10個(gè)來源地不同，區(qū)別力好的獨(dú)立稻瘟病菌生理小種作為檢測(cè)的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照品種，篩選抗病性改變的轉(zhuǎn)化體?？剐澡b定結(jié)果顯示候選基因RMg7在普感品種新2號(hào)的遺傳背景下，對(duì)6個(gè)病原菌株都顯示不同程度的抗性，表明候選基因RMg7具有特異性抗性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg7的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析采用步移法對(duì)RMg7的DNA序列進(jìn)行了測(cè)序。RMg7基因DNA長(zhǎng)度為3967bp，含有3個(gè)開放讀碼框，2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。RMg7編碼的蛋白序列如SEQ ID N0:2所示。RMg7基因編碼I個(gè)由961個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽。利用COIL分析表明該蛋白多肽有CC (coiled-coil)結(jié)構(gòu)域。RMg7蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端為20個(gè)LRR重復(fù)。
實(shí)施例ニ 稻瘟病抗性基因RMg8 (0sl2g03080-Tetep)的克隆及鑒定 1、抗稻瘟病候選位點(diǎn)RMg8的確定(1)以單基因形式存在，在日本睛和93-11中各有I個(gè)拷貝；(2)在其LRR區(qū)域，特別是xxLxLxx區(qū)域具有較高的Ka/Ks值；
2、稻瘟病抗性基因RMgS的分離與克隆利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序品種日本睛(Nipponbare)和93-11為參考序列，設(shè)計(jì)引物(引物兩端皆帶有酶切位點(diǎn)AscI)。正向引物序列為SEQ ID NO: 12，反向引物序列為SEQ ID NO: 13。以抗病水稻品種Tetep,谷梅2號(hào)和Q2436為模板，利用長(zhǎng)片段PCR技術(shù)(Long-PCR)擴(kuò)增候選基因片段。PCR程序如下95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復(fù)性45秒，68°C延伸10. 5分鐘，共35個(gè)循環(huán)，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收。3、雙功能基礎(chǔ)載體的準(zhǔn)備將稀有酶切位點(diǎn)AscI導(dǎo)入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)BamHI和SalI之間，取代酶切位點(diǎn)XbaI，構(gòu)成基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300-AscI。4、候選抗性基因與基礎(chǔ)載體的連接用限制性內(nèi)切酶AscI，同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物與基礎(chǔ)載體質(zhì)粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300-AscI。5、候選抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化將攜有候選基因的雙功能載體導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將候選基因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號(hào)，TP309和Co39中。最后一共獲得20株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。6、PCR分子檢測(cè)以轉(zhuǎn)化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動(dòng)子的特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR反應(yīng)。潮霉素抗性基因的正向引物序列為SEQ ID N0:16，反向引物序列為SEQ ID NO: 17, CaMV35S啟動(dòng)子的正向引物序列為SEQ ID NO: 18，反向引物序列為 SEQ ID NO: 19。7、轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定選擇10個(gè)來源地不同，區(qū)別カ好的獨(dú)立稻瘟病菌生理小種作為檢測(cè)的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照品種，篩選抗病性改變的轉(zhuǎn)化體?？剐澡b定結(jié)果顯示候選基因RMgS在普感品種新2號(hào)的遺傳背景下，對(duì)4個(gè)病原菌株都顯示不同程度的抗性，表明候選基因RMgS具有特異性抗性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg8的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析采用步移法對(duì)RMg8的DNA序列進(jìn)行了測(cè)序。RMg8基因DNA長(zhǎng)度為5344bp，含有6個(gè)開放讀碼框，5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子。RMg8編碼的蛋白序列如SEQ ID N0:5所示。RMg8基因編碼I個(gè)由1128個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽。利用COIL分析表明該蛋白多肽有CC (coiled-coil)結(jié)構(gòu)域。RMg8蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端為27個(gè)LRR重復(fù)。
實(shí)施例三稻瘟病抗性基因RMg9 (0s06g06390-GM)的克隆及鑒定
