專(zhuān)利名稱(chēng)：醛化鵝新鮮紅細(xì)胞及其在無(wú)細(xì)胞百日咳ha試驗(yàn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)細(xì)胞百日咳檢測(cè)工藝方法，對(duì)無(wú)細(xì)胞百日咳血凝實(shí)驗(yàn)HA (某此病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱(chēng)為血凝試驗(yàn)HA)中所采用的鵝新鮮紅細(xì)胞進(jìn)行戊二醛化，以改進(jìn)鵝新鮮紅細(xì)胞質(zhì)脆易碎、保質(zhì)期短的問(wèn)題，與鵝新鮮紅細(xì)胞相比，保質(zhì)期從7天左右提高到90天，減少了采集鵝血的頻率，降低了工作強(qiáng)度。
背景技術(shù)：
百日咳(pertussis, whooping cough)是一種兒童急性呼吸道傳染病，典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，可持續(xù)幾個(gè)月，如無(wú)并發(fā)癥出現(xiàn)，一般無(wú)高熱或有輕度發(fā)熱。本病最重要的并發(fā)癥是繼發(fā)感染，癲癇發(fā)作，腦病和死亡。百日咳在發(fā)病初期傳染力極強(qiáng)，不易診斷，因此進(jìn)行疫苗接種是預(yù)防和控制百日咳最經(jīng)濟(jì)最有效的手段。目前市場(chǎng)上的百日咳疫苗主要有全菌體百日咳疫苗和無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗兩種，后者免疫效果好且副作用低，因此被廣泛使用。在無(wú)細(xì)胞百日咳發(fā)酵培養(yǎng)中，常用的檢測(cè)方法是HA試驗(yàn)(在微量凝集板上，每孔加人生理鹽水50 u L，然后第I孔加入百日咳菌液50 u L，混勻.依次倍比稀釋至第10孔，同時(shí)另作生理鹽水對(duì)照，之后每孔各加人50 UL 1%新鮮紅細(xì)胞懸液。同時(shí)振蕩Imin混勻，室溫下靜置15min后觀察結(jié)果)。在HA試驗(yàn)中，需要使用的1%鵝新鮮紅細(xì)胞存在質(zhì)脆易碎，保存期短的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種醛化鵝新鮮紅細(xì)胞及其制備方法和醛化鵝新鮮紅細(xì)胞在無(wú)細(xì)胞百日咳HA試驗(yàn)中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞是按以下方法制得的產(chǎn)物步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機(jī)1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆?；步驟二 取鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加入經(jīng)4°C預(yù)冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應(yīng)40min后取出，得到鵝新鮮紅細(xì)胞濃度為
2.5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液；步驟三將濃度為2. 5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。本發(fā)明提供的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟
步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機(jī)1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆?；步驟二 取鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加 入經(jīng)4°C預(yù)冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應(yīng)40min后取出，得到鵝新鮮紅細(xì)胞濃度為
2.5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液；步驟三將濃度為2. 5% (體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液，此醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液置于4 °C冰箱中放置保存,有效期為90天；上述制備方法步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。本發(fā)明提供的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞可用于無(wú)細(xì)胞百日咳HA試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)資料I、采血用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝IOmL生理鹽水的離心管中混勻。2、分離鵝紅細(xì)胞將離心管中的血液經(jīng)離心機(jī)4°C，1500 2000 r/min離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜。從沉淀物加入生理鹽水至離心移去上清液，此過(guò)程重復(fù)2次。最后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆谩?、制備醛化鵝新鮮紅細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法進(jìn)行醛化。第一種方法取沉淀鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加入4°C預(yù)冷的I. 25_5%戊二醛溶液40ml,迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌4(T60min,反應(yīng)結(jié)束后，離心洗漆三次，沉淀加生理鹽水得到醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。第二種方法用生理鹽水配成5%鵝新鮮紅細(xì)胞懸液15mL，緩慢加入I. 25_5%戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌4-6h，反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌三次，沉淀加生理鹽水得到醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇一種醛化鵝紅細(xì)胞的方法，為無(wú)細(xì)胞百日咳的HA試驗(yàn)提供有效的試驗(yàn)試劑,使試驗(yàn)效果更加準(zhǔn)確。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)從醛化鵝新鮮紅細(xì)胞制備方法、工作濃度、保存時(shí)間三個(gè)方面進(jìn)行了研究，最終確定上述第一種醛化方法優(yōu)于第二種醛化方法，第一種醛化方法的具體條件為
