專利名稱：一種能夠緩解慢性酒精性肝損傷的鼠李糖乳桿菌及其用途的制作方法
一種能夠緩解慢性酒精性肝損傷的鼠李糖乳桿菌及其用途技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種能夠緩解慢性酒精性肝損傷的鼠李糖乳桿菌，本發(fā)明還涉及所述鼠李糖乳桿菌的用途。
背景技術：
酒精濫用和酒精依賴已成為當今世界日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，在我國酒精所致的肝損傷呈逐年上升趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損傷的第二大病因。酒精對肝臟的損傷主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。酒精性肝損傷還會導致其它危害，例如致使肝臟無法完全過濾血液，會引發(fā)高血脂、心腦血管??；肝臟分解代謝能力降低，并發(fā)糖尿病、膽石癥、腎??；引發(fā)急性妊娠性脂肪肝以及對機體消化系統(tǒng)的損傷等。因此，探尋酒精性肝病的發(fā)病機制和防治干預措施將具有十分重要的意義。目前人們認為，酒精性肝損傷的主要原因是乙醇在肝細胞內代謝時產生的毒性代謝產物以及由此引起的代謝紊亂。酒精性肝損傷原因具體地是1、乙醛的毒性作用乙醛通過與半胱氨酸、谷胱甘肽及維生素E的相互作用促進脂質過氧化；乙醛與肝臟內多種蛋白結合，作為抗原，刺激機體產生抗體，引起相應的免疫應答，導致肝細胞損傷；乙醛還可以與酶的重要功能基團結合，導致酶的活性改變，從而影響酶的功能。2、自由基的損害作用乙醇在代謝過程中可以產生大量的自由基和活性氧，自由基能夠直接損傷肝細胞，還會通過增加肝細胞對脂質過氧化的敏感性，引起肝細胞損傷。3、內毒素的誘導作用乙醇的攝入使得腸道菌群紊亂，同時，破壞腸道粘膜結構和功能的完整性，增加腸粘膜的滲透性，弓丨起血液中內毒素含量增加，而內毒素則會誘導多種細胞因子的產生，通過炎癥因子造成對肝細胞的損傷。目前針對酒精性肝損傷的成因主要治療方法有戒酒、營養(yǎng)治療、藥物治療、基因治療，與酒精性肝病相關疾病的治療等方法。目前最常用的方法為藥物治療，它雖有一定的療效但也存在著很多不足，例如許多藥物可能驅使血脂更集中于肝臟代謝，這樣反而促使脂質蓄積并損害肝功能；并且這些藥物均在肝臟中代謝，有可能進一步加重肝臟的負擔；還有一些藥物見效慢、不良反應嚴重，甚至會產生耐藥性和毒副作用。所以，研究人員正在積極探索酒精性肝病的新型治療與干預方案，而益生菌由于不會產生耐藥性和毒副作用，并且已廣泛應用于改善人類健康，尤其是對酒精性肝病的防治具有一定針對性(見附圖5所示)，于是逐漸引起了人們的關注。益生菌是指在其攝入一定數(shù)量后，能夠促進動物或人體原生微生物菌群生長而對宿主產生有益影響的活性微生物。所述的益生菌主要包括乳桿菌，雙歧桿菌和部分鏈球菌等；它們一般具備特殊的生理活性和保健功能，例如調節(jié)宿主的腸道菌群，治療由抗生素引起的腹瀉，降低血脂膽固醇水平，抑制大腸桿菌、幽門螺桿菌等有害菌的感染等。此外，益生菌能夠有效清除自由基，提高機體的抗氧化活性；能夠調節(jié)腸道菌群，降低內毒素含量；同時，益生菌還能夠調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)。益生菌的這些功能為人們提示，其對于緩解酒精性肝損傷能夠發(fā)揮一定的作用。而目前有關益生菌保肝護肝方面的報道相對較少，因此，探索利用益生菌作為食療性的保健食品來緩解酒精性肝損傷具有重要的研究意義，隨著人們對酒精性肝損傷的日益重視以及益生菌的不斷推廣應用，利用益生菌及其產品對酒精性肝病進行膳食干預將具有極為廣闊的市場前景。在目前已公開的專利申請中，針對酒精性肝損傷的預防和治療主要集中于中藥組合物。例如CN 101224232A公開了從中藥葛根的根中提取得到葛根總黃酮，能夠抑制小腸通透性的增加，降低血液中酒精濃度，減輕酒精吸收以及由酒精引起的肝臟損害。CN101961367A公開了一種預防酒精性肝損傷的中藥組合物，由真菌多糖成分與水飛薊水提物成分組成，其溶解性好，在胃腸道中崩解快，吸收好，可增強免疫力并對酒精性肝損傷起輔助保護的作用。還有CN 102058632A和CN 102160637A等也分別公開了中草藥及其提取物對酒精性肝損傷的保護作用。涉及到乳制品，例如CN101623032A公開了一種對酒精性肝損傷有輔助保護作用的牛奶，其中添加了水溶性膳食纖維、卵磷脂和大豆多肽等，這種牛奶可以增強肝臟機能，加快酒精代謝，緩解酒精性肝損傷。CN 101328469A公開了一種具有酒精性肝損傷保護功能的嗜熱鏈球菌grx02，并證明了其對急性酒精性肝損傷可以發(fā)揮不同程度的保護特性。但是，這些專利沒有完全涉及一種可以調節(jié)腸道菌群、緩解慢性酒精性肝損傷的益生乳桿菌。因此，目前還需要有一種能夠調節(jié)腸道菌群、緩解慢性酒精性肝損傷的益生菌及其相關食品。

