專利名稱：快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠從細(xì)菌發(fā)酵液中去除污染物，純化莢膜多糖的方法。
背景技術(shù)：
肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌是威脅人類生命的重要致病菌。開發(fā)疫苗來預(yù)防這些病菌的感染是醫(yī)學(xué)界多年奮斗的目標(biāo)。自上世紀(jì)60年代，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌有ー個(gè)共同的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，就是細(xì)胞膜表面包裹著ー層莢膜，這層莢膜是由多糖包裹在細(xì)菌細(xì)胞膜表面形成，故稱莢膜多糖。在人體內(nèi)，莢膜對(duì)于這些細(xì)菌致病性起著決定性作用，因?yàn)?，通過防止抗體吸附到細(xì)菌膜上，莢膜能夠干擾免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬作用，使得細(xì)菌能夠在體內(nèi)繁殖而致病。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌莢膜多糖作為疫苗具有很好的免疫原性，可以刺激具有健全的免疫功能的成人產(chǎn)生抗體來抵抗具有莢膜多糖細(xì)菌的感染；但是，由于2歲以下兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對(duì)莢膜多糖沒有免疫應(yīng)答，而這一人群是受這些致病菌威脅最為嚴(yán)重人群，開發(fā)能夠保護(hù)這一人群的疫苗是醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)課題。自上世紀(jì)80年代，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莢膜多糖以共價(jià)鍵和蛋白質(zhì)結(jié)合，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素或者CRM197 (變異白喉無毒毒素)后，形成多糖-蛋白結(jié)合疫苗，可在2歲以下嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)于莢膜多糖的免疫應(yīng)答反應(yīng)，自此，一種以細(xì)菌莢膜多糖接至蛋白載體的合成疫苗誕生。目前，在市場上用于預(yù)防成年人肺炎球菌球菌感染的有23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗，以及預(yù)防兒童的7價(jià)、10價(jià)和13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗在全球范圍廣泛使用。另外，傷寒(vi)多糖疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗、4價(jià)流行性腦膜炎多糖結(jié)合疫苗也已經(jīng)應(yīng)用多年。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，不同的細(xì)菌具有不同的莢膜多糖，而同一種細(xì)菌不同血清型細(xì)菌也有不同的莢膜多糖，如肺炎球菌有90種不同血清型，腦膜炎球菌有A、B、C、W135和Y群，它們都具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的莢膜多糖。研究發(fā)現(xiàn)，每種莢膜多糖具有嚴(yán)格的重復(fù)性化學(xué)結(jié)構(gòu)，這個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)可由一個(gè)單糖単位或含有最多達(dá)7-8單糖殘基組成的寡聚糖組成。這種重復(fù)性単位可為線性或含有非碳水化合物取代基團(tuán)的分叉結(jié)構(gòu)，這些非碳水化合物取代基團(tuán)可為0-こ?；?0-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)；另外，肺炎球菌一些莢膜多糖可能含有不常見的單糖殘基，如ニ氨基(diamino-)，脫氧和分叉鏈糖等。