專利名稱：糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其制備與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谠\斷和臨床預(yù)后評(píng)價(jià)中相關(guān)基因多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒，以及該試劑盒制備和在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谠\斷和臨床預(yù)后評(píng)價(jià)中的用途。本發(fā)明涉及的糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)位點(diǎn)，23個(gè)SNP位點(diǎn)突變或其中幾個(gè)突變可診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變以及評(píng)價(jià)該患者的臨床預(yù)后狀況。
背景技術(shù)：
目前,糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是ー種世界范圍內(nèi)主要的致盲性眼病，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。目前僅能通過(guò)詢問(wèn)臨床病史、觀察患者是否具有典型的DR臨床表現(xiàn)確診。對(duì)于臨床表型不典型的DR、潛在DR的糖尿病患者，以及發(fā)病初期的DR患者，由于缺乏基礎(chǔ) 臨床表現(xiàn)而難以在做出準(zhǔn)確診斷。糖尿病視網(wǎng)膜病變是ー個(gè)多基因、多階段疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前公認(rèn)的學(xué)說(shuō)有醛糖還原酶途徑、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒張性前列腺素產(chǎn)物、視網(wǎng)膜生長(zhǎng)因子產(chǎn)生、視網(wǎng)膜毛細(xì)血管血流改變等，整個(gè)病理過(guò)程涉及代謝酶、炎癥、細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及離子通道等相關(guān)基因的變化[Radha V, Rema M, Mohan V, et al. Genes anddiabetic retinopathy. Indian J Ophthalmol 2002 ；50 (I) :5_11.]?；蚨鄳B(tài)性是指人類基因組中同一位置的基因或DNA序列具有不同類型，在人群中具有一定的分布頻率。在基因組中，不同個(gè)體DNA序列上的單個(gè)堿基的差異稱為單核苷酸多態(tài)性。近年來(lái)，隨著基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究不斷深入和擴(kuò)展，已經(jīng)篩選出可能與之相關(guān)的數(shù)十種基因。目前，還沒(méi)有專門針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)的成熟產(chǎn)品和方法。本發(fā)明針對(duì)世界范圍內(nèi)已報(bào)道的糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性，發(fā)明了檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變23個(gè)相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒產(chǎn)品及其制備方法，其中分別為脂肪炎癥因子的6個(gè)SNP位點(diǎn)、血管緊張素II I型受體相關(guān)受體的5個(gè)SNP位點(diǎn)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的12個(gè)SNP位點(diǎn)，可以快速、有效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)出23個(gè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷和臨床預(yù)后提供有價(jià)值的指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
糖尿病視網(wǎng)膜病變是個(gè)多基因疾病，整個(gè)發(fā)病過(guò)程中涉及代謝酶、炎癥、細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及離子通道等相關(guān)基因的變化，這些遺傳基因多態(tài)性與DR的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)。本發(fā)明遴選出與糖尿病視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)的23個(gè)關(guān)鍵的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中分別為脂肪炎癥因子的6個(gè)SNP位點(diǎn)、血管緊張素II I型受體相關(guān)受體的5個(gè)SNP位點(diǎn)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的12個(gè)SNP位點(diǎn)，通過(guò)提取基因組DNA并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及測(cè)序檢測(cè)SNP位點(diǎn)突變狀況，早期診斷和臨床預(yù)后評(píng)價(jià)糖尿病視網(wǎng)膜病變。本發(fā)明涉及ー種快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)多重PCR預(yù)擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。本發(fā)明涉及快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，包括與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)SNP位點(diǎn)多重PCR預(yù)擴(kuò)增引物，其序列如下
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)SNP位點(diǎn)多重PCR預(yù)擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物；其中，所述的與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)SNP位點(diǎn)多重PCR預(yù)擴(kuò)增引物的序列如下序號(hào)位點(diǎn)名稱擴(kuò)增引物名稱擴(kuò)增引物序列
2.一種快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，其包括 人外周血基因組DNA提取液、多重PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑、PCR產(chǎn)物單堿基延伸反應(yīng)液和延伸產(chǎn)物純化試劑； 其中，人外周血基因組DNA提取液包括去離子水，6M NaI，氯仿/異戊醇混合液，異丙醇和無(wú)水乙醇； PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)液包括10 X PCR緩沖液，2U-5U的Taq酶，O. 2 I. OmM的dNTPs，權(quán)利要求I所述的1-11SNP位點(diǎn)的預(yù)擴(kuò)增引物混合物，以及權(quán)利要求I所述的12-23SNP位點(diǎn)的預(yù)擴(kuò)增引物混合物，該兩種預(yù)擴(kuò)增引物混合物的用量分別都為O. 2 μ mol ; 陰性對(duì)照為去離子水； 陽(yáng)性對(duì)照為已知基因型人基因組DNA樣品； 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑為蝦堿性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI ； PCR產(chǎn)物單堿基延伸反應(yīng)液包括5 μ I預(yù)反應(yīng)混合液、權(quán)利要求I所述的1-11SNP位點(diǎn)的預(yù)擴(kuò)增引物相對(duì)應(yīng)的的11個(gè)延伸引物，與權(quán)利要求I所述的12-23SNP位點(diǎn)的預(yù)擴(kuò)增引物相對(duì)應(yīng)的的11個(gè)延伸引物混合物，上述兩種延伸引物混合物的用量分別都為O. 2 μ mol ；延伸產(chǎn)物純化試劑為6 μ I的堿性磷酸酶CIP。
3.—種如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，其使用步驟如下 步驟一，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血樣本23個(gè)SNP位點(diǎn)PCR預(yù)擴(kuò)增 取來(lái)自糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血10ml，按外周血基因組DNA抽提純化的方法抽提患者外周血中基因組DNA，取2μ I用IXTAE緩沖液加熱溶解的I %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA質(zhì)量，所述百分比為m/v ； 獲取的糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血樣本基因組DNA模板后，提取的基因組DNA為多重PCR預(yù)擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，目的富集延伸模板； PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件如下 DPCR反應(yīng)體系如下
4.一種如權(quán)利要求1-3所述的快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒的制備方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)基因多態(tài)性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了快速檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其包括與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的23個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)多重PCR預(yù)擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物序列，以及人外周血基因組DNA提取液、多重PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑、PCR產(chǎn)物單堿基延伸反應(yīng)液和延伸產(chǎn)物純化試劑；本發(fā)明還提供一種該試劑盒的制備方法，采用敏感性及特異性均較高的基因測(cè)序法檢測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的SNP位點(diǎn)，可以快速、有效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)出23個(gè)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷和臨床預(yù)后提供參考。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851358SQ20121014878
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者曾沃坦, 焦劍, 金文俊, 梁辰, 陳初光 申請(qǐng)人:益百尚(北京)生物技術(shù)有限責(zé)任公司