發(fā)明內容[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種能夠抗氧化、緩解慢性酒精性肝損傷的的鼠李糖乳桿菌。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的鼠李糖乳桿菌的用途。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1107,該菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5496。本發(fā)明還涉及所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107在使用所述鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑制備乳制品中的用途。根據(jù)本發(fā)明，所述的乳制品是含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳、乳粉、乳膠囊制品或發(fā)酵乳。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的將鼠李糖乳桿菌CCFMl 107菌種按照以脫脂乳重量計12%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14_16h至凝乳，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，得到的發(fā)酵脫脂乳作為母發(fā)酵劑；將所述的母發(fā)酵劑按照以滅菌脫脂乳體積計3-5%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14_16h至凝乳，得到所述的工作發(fā)酵齊U，該工作發(fā)酵劑的活菌數(shù)濃度是1-3X 109cfu/mL。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的
將鼠李糖乳桿菌CCFMl 107菌種按照以MRS液體培養(yǎng)基重量計1_5%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按照以MRS液體培養(yǎng)基體積計2-4%接種于MRS培養(yǎng)基中，在溫度37°C條件下培養(yǎng)16-18h，再在溫度4°C條件下以4000r/min離心15min，去除上清液，得到的細胞沉淀用無菌脫脂乳懸浮，得到所述的工作發(fā)酵劑，該工作發(fā)酵劑的活菌濃度是l-3X109cfu/mL。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在溫度140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻至度4°C，再加入所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑，使其濃度達到106Cfu/mL以上，在4°C冷藏保存，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳粉或乳膠囊制品是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再按照以原料乳體積計4%接種所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑，然后在溫度37°C的條件下發(fā)酵16h，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的發(fā)酵乳；接著，含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳按照其與上述滅菌原料乳的體積比I : 3加到所述滅菌原料乳中，進行均質，真空濃縮、噴霧干燥得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳粉；把所述的含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳粉裝入膠囊，制成乳膠囊制品。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再加入以原料乳體積計3-5%所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑與3-5%可制備發(fā)酵乳的商品發(fā)酵劑，混勻后在溫度37°C的條件下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0. 6-0. 7 %，然后冷卻至溫度4°C，再進行冷藏保存得到含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的商品發(fā)酵劑是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或馬奶。下面將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1107,該菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5496。本發(fā)明人從實驗室分離保藏的菌種中篩選出一株益生菌CCFM1107，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀等微生物學特性，以及16S rDNA序列測定的分子鑒定手段對該益生菌CCFM1107 鑒定為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFMl 107。該菌株已于 2011年11月29日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5496。所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的形態(tài)學特征如下菌落特征在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0.5-1. Omm之間，圓形，邊緣整齊，乳白色，透明，表面濕潤光滑，不產生色素，參見附圖I。菌體特征呈革蘭氏染色陽性，細胞桿狀，菌體成單、成對或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形，參見附圖2。