這種細(xì)菌多糖結(jié)構(gòu)的多祥性，給純化這些多糖方法帶來了挑戰(zhàn)和困難。用莢膜多糖來制備疫苗，包括多糖疫苗或多糖結(jié)合疫苗，都需要用符合一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的莢膜多糖作為原料來制備。為了獲得高純度的莢膜多糖，可用富有營養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)液來發(fā)酵細(xì)菌，進(jìn)而從發(fā)酵液中純化莢膜多糖，純化過程中要去除的主要污染物包括細(xì)菌蛋白，核酸和培養(yǎng)基成分，如果是制備肺炎球菌莢膜多糖時(shí)，還需要控制C-多糖的污染。細(xì)菌莢膜多糖純化工藝的建立經(jīng)歷了多年的發(fā)展過程，傳統(tǒng)方法純化莢膜多糖過程中，去除多糖溶液中的核酸污染以達(dá)到疫苗制劑所需純度要求比較困難，由于不同細(xì)菌的莢膜多糖的化學(xué)特性不同，每種細(xì)菌莢膜多糖需要用特殊方法來去除核酸污染，沒有一種方法能夠純化其它細(xì)菌的莢膜多糖。有些細(xì)菌莢膜多糖需要通過大量的こ醇來進(jìn)行沉淀，同時(shí)，要用不同的有機(jī)溶劑萃取，如こ醚等，來幫助純化。こ醇沉淀通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，并將其濃度降低至比較低的水平；但是，難以降低到用于注射用的疫苗要求的水平，包括采用有機(jī)溶劑氯仿和丁醇混合溶劑或者苯酚，和多糖溶液混合，震搖4-6小時(shí)，然后，用低速離心，聚集在水相和有機(jī)相之間的變性蛋白能夠與水相中的多糖分離。不過這種方法的缺點(diǎn)是在萃取過程中，多糖會(huì)被降解，斷裂或者失去其原始空間構(gòu)象，純化出來的多糖已經(jīng)不是有效的免疫原。由于不同細(xì)菌多糖結(jié)構(gòu)的多變性限制了這些分離方法的有效性。由此，得出結(jié)論是早期的傳統(tǒng)方法中沒有ー種方法能夠有效地純化不同細(xì)菌或者血清型細(xì)菌的莢膜多糖。盡管如此，有幾種純化出高純度和保存有其免疫原性的不同細(xì)菌莢膜多糖方法被發(fā)明，特別是在純化不同血清型肺炎球菌莢膜多糖時(shí)，這些方法能夠有效地純化出包括24 種血清型莢膜多糖，包括 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并用于配制23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的莢膜多糖原料。1980 年，美國 American Cyanamid Company 公司的專利 US4242501 闡述了一種純化肺炎球菌莢膜多糖方法，在這ー專利基礎(chǔ)上，隨后該公司又于1987年注冊(cè)了另一個(gè)專利US4686102，用以純化23個(gè)不同的血清型肺炎球菌莢膜多糖。該專利的基本エ藝途徑是肺炎球菌發(fā)酵后，加入脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)溶解細(xì)菌，將菌體上的莢膜多糖釋放至發(fā)酵液中，離心去除了細(xì)胞碎片后，用こ醇沉淀兩次，這ー步驟能夠去除包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的大量污染物；加入十六烷基三甲基溴化銨至こ醇沉淀后的多糖溶液，進(jìn)ー步去除污染物。通過控制十六烷基三甲基溴化銨濃度，能夠吸附沉淀大部分血清型多糖沉淀下來，這些沉淀多糖隨后能夠溶解于氯化鈉溶液中，離心去除那些不溶解的大分子污染物。不過，有四種血清型多糖不能夠和十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀，加入十六烷基三甲基溴化銨的作用是沉淀污染物，離心去除這些污染物。隨后，再加入こ醇以去除十六烷基三甲基溴化銨。離心去除沉淀后，加入活性炭吸附殘留的污染物，如蛋白和核酸。最后，通過透析獲得純化莢膜多糖。從エ藝過程可見，盡管該方法建立了ー個(gè)純肺炎球菌莢膜多糖的純化平臺(tái)，用同ー種方法能夠純化出不同血清型多糖，但是步驟繁雜，不宣掌握；其中還包括了多步こ醇沉淀、離心，費(fèi)時(shí)，設(shè)備費(fèi)用高昂；而且不宜擴(kuò)大生產(chǎn)。十六烷基三甲基溴化銨沉淀步驟技術(shù)復(fù)雜，不同血清型處理方法不同。