I、抗稻瘟病候選位點(diǎn)RMg9的確定(1)多以基因家族和基因簇的形式存在，在日本睛和93-11中各有2個(gè)相近的拷貝；(2)在其LRR區(qū)域，特別是xxLxLxx區(qū)域具有較高的Ka/Ks值；2、稻瘟病抗性基因RMg9的分離與克隆利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序品種日本晴(Nipponbare)和93-11為參考序列，設(shè)計(jì)引物(引物兩端皆帶有酶切位點(diǎn)AscI)。正向引物序列為SEQ ID NO: 14，反向引物序列為SEQ ID N0:15。以抗病水稻品種Tet印，谷梅2號(hào)和Q2436為模板，利用長(zhǎng)片段PCR技術(shù)(Long-PCR)擴(kuò)增候選基因片段。PCR程序如下95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復(fù)性45秒，68°C延伸7. 5分鐘，共35個(gè)循環(huán)，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化。3、雙功能基礎(chǔ)載體的準(zhǔn)備將稀有酶切位點(diǎn)AscI導(dǎo)入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)BamHI和SalI之間，取代酶切位點(diǎn)XbaI，構(gòu)成基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300_AscI。4、候選抗性基因與基礎(chǔ)載體的連接用限制性內(nèi)切酶AscI，同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物與基礎(chǔ)載體質(zhì)粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300-AscI。
5、候選抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化將攜有候選基因的雙功能載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將候選基因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號(hào)，TP309和Co39中。最后一共獲得20株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。6、PCR分子檢測(cè)以轉(zhuǎn)化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動(dòng)子的特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR反應(yīng)。潮霉素抗性基因的正向引物序列為SEQ ID N0:16，反向引物序列為SEQ ID NO: 17, CaMV35S啟動(dòng)子的正向引物序列為SEQ ID NO: 18，反向引物序列為 SEQ ID NO: 19。7、轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定選擇10個(gè)來源地不同，區(qū)別力好的獨(dú)立稻瘟病菌生理小種作為檢測(cè)的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照品種，篩選抗病性改變的轉(zhuǎn)化體。抗性鑒定結(jié)果顯示候選基因RMg9在普感品種臺(tái)北309的遺傳背景下，對(duì)4個(gè)病原菌株都顯示不同程度的抗性，表明候選基因RMg9具有特異性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg9的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析采用步移法對(duì)RMg9的DNA序列進(jìn)行了測(cè)序。RMg9基因DNA長(zhǎng)度為3866bp，含有2個(gè)開放讀碼框，I 一個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子。RMg9編碼的蛋白序列如SEQ ID N0:8所示。RMg9基因編碼I個(gè)由989個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽。RMg9蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端為21個(gè)LRR重復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種水稻抗稻瘟病基因RMg7或RMg8或RMg9，其核苷酸序列為SEQ ID NO: I或SEQID N0:4或SEQ ID NO: 7所示、或基本上相當(dāng)于SEQ ID NO: I 或SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 7所示的DNA序列、或其功能相當(dāng)于SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7所示序列的亞片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述水稻抗稻瘟病基因RMg7或RMg8或RMg9所編碼的蛋白，其氨基酸序列分別為SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:8所示，或該序列替換、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述水稻抗稻瘟病基因RMg7或RMg8或RMg9，其特征是含有調(diào)控RMg7或RMg8或RMg9的啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:6或SEQ IDNO:9所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述水稻抗稻瘟病基因RMg7或RMg8或RMg9，其特征是含有RMg7 或RMg8或RMg9基因的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述含有RMg7或RMg8或RMg9基因的載體，其特征是含有RMg7或RMg8或RMg9基因的載體所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RMg7或RMg8或RMg9所編碼的蛋白，其特征是RMg7或RMg8或RMg9所編碼的蛋白在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因RMg7或RMg8或RMg9及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了水稻稻瘟病新抗性基因RMg7、RMg8和RMg9的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。這三個(gè)基因都屬于NBS-LRR類型抗病基因家族的成員。本發(fā)明中的三個(gè)抗稻瘟病基因均克隆至對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)出高抗的水稻品系，并將其轉(zhuǎn)化至對(duì)稻瘟病菌感病的品種中，利用稻瘟病菌侵染的方法對(duì)其抗病能力進(jìn)行評(píng)估，從而最終確定該三個(gè)基因?qū)Φ疚敛【哂锌剐浴?br> 文檔編號(hào)C12N15/63GK102732531SQ20121018228
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者仲巖, 張小輝, 楊四海, 田大成 申請(qǐng)人:南京大學(xué)