本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的培養(yǎng)特征如下本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFM1107延滯期相對較短，在4h就進入對數(shù)生長期，在14h 16h達到穩(wěn)定期，在24h后逐漸衰亡，細胞數(shù)目開始降低。本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的液體培養(yǎng)特征鼠李糖乳桿菌CCFMl 107在MRS液體培養(yǎng)基中生長良好，在培養(yǎng)約4h，其培養(yǎng)液開始混濁，在培養(yǎng)約8h開始有菌體細胞沉淀，輕輕搖動沒有氣泡產生，在培養(yǎng)12h后有大量菌體沉淀，培養(yǎng)20h后乳白色菌體沉淀明顯增加，且菌體較為牢固地聚集在培養(yǎng)底部，上層培養(yǎng)液非常澄清，PH值由最初的6. 2降到3. 8。在本發(fā)明中，所述的MRS液體培養(yǎng)基是本技術領域的技術人員熟知的，是BDDifco公司以商品名BactO Lactobacilli MRS Broth銷售的用于乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，也可以是國內有關公司生產的相同的商品化培養(yǎng)基。本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，根據(jù)衛(wèi)生部可食用菌種名單屬公認安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)菌種,可用于發(fā)酵食品中。本發(fā)明還涉及所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107在使用所述鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑制備乳制品中的用途。所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的一般地，首先需要對鼠李糖乳桿菌CCFMl 107純培養(yǎng)物進行反復接種，以恢復其菌株的活力。取少量純培養(yǎng)物接種至在溫度110°c下滅菌IOmin的脫脂乳中，在溫度37°C的條件下進行培養(yǎng)。最初數(shù)小時慢慢地加以振蕩，使菌種與脫脂乳混合均勻，然后靜置培養(yǎng)直至凝固。凝固后，用滅菌吸管從底部吸取l_2mL凝乳培養(yǎng)物，在無菌條件下加到滅菌脫脂乳中進行培養(yǎng)至凝乳。按照這種方法反復進行數(shù)次，使菌種充分活化，這樣用于制備母發(fā)酵劑。然后，將經過如此復壯的鼠李糖乳桿菌CCFM1107菌種按照以脫脂乳重量計12%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14_16h至凝乳，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，得到的發(fā)酵脫脂乳作為母發(fā)酵劑。所述的加熱殺菌是例如使用英國斯必克APV公司銷售的145C型殺菌機進行的。脫脂乳是一種本技術領域里人們熟知的乳品。將原料乳經過驗收、過濾后，預熱至38°C左右，利用離心分離機，例如瑞典阿法-拉伐(Alfa-Laval)公司制造的封閉式離心分離機便可以將原料乳分成稀奶油和脫脂乳兩部分，通過這種方法便可以得到所述的脫脂乳。將所述的母發(fā)酵劑按照以滅菌乳體積計3-5%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，得到所述的工作發(fā)酵劑，該工作發(fā)酵劑的活菌濃度是1-3X 109cfu/mL。工作發(fā)酵劑質量優(yōu)劣直接影響所生產的發(fā)酵乳制品的質量。因此，需要對工作發(fā)酵劑進行感官檢查，判斷工作發(fā)酵劑是否凝固均勻，組織細膩、致密，是否有彈性，是否有酸味和芳香味，無異味，無氣泡；還需要進行化學檢查，測定其酸度，其滴定酸度一般是90-110° T ;采用本技術領域里的常規(guī)方法(參見GB 4789. 2-2010，食品安全國家標準，中華人民共和國衛(wèi)生部)測定細菌總菌數(shù)，測定鼠李糖乳桿菌CCFM1107活菌濃度應該達到l-3X109cfu/mL?；蛘撸龅?鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的將鼠李糖乳桿菌CCFMl 107菌種按照以MRS液體培養(yǎng)基重量計1_5 %接種于MRS液體培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按照以MRS液體培養(yǎng)基體積計2-4%接種于MRS培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)16-18h,再在溫度4°C條件下以4000r/min離心15min,去除上清液，得到的細胞沉淀用無菌脫脂乳懸浮，得到所述的工作發(fā)酵劑，該工作發(fā)酵劑的活菌濃度是 l-3X109cfu/mL。 在本發(fā)明中，所述的乳制品是含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的乳、乳粉、乳膠囊制品或發(fā)酵乳。