另外，最終純化出來的多糖僅僅能夠滿足制備23價(jià)肺炎多糖疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即蛋白和核酸含量低于2% _7%，無法滿足現(xiàn)有的肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗對(duì)多糖原料中蛋白和核酸含量低于1%的質(zhì)量要求。至1998 年，美國 American Home Products 公司的專利 US5714354 提出了 一種無こ醇沉淀來純化肺炎球菌莢膜多糖的改進(jìn)方法。該方法是通過用十六烷基三甲基溴化銨來沉淀23種肺炎球菌血清型中的20個(gè)莢膜多糖，然后用活性炭過濾、羥基磷酸灰質(zhì)鹽(Hydroxyapatite)色譜法和陰離子交換色譜法來進(jìn)ー步分離多糖中的污染物,該純化工藝步驟能夠純化出大部分血清型莢膜多糖。而其它3個(gè)不能夠和十六烷基三甲基溴化銨沉淀的血清型(血清型7F、14和33F)的純化，是采用修飾方法來進(jìn)行純化，包括陰離子交換樹脂色譜法。和前一專利純化工藝比較，這ー純化工藝能夠節(jié)省75%純化時(shí)間，費(fèi)用也降低，不需要特殊設(shè)備。該方法純化出來的所有23個(gè)血清型莢膜多糖的質(zhì)量達(dá)到多糖疫苗的質(zhì)量指標(biāo)。同在1998年，美國Merck公司的專利US5847112也發(fā)布ー種純化肺炎莢膜多糖的方法?；痉椒橛盲炒紒矸謨刹綇陌l(fā)酵破菌液中分離多糖；第一步是用低百分比的こ醇來沉淀細(xì)胞碎片和污染物，如C-多糖，保留多糖于溶液中；接下來，加入高濃度的こ醇來沉淀莢膜多糖，將留在溶液中的其它污染物丟棄。將沉淀多糖溶解后，再用常規(guī)方法，比如核酸和蛋白酶消化，或者有機(jī)溶剤，進(jìn)ー步來去除污染的蛋白和核酸，凍干后獲得粗制多糖。隨后，通過陰離子交換色譜純化獲得精制的全多糖或者部分水解多糖。用以上兩種方法純化出來的多糖盡管能夠達(dá)到較高的純度標(biāo)準(zhǔn)，但是，步驟仍然繁雜，エ藝條件控制要求高，特別是多步驟的沉淀分離步驟耗時(shí)長。美國Wyeth公司的專利US20060228381提出了ー種更加簡潔的純化肺炎球菌莢膜多糖的方法?；就緩绞怯枚诡惻囵B(yǎng)基發(fā)酵肺炎球菌后，加入脫氧膽酸鈉來溶解菌體，然后加酸調(diào)節(jié)溶液PH至5. 5以下來沉淀脫氧膽酸鈉和大部分可溶性蛋白，通過離心過濾和超濾 去除溶液中的細(xì)胞碎片和沉淀物。由此獲得的粗制多糖仍然需要傳統(tǒng)方法進(jìn)ー步純化，包括用活性炭過濾、羥基磷灰石柱吸附殘留的雜質(zhì)，以及超濾洗濾來獲得精制多糖。這樣純化方法的特點(diǎn)在于通過酸化破菌發(fā)酵液這ー步來將大部分的污染物，如蛋白、核酸、內(nèi)毒素等，和溶液中的莢膜多糖分離，簡化了后續(xù)エ藝，縮短了純化時(shí)間。但是，由于是使用的用脫氧膽酸鈉溶菌液來進(jìn)行純化，有些血清型的細(xì)胞壁中含有的C-多糖被釋放出來，由于C-多糖和英膜多糖的化學(xué)特性相似，不易在后續(xù)的純化工藝中被去除，造成了純化多糖中C-多糖含量過高。本發(fā)明通過總結(jié)了現(xiàn)有的細(xì)菌莢膜多糖的純化方法，提出了一種更為快速的純化方法，所獲得的純化莢膜多糖的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)都達(dá)到了現(xiàn)有的WHO質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，它能從指定細(xì)菌發(fā)酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留純化的莢膜多糖溶液，包括如下步驟步驟一，莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵在裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出特定莢膜多糖的細(xì)菌；步驟ニ，加酸分離發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)加酸調(diào)節(jié)步驟一所得發(fā)酵液的pH值，控制PH值< 5，用此方法來沉淀菌體和雜質(zhì)；步驟三，用微濾膜對(duì)步驟ニ所獲得的含有沉淀菌體和雜質(zhì)的發(fā)酵液進(jìn)行微濾，以去除其中的不溶顆粒物，包括菌體，沉淀雜質(zhì)，殘留細(xì)胞碎片和不溶小顆粒物質(zhì)；步驟四，超濾濃縮和洗濾用超濾膜濃縮和洗濾步驟三的微濾液，獲得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液。