I.25%戊二醛醛化40min，醛化鵝新鮮紅細(xì)胞工作濃度為0. 8%，用于無(wú)細(xì)胞百日咳的HA試驗(yàn)，取得與用0. 8%新鮮鵝紅細(xì)胞一致的試驗(yàn)結(jié)果，但本發(fā)明以醛化鵝新鮮紅細(xì)胞取代新鮮鵝紅細(xì)胞后，使鵝紅細(xì)胞保存期變長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的鵝新鮮紅細(xì)胞質(zhì)脆易碎，保存期短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例I用前述的第一種醛化鵝新鮮紅細(xì)胞方法制備醛化鵝新鮮紅細(xì)胞醛化鵝新鮮紅細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機(jī)1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生 理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水10mL，混合均勻，再經(jīng)1500 2000r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆?；步驟二 取沉淀鵝紅細(xì)胞lmL，緩慢加入4°C預(yù)冷的I. 25-5%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應(yīng)40min后取出20mL混合液，得到醛化40min的醛化鵝紅細(xì)胞懸液。反應(yīng)60min后取出20mL混合液，得到醛化60min的醛化鵝紅細(xì)胞懸液。步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液，此醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液置于4°C冰箱中放置保存，有效期為90天；步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。實(shí)施例2用前述的第二種醛化鵝新鮮紅細(xì)胞方法制備醛化鵝新鮮紅細(xì)胞步驟一同實(shí)施例I步驟二 5%鵝紅細(xì)胞懸液15mL緩慢加入2. 5%戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌lh，取4mL，用生理鹽水洗滌5次，每次2000 r / min,離心10min，棄去上清液，配成5%的懸液.4°C保存?zhèn)溆?，得到醛化Ih的醛化鵝紅細(xì)胞。剩余溶液繼續(xù)分別攪拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗滌，配成0.8%的懸液，4°C保存?zhèn)溆?。分別得到醛化2h、5h、6h的醛化鵝紅細(xì)胞。實(shí)施例3無(wú)細(xì)胞百日咳的HA試驗(yàn)用實(shí)施例I制備的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞、用實(shí)施例2制備的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞以及用屬于現(xiàn)有技術(shù)的0. 8%新鮮鵝紅細(xì)胞懸液分別進(jìn)行無(wú)細(xì)胞百日咳的HA試驗(yàn)主要物料和設(shè)備百日咳球桿菌(本科室大罐培養(yǎng))，健康鵝血，25%戊二醛，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf),電子天平(梅特勒),96孔板。具體過(guò)程
醛化鵝新鮮紅細(xì)胞的制備及最佳醛化時(shí)間確定第一種醛化方法取沉淀鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加入4°C預(yù)冷的I. 25_5%戊二醛溶液40mL,迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌,反應(yīng)40min后取出20mL混合液，得到醒化40min的醒化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。反應(yīng)60min后取出20mL混合液,得到醒化60min的醛化鵝紅細(xì)胞懸液。兩種2. 5%鵝紅細(xì)胞濃度的醛化紅細(xì)胞懸液分別稀釋得到0. 8%鵝紅細(xì)胞濃度的醛化鵝細(xì)胞懸液。第二種醛化方法5%鵝紅細(xì)胞懸液15mL緩慢加入2. 5 %戊二醛生理鹽水溶液15mL，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌lh，取4mL，用生理鹽水洗滌5次，每次2000 r / min，離心10 min，棄去上清液，配成5%的懸液.4°C保存?zhèn)溆?，得到醛化Ih的醛化鵝紅細(xì)胞。剩余溶液繼續(xù)分別攪拌2 h、5h和6h，按照上述方法，取出部分洗滌，配成0. 8%的懸液，4°C保存?zhèn)溆谩７謩e得到醛化2h、5h、6h的醛化鵝紅細(xì)胞。兩種方法同時(shí)用0. 8%鵝新鮮紅細(xì)胞懸液做對(duì)照，用三批大罐培養(yǎng)百日咳桿菌菌液(批號(hào)分別為:201111Z088-YD2; 201111Z090-YD2; 201111Z092-YD2)重復(fù)做血凝試驗(yàn)，評(píng)價(jià)出最優(yōu)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞時(shí)間。醛化鵝紅細(xì)胞的優(yōu)化試驗(yàn)溶血性觀察將新鮮鵝紅細(xì)胞懸液與醛化后的鵝紅細(xì)胞懸液分別放置4°C保存，每日觀察并記錄鵝紅細(xì)胞保存期內(nèi)的溶血現(xiàn)象。 不同戊二醛濃度醛化鵝紅細(xì)胞及不同醛化鵝細(xì)胞濃度的血凝試驗(yàn)對(duì)比將25%的戊二醛溶液分別1:4 ;1:9 ;1:19稀釋成5%、2. 5%、1. 25%濃度戊二醛生理鹽水溶液三份。第一種醛化方法分別取ImL沉淀鵝紅細(xì)胞3份，分別加入到40mL5%、2. 