根據(jù)本發(fā)明，含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的乳是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在溫度140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻至度4°C，再加入所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑，使其濃度達到106Cfu/mL以上，在4°C冷藏保存即得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳。在本發(fā)明中，加熱殺菌設備是本技術領域里通常使用的市場上廣泛銷售的設備。所述的加熱殺菌是例如使用英國斯必克APV公司銷售的145C型殺菌機進行的。所述的高溫熱殺菌是例如使用日本PowerPoint International有限公司銷售的PT-20C-R型管板式組合式超高溫殺菌機進行的。含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的乳還可以在其中添加在本技術領域里通常使用的砂糖、穩(wěn)定劑、香精、色素、果汁等輔料。所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或馬奶。例如脫脂奶是脫脂牛奶、脫脂羊奶或脫脂馬奶；鮮奶是鮮牛奶、鮮羊奶或鮮馬奶。所述的復原奶應該理解是一種用濃縮全脂乳或/和全脂乳粉與水勾兌而成的原料乳。根據(jù)本發(fā)明，含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的的乳粉或膠囊制品是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再按照以原料乳體積計4%接種上述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑，然后在溫度37°C的條件下發(fā)酵16h，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的發(fā)酵乳；接著，含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳按照其與上述滅菌原料乳的體積比I : 3加到所述滅菌原料乳中，進行均質，真空濃縮、噴霧干燥得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳粉。所述的均質是一項在食品生產中經常采用的技術。食品加工中的均質就是指物料的料液在擠壓、強沖擊與失壓膨脹三重作用下使物料細化，從而使物料能更均勻的相互混合，比如奶制品加工中使用均質機使牛奶中的脂肪球破碎更細小，從而使整個產品體系更加穩(wěn)定。均質主要通過均質機來進行的。均質機是食品、乳品行業(yè)的重要加工設備，本發(fā)明使用的均質機是目前市場上銷售的產品，例如上海東華高壓均質機廠銷售的GYB40-10S型高壓均質機。根據(jù)本發(fā)明，所述的真空濃縮是食品生產中經常采用的技術，本技術領域里的技術人員根據(jù)物料性質選擇其濃縮溫度與真空度是不存在任何困難的。本發(fā)明使用的真空濃縮設備是目前市場上銷售的產品，例如揚州市食品機械廠銷售的真空濃縮鍋。根據(jù)本發(fā)明，所述的噴霧干燥是食品生產中經常采用的技術，本技術領域里的技術人員根據(jù)物料性質選擇其干燥溫度與干燥時間是不存在任何困難的。本發(fā)明使用的噴霧干燥設備是目前市場上銷售的產品，例如上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧干燥機。根據(jù)本發(fā)明，把含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的所述乳粉裝入膠囊，制成膠囊制品。根據(jù)本發(fā)明，所述的膠囊是目前醫(yī)藥、食品市場上銷售的產品。根據(jù)本發(fā)明，含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再加入以原料乳體積計3-5%所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑與3-5%可制備發(fā)酵乳的商品發(fā)酵劑，混勻后在溫度37°C的條件下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0. 6-0. 7 %，然后冷卻至溫度4°C，再進行冷藏保存得到含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳。所述的商品發(fā)酵劑是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，例如美國丹尼斯克公司或丹麥科漢森公司的產品。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus)目前被廣泛地應用在發(fā)酵乳制作的過程當中，在分類上屬于乳酸桿菌屬，因其菌種產地、微生物特性、效能優(yōu)異等特點，被微生物學家命名為德氏乳桿菌保加利亞亞種(簡稱保加利亞乳桿菌)。嗜熱鏈球菌是制作發(fā)酵乳的重要發(fā)酵劑，廣泛用于生產發(fā)酵乳制品，其中包括酸奶和奶酪。嗜熱鏈球菌也具有一些功能活性，例如產生胞外多糖、細菌素和維生素。通過動物實驗表明，本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107能改善酒精性肝損傷小鼠的肝功能、抗氧化指標、緩解內毒素血癥及調節(jié)腸道菌群分布，可以有效地緩解酒精性肝病，其作用效果與市場上常用的黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產的葵花護肝片相當，甚至更好。