在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，所述細(xì)菌包括肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌和傷寒桿菌。在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，在步驟ニ中所加的酸是磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的任意ー種。在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，在步驟ニ中pH值的范圍是3. 0 5. O。
在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，在步驟三中所用微濾膜的膜孔徑為0. 22，0. 45，0. 65，I. 0 i! m 中的任意ー種。在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，在步驟四中，所用的超濾膜是分子量為5kD至500kD范圍內(nèi)的任意ー種膜。在上述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法中，在步驟四中，洗濾所用溶液為純水、緩沖液或者鹽溶液或它們的混合液。在通過上述純化工藝過程所獲得的莢膜多糖溶液中，包括可溶性蛋白和核酸雜質(zhì)含量都顯著地降低。本發(fā)明可用于從含有莢膜多糖細(xì)菌中純化多糖，此處只是舉例，而不限于這些細(xì)菌，如肺炎球菌不同血清型，包括 1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌，以及傷寒桿 菌。在本發(fā)明中，步驟ニ加酸分離菌體和雜質(zhì)是核心，即通過加入磷酸將發(fā)酵菌液pH調(diào)節(jié)至3. 0-5. 0之間，用此方案來沉淀菌體、蛋白和核酸。在本發(fā)明中，采用微濾和超濾濃縮ニ步法來去除步驟ニ發(fā)酵液中的沉淀物和不溶性顆粒，能夠滿足分離要求，根據(jù)細(xì)菌種類不同，或者肺炎球菌的血清型不同，選用0. 22，0. 45，0. 65或者I. Oiim膜來微濾獲得的加酸分離后的上清液，去除溶液中殘留的細(xì)胞顆粒和碎片，以及不溶顆粒；用30至500kD膜對(duì)微濾液進(jìn)行超濾濃縮，并用去離子水或者緩沖液來超濾清洗溶液，去除小分子污染物，通過這些步驟的純化處理，可以去除莢膜多糖溶液中的90-98%蛋白和95-99%核酸。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明與傳統(tǒng)的將發(fā)酵液中的細(xì)菌破菌/或者溶菌后來進(jìn)行純化方法的不同之處是，通過將溶液中的污染物快速而簡便地去除，保留溶液中的完整分子量的莢膜多糖。本發(fā)明可用于，如肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌莢膜多糖的純化，純化后的多糖溶液中雜蛋白和核酸含量可降低90-98%。目前采用的莢膜多糖純化工藝繁雜，含有多步的沉淀分離步驟，不易エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，需要大量貴重的設(shè)備的投入和人力來進(jìn)行操作。