5%、I. 25%濃度戊二醛溶液中反應(yīng)，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，醛化反應(yīng)時(shí)間按最佳醛化時(shí)間進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，離心洗滌三次，沉淀加生理鹽水分別配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鵝紅細(xì)胞濃度的醛化鵝細(xì)胞懸液。第二種醛化方法5%、2. 5%、I. 25%濃度戊二醛生理鹽水溶液各40mL分別緩慢加入到40mL5%細(xì)胞濃度的紅細(xì)胞中反應(yīng)，醛化反應(yīng)時(shí)間按最佳醛化時(shí)間進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，離心洗滌三次，沉淀醛化紅細(xì)胞分別配制成2%，I. 67%，1%，0. 8%鵝紅細(xì)胞濃度的懸液，兩種方法同時(shí)用0.8%新鮮鵝紅細(xì)胞懸液做對(duì)照，用三批大罐培養(yǎng)百日咳桿菌菌液(批號(hào)分別為201111Z088-YD2; 201111Z090_YD2; 201111Z092_YD2)重復(fù)做血凝試驗(yàn).評(píng)價(jià)出最優(yōu)的戊二醛反應(yīng)濃度及醛化細(xì)胞工作濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、溶血性觀察結(jié)果將新鮮鵝紅細(xì)胞于4°C條件下放置保存，7d出現(xiàn)部分溶血.第IOd已經(jīng)全部溶血，而醛化鵝紅細(xì)胞不出現(xiàn)溶血，性質(zhì)不變。在醛化紅細(xì)胞保存的90天中，戊二醛醛化的鵝紅細(xì)胞均不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。2、最佳醒化時(shí)間確定表I第一種醛化方法醛化鵝紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果(操作完成后20min后觀察)
權(quán)利要求
1.醛化鵝新鮮紅細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟 步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機(jī)1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆茫? 步驟二 取鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加入經(jīng)4°C預(yù)冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應(yīng)40min后取出，得到鵝新鮮紅細(xì)胞濃度為2. 5%(體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液； 步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟二中所述的I. 25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。
3.—種醛化鵝新鮮紅細(xì)胞，其特征在于按以下方法制得的產(chǎn)物 步驟一用注射器吸取鵝靜脈血約2 6mL，放入裝有IOmL生理鹽水的離心管中混勻，離心機(jī)1500 2000 r/min 4°C，離心8分鐘，棄上清液，得沉淀物；沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，得沉淀物，沉淀物加入生理鹽水IOmL,混合均勻，再經(jīng)1500 2000 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜后得到的沉淀物即為鵝新鮮紅細(xì)胞，將所得鵝新鮮紅細(xì)胞于4°C保存?zhèn)溆茫? 步驟二 取鵝新鮮紅細(xì)胞lmL，緩慢加入經(jīng)4°C預(yù)冷的I. 25%戊二醛溶液40mL，迅速搖勻，置于4°C冰箱中用磁力攪拌器攪拌，反應(yīng)40min后取出，得到鵝新鮮紅細(xì)胞濃度為2. 5%(體積比mL / mL)的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液； 步驟三將濃度為2. 5%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋到濃度為0. 8%的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要3所述的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞，其特征在于，步驟二中所述的I.25%戊二醛溶液是按以下方法配制成的溶液將25%戊二醛用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成I. 25%戊二醛溶液，置于4°C冰箱中備用。
5.權(quán)利要求I或2所述的方法制備的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞在無(wú)細(xì)胞百日咳HA試驗(yàn)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的醛化鵝新鮮紅細(xì)胞在無(wú)細(xì)胞百日咳HA試驗(yàn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種醛化鵝新鮮紅細(xì)胞及其制備方法和醛化鵝新鮮紅細(xì)胞在無(wú)細(xì)胞百日咳HA試驗(yàn)中的應(yīng)用。本發(fā)明醛化鵝紅細(xì)胞方法的具體條件為1.25%戊二醛醛化40min，醛化鵝紅細(xì)胞工作濃度為0.8%，用于無(wú)細(xì)胞百日咳的HA試驗(yàn)，取得與0.8%新鮮鵝紅細(xì)胞一致的試驗(yàn)結(jié)果，但以醛化鵝紅細(xì)胞取代新鮮鵝紅細(xì)胞后，鵝紅細(xì)胞保存期變長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定，克服了現(xiàn)有技術(shù)需要使用的1%鵝新鮮紅細(xì)胞存在的質(zhì)脆易碎，保存期短的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102703386SQ20121017780
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者朱紅偉, 李新國(guó), 胡業(yè)勤, 薛紅剛, 趙偉, 項(xiàng)美娟 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司