[有益效果]本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107具有很高的抗氧化能力；細胞濃度為101(lcfu/mL的鼠李糖乳桿菌CCFM1107完整細胞和無細胞提取物對二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的清除率分別為93. 51 %和89. 66 % ;細胞濃度為1010cfu/mL的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107完整細胞和無細胞提取物對羥自由基的清除率分別為94. 16%和93. 87% ;鼠李糖乳桿菌CCFMl 107完整細胞和無細胞提取物均具有一定的還原能力，濃度為101(lCfu/mL的完整細胞和無細胞提取物的還原能力分別相當于392. 07 u mol/L和373. 91 u mol/L濃度的半胱氨酸鹽酸鹽；鼠李糖乳桿菌CCFMl 107還具有抑制脂質過氧化的能力，濃度為101(lCfu/mL的完整細胞和無細胞提取物對脂質過氧化的抑制率分別達到84. 52%和81. 18%。鼠李糖乳桿菌CCFMl 107能夠耐受膽鹽的濃度為0. 35%，能夠耐受的氯化鈉濃度為8%，耐受的pH值為3.O。動物實驗結果表明，本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107能改善酒精性肝損傷小鼠的肝功能、抗氧化指標、緩解內毒素血癥及調節(jié)腸道菌群分布，可以有效地緩解酒精性肝病，其作用效果與市場上常用的黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產的葵花護肝片相當，甚至更好。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFMl 107 菌株已于 2011 年 11 月 29日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo. 5496。

圖I表示鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的菌落形態(tài)；圖2表示鼠李糖乳桿菌CCFMl 107革蘭氏染色的菌體形態(tài)(1000X)；圖3表示鼠李糖乳桿菌CCFMl 107在MRS液體培養(yǎng)基中在溫度37°C與厭氧培養(yǎng)條件下的生長曲線；圖4表示各組小鼠肝臟病理切片HE染色的形態(tài)觀察(200 X)A為空白組，B為模型組，C為藥物組，D為灌胃CCFM1107的干預組，E為灌胃植物乳桿菌N-9組，作為陰性對照組；圖5表示酒精性肝損傷發(fā)病原因與益生菌健康功效的關系。
具體實施方式通過下述實施例將更好地理解本發(fā)明。除非特別指出，下面這些實施例使用的設備、測定方法等都是本說明書中指出的那些設備和方法，實施例不再贅述。實施例I :本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的16S rDNA序列鑒定將鼠李糖乳桿菌CCFMl 107接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37 V的條件下培養(yǎng)18h，取ImL培養(yǎng)菌液采用細菌基因組DNA提取試劑盒，按其說明進行操作。以基因組 DNA 作為模板，以文獻(Critical Evaluation ofTwo Primers Commonly Usedfor Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2008, 74 (8) :2461-2470)公布的細菌鑒定通用引物為引物，采用50 y L反應體系進行PCR擴增、然后對擴增產物進行純化、回收和測序。目的基因PCR擴增產物的測序是由上海生物工程技術服務有限公司完成的，將鼠李糖乳桿菌CCFM1107的16S rDNA的測序結果利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，最終結果表明本發(fā)明的CCFM1107與鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus strain HT2,Lactobacillus rhamnosus strain 20300 以及Lactobacillus rhamnosus strain NM94-5等多種鼠李糖乳桿菌的同源性均高達99%，因此，將本發(fā)明的CCFMl 107菌株鑒定為鼠李糖乳桿菌，命名為Lactobacillus rhamnosus CCFM1107，于2011年11月29日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5496。實施例2 鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的微生物學性質測定