細(xì)菌莢膜多糖的純化工藝經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展變遷，隨著新型生物材料不斷推出，大分子純化技術(shù)也隨之改善，以適應(yīng)對(duì)生物制劑質(zhì)量不斷提高的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于用細(xì)菌莢膜多糖來制備的疫苗，如肺炎球菌多糖疫苗和多價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗，b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，流行性腦膜炎多糖疫苗和多糖結(jié)合疫苗，以及傷寒Vi多糖疫苗和Vi多糖結(jié)合疫苗，其莢膜多糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷的提高，以多糖中的雜質(zhì)蛋白含量容許標(biāo)準(zhǔn)為例，從上世紀(jì)80年代23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之ー是要求雜質(zhì)蛋白和核酸標(biāo)準(zhǔn)低于2-7%，到2000年的各種不同細(xì)菌多糖結(jié)合疫苗所用的莢膜多糖原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是低于1%。細(xì)菌莢膜多糖的純化工藝也從早期的多達(dá)16道エ藝，改進(jìn)到目前正在采用的10道主要エ藝步驟，縮短了純化需要的時(shí)間和成本，同時(shí)，在質(zhì)量上也達(dá)到了現(xiàn)代的多糖疫苗制劑要求的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明是在對(duì)現(xiàn)有的細(xì)菌莢膜多糖純化工藝環(huán)節(jié)的中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測和評(píng)估的基礎(chǔ)上，進(jìn)ー步優(yōu)化而建立的純化工藝平臺(tái)，能夠快速、簡便地純化出不同細(xì)菌的莢膜多糖，步驟如下步驟一，莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵在裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出特定莢膜多糖的細(xì)菌；步驟ニ，加酸分離發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)加酸調(diào)節(jié)步驟一所得發(fā)酵液的pH值，控制PH值< 5，用此方法來沉淀菌體和雜質(zhì)；步驟三，用微濾膜對(duì)步驟ニ所獲得的含有沉淀菌體和雜質(zhì)的發(fā)酵液進(jìn)行微濾，以去除其中的不溶顆粒物，包括菌體，沉淀雜質(zhì)，殘留細(xì)胞碎片和不溶小顆粒物質(zhì)；步驟四，用超濾膜濃縮和洗濾步驟三所獲得的微濾液，得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液；通過以上四個(gè)エ藝步驟，能夠?qū)⑷芤褐械闹饕s質(zhì)，如蛋白和核酸的含量降低90-98%，同時(shí)，純化出來的莢膜多糖的免疫原性、分子的完整性都優(yōu)于或等同于現(xiàn)有的純化方法所獲得的多糖。步驟五，采用現(xiàn)有技術(shù)對(duì)細(xì)菌莢膜多糖進(jìn)行后續(xù)純化。本發(fā)明提出的純化細(xì)菌莢膜多糖的方法的設(shè)計(jì)原理及試驗(yàn)條件的控制如下(一)、細(xì)菌發(fā)酵過程的控制要純化出高純度的莢膜多糖，需要對(duì)多糖生產(chǎn)過程中的各個(gè)可能造成污染的環(huán)節(jié)加以控制，特別是在發(fā)酵環(huán)節(jié)上應(yīng)該盡量減少污染物進(jìn)入到用于純化多糖的發(fā)酵液中，其中，由于菌體破碎而釋放出來的雜質(zhì)污染物，如蛋白和核酸，以及培養(yǎng)基中含有的雜質(zhì)，包括蛋白，核酸和雜質(zhì)多糖等是污染物的主要來源。以肺炎球菌為例，該細(xì)菌是革蘭氏陽性菌，能夠耐受氧氣，其形態(tài)具有多樣性的特點(diǎn)，可以在光滑(Transparent)和粗糙(Opaque)菌落形態(tài)間轉(zhuǎn)化。在處于光滑菌態(tài)時(shí)，細(xì)菌表面只具有少量的莢膜多糖，是人體鼻腔內(nèi)寄生菌落存在的形態(tài)；而處于粗糙菌態(tài)的細(xì)菌表面含有大量的莢膜多糖，是人體血液中的肺炎球菌存在的形態(tài)，莢膜多糖的存在能夠阻止宿主免疫細(xì)胞吞噬作用，使得細(xì)菌能夠存活下來并繁殖。實(shí)驗(yàn)表明在液體培養(yǎng)基中，肺炎球菌表面包裹的部分莢膜多糖會(huì)脫落到發(fā)酵液中，能夠用來純化莢膜多糖。顯而易見，從菌體表面獲取莢膜多糖，必須將菌體破碎后獲得，這就使得細(xì)菌體內(nèi)雜質(zhì)蛋白、核酸等污染物都釋放至發(fā)酵液中，因而增加了純化多糖的難度。為了避免這ー問題，同時(shí)，根據(jù)肺炎球菌的培養(yǎng)特性，本發(fā)明首先采用嚴(yán)格的無氧發(fā)酵，使得肺炎球菌在發(fā)酵液中以粗糙菌態(tài)為主，在此條件下，肺炎球菌會(huì)生產(chǎn)大量的莢膜多糖，部分莢膜多糖會(huì)從細(xì)菌表面釋放至培養(yǎng)液中。在控制發(fā)酵液的PH值在中性范圍內(nèi)(7. 0-7. 6)，多糖能夠穩(wěn)定地存在于溶液中而不降解。另ー方面，由于肺炎球菌含有溶菌酶，當(dāng)細(xì)菌死亡后，會(huì)釋放出該酶自溶，因此，在細(xì)菌發(fā)酵至生長平臺(tái)期后要及時(shí)地停止發(fā)酵，進(jìn)行收獲，以便減少細(xì)菌死亡，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，污染發(fā)酵液的情況發(fā)生。目前市場上使用的肺炎疫苗，包括23價(jià)肺炎多糖疫苗和13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合 疫苗，以及b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗，生產(chǎn)所用的莢膜多糖原料都是由加入表面活性劑至發(fā)酵液中來溶解菌體，以釋放出細(xì)菌細(xì)胞壁上的莢膜多糖進(jìn)行純化，最終莢膜多糖的來源實(shí)際上有兩途徑，即在發(fā)酵過程中從細(xì)菌表面脫落至發(fā)酵液中的多糖和溶菌后由細(xì)胞壁上釋放出來的多糖。盡管用這種方法來純化莢膜多糖時(shí)，起始多糖總量要多于僅僅從去除菌體的發(fā)酵液上清液中純化莢膜多糖的起始量；但是，溶菌發(fā)酵液中起始溶液中的雜質(zhì)成分含量要遠(yuǎn)高于發(fā)酵上清液，這給后續(xù)純化工序増加了負(fù)擔(dān)，需要更多的步驟來進(jìn)行純化，因此，一方面溶液中的多糖會(huì)在在過多的純化步驟中損失增加，其收率和從發(fā)酵液中進(jìn)行純化相比較，并不占優(yōu)勢；另ー方面，加入表面活性劑來溶菌后，盡管可釋放出更多的多糖，但是，存在于細(xì)胞壁的雜質(zhì)多糖成分，比如C-多糖也被釋放出來。而C-多糖的化學(xué)特性和英膜多糖相似，在后續(xù)的純化過程中，去除非常困難?，F(xiàn)有市場上的產(chǎn)品中C-多糖污染是ー個(gè)突出的問題，因?yàn)镃-多糖在檢測過程中，容易被計(jì)入莢膜多糖，但C-多糖并沒有免疫原性，不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體來殺菌。其結(jié)果是混入制劑中致使多糖疫苗的免疫效果受到影響。(ニ)、發(fā)酵液酸化過程的控制在獲得含有莢膜多糖的發(fā)酵液后，將其和污染物，包括菌體、蛋白和核酸，進(jìn)行分離的步驟繁雜，常用方法有離心去除大顆粒菌體，隨后通過過濾，來去除小顆粒的細(xì)胞碎片以獲得含有莢膜多糖的澄清發(fā)酵上清液。在下游的純化過程中，采用諸如こ醇沉淀、核酸和蛋白酶消化、有機(jī)溶劑和苯酚抽提以及超濾清洗步驟進(jìn)ー步純化，最終獲取純化多糖。本發(fā)明采用了將含有菌體的發(fā)酵液直接進(jìn)行酸化，一次性地沉淀菌體，蛋白以及核酸雜質(zhì)，這一方法將大大地減少傳統(tǒng)的多步驟去除方法。根據(jù)生產(chǎn)細(xì)菌的品種不同，或者血清型的不同，當(dāng)將溶液的pH調(diào)節(jié)至3. 0-5. 0范圍時(shí)，能夠沉淀發(fā)酵液中90% -98%的菌體，蛋白以及核酸。酸化溶液所用的酸可為磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸，硝酸或者是這些酸溶液的不同濃度的混合液。酸化時(shí)間為10分鐘-24小時(shí)，需要根據(jù)不同的細(xì)菌或血清型來決定。酸化時(shí)發(fā)酵液溫度可為4-37°C。通過對(duì)以上條件的控制，發(fā)酵液中的菌體、蛋白和核酸等主要污染物能夠快速形成沉淀，而莢膜多糖能夠穩(wěn)定地存在于溶液中達(dá)到分離雜質(zhì)的目的。(三)、微濾過程的控制在本發(fā)明的純化平臺(tái)程序中，省去離心分離步驟，直接通過微濾來去除溶液中的細(xì)胞碎片以及小顆粒不溶物，微濾膜的分子量范圍在0. 22至I ii m。收集含有莢膜多糖的澄清濾溶液，丟棄微濾回流液。(四)、超濾濃縮和洗濾過程的控制本發(fā)明純化技術(shù)平臺(tái)程序中對(duì)微濾液進(jìn)行超濾濃縮井清洗采用的超濾膜分子量可為5、10、30、50、100或者500Kd中的任何ー種，需要根據(jù)細(xì)菌種類或者特定血清型來決定。濃縮最終溶液體積范圍為原溶液的2-10倍，根據(jù)細(xì)菌種類或者血清型不同而定。超濾洗濾濃縮液エ藝步驟時(shí)采用純水、緩沖液、鹽溶液或者酸化鹽溶液中的任何ー種，需要更不同血清型多糖的穩(wěn)定性來決定。通過以上純化工藝過程，溶液中的雜質(zhì)含量逐步降低，下表為肺炎球菌部分血清型莢膜多糖溶液經(jīng)過純化后雜質(zhì)濃度測定結(jié)果權(quán)利要求
1.快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，包括以下步驟 步驟一，莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵在裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵出特定莢膜多糖的細(xì)菌； 步驟二，加酸分離發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)加酸調(diào)節(jié)步驟一所得發(fā)酵液的PH值，控制PH值< 5，用此方法來沉淀菌體和雜質(zhì)； 步驟三，用微濾膜對(duì)步驟二所獲得的含有沉淀菌體和雜質(zhì)的發(fā)酵液進(jìn)行微濾，以去除其中的不溶顆粒物，包括菌體，沉淀雜質(zhì)，殘留細(xì)胞碎片和不溶小顆粒物質(zhì)； 步驟四，超濾濃縮和洗濾用超濾膜濃縮和洗濾步驟三的微濾液，獲得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是所述細(xì)菌包括肺炎球菌、b型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌和傷寒桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟二中所加的酸是磷酸、醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟二中PH值的范圍是3. O 5. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟四中所用微濾膜的膜孔徑為O. 22，O. 45，O. 65，I. O μ m中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟四中所用的超濾膜是分子量為5kD至500kD范圍內(nèi)的任意一種膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，其特征是在步驟四中，洗濾所用溶液為純水、緩沖液或者鹽溶液或它們的混合液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，它能從特定細(xì)菌發(fā)酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留純化的莢膜多糖，包括含莢膜多糖細(xì)菌的發(fā)酵，離心、微濾去除菌體和不溶顆粒物質(zhì)，加酸調(diào)節(jié)溶液的pH值來沉淀雜質(zhì)，超濾濃縮和洗濾溶液獲得粗制細(xì)菌莢膜多糖溶液。本發(fā)明的基本原理是通過加酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3-5的范圍，雜質(zhì)，保持莢膜多糖在溶液中來進(jìn)行純化?？捎糜诩兓窝浊蚓型流感嗜血桿菌、流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌的莢膜多糖。
文檔編號(hào)C12R1/21GK102660601SQ20121011237
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者李建平 申請(qǐng)人:江蘇康泰生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司