鼠李糖乳桿菌CCFMl 107按照以MRS液體培養(yǎng)基體積計5 %接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，分別在011、111、211、311、411、611、811、1011、1211、1411、1611、1811、2011、2211 和 24h 這些時間點用PH計測定培養(yǎng)液的pH值，并用分光光度計測定在600nm處的OD6tltl值。本發(fā)明使用的pH計是梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司銷售的320-S pH計，使用的分光光度計是尤尼柯(上海)儀器有限公司銷售的UV-2100紫外可見分光光度計。以0D_值和pH值對培養(yǎng)時間繪圖，可以得到鼠李糖乳桿菌CCFMl 107在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線，其結果如圖3所示。在MRS培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的延滯期相對較短，在4h時進入對數(shù) 生長期，在14 16h時進入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時間的延長，pH不斷下降。進入穩(wěn)定期后，PH基本保持不變。培養(yǎng)24h后，pH由最初的6. 13降至3. 86。24h培養(yǎng)液中鼠李糖乳桿菌CCFMl 107活菌濃度為6. 8X 108cfu/mL。實施例3、鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的抗氧化能力首先，制備鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的完整細胞及無細胞提取物。將本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFM1107活化培養(yǎng)后接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度370C的條件下培養(yǎng)24h，經在6000r/min與溫度4°C的條件下離心lOmin，得到培養(yǎng)上清液和菌體沉淀，菌體沉淀經無菌生理鹽水洗滌兩次后，在無菌生理鹽水重懸，調整細胞濃度約為109cfu/mL。所得菌細胞懸液分為兩組，一組為完整細胞組(1C)，另一組用于無細胞提取物(CFE)的制備。將細胞懸浮液用超聲波破碎儀(Sonics&Materials公司，VCX500型)在200W與溫度4°C的條件下進行超聲破碎，每個處理進行5s、每個處理間隔5s，超聲粉碎30min，再在顯微鏡下檢查沒有完整菌體，然后以溫度4°C與6000r/min的條件下離心lOmin，收集上清液，即為無細胞提取物。然后，進行鼠李糖乳桿菌CCFM1107各項抗氧化能力的測定，其中包括對DPPH自由基、羥自由基的清除率，還原活性以及脂質過氧化的抑制率，這些結果列于表I中。(I)清除DPPH自由基的能力DPPH (I, I- 二苯基-2-三硝基苯餅，I, I-Diphenyl-2-pi cry Ihydrazy I radical)自由基是一種常見的篩選和評價抗氧化劑的有效方法，它是一種穩(wěn)定的有機自由基，有單個電子，在醇溶液中呈現(xiàn)紫色，在517nm處有較強吸收，當加入對DPPH自由基有清除作用的物質后，其吸收會減弱，可通過這一變化檢查測試物質的抗氧化性能。本實施例按照改進的 MEEI-YN LIN 和 FEN-JUAN CHANG 的方法(Antioxidative effect of intestinalbacteriaBifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilusATCC4356. Digestive Diseases and Sciences，2000，45 (8) :1617-1622)，測定出 CCFM1107完整細胞與無細胞提取物對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率是根據(jù)該文獻給出的計算方法計算得到的。(2)清除羥自由基的能力羥自由基是活潑性最強，氧化性最大的自由基，對DNA、蛋白質和脂類有較強的結合能力，是引起體內氧化損傷的主要因素。本實施例通過Fenton反應產生羥自由基HO*，以鄰菲羅啉-Fe2+作為該反應的氧化還原指示劑，加入HO 的清除劑，則HO 減少，同時Fe2+ 增多，溶液顏色變紅。具體方法參照 John M. C. GUTTERIDGE，F(xiàn)errous-salt-promoteddamage todeoxyribose and benzoate.The increased effectiveness ofhydroxyl-radicalscavangers in the presence of EDTA，Biochemical Journal. 1987，243 :709-714。羥自由基清除能力是用羥自由基清除率表示的，羥自由基清除率是根據(jù)該文獻給出的計算方法計算得到的。(3)還原活性的測定
還原活性主要指一些酶(如過氧化氫酶、NADH氧化酶、NADH過氧化物酶)和非酶復合物(維生素C、維生素E、谷胱甘肽)具有減少氧自由基和螯合Fe2+的能力，進而減少氧化反應的發(fā)生。本實施例按照改進的Meei-Yn Lin和Chyuan-Liang Yen的方法(Antioxidative ability of lactic acidbacteria. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1999,47 :1460-1466)測定出CCFM1107完整細胞與無細胞提取物的還原活性。還原活性是用還原力表示的，它相當于半胱氨酸鹽酸鹽濃度，還原力是根據(jù)該文獻給出的計算方法計算得到的。(4)抑制脂質過氧化的能力脂質過氧化反應主要是指在生物膜不飽和脂肪酸中在氧自由基誘導下發(fā)生的一系列自由基反應。脂質過氧化反應的最終產物有丙二醛(MDA)，MDA可破壞蛋白質、核酸等生物大分子，造成機體老化和多種疾病的發(fā)生。因此，測定MDA的含量，在一定程度上可反映脂質過氧化損傷的程度，是目前公認的反映脂質過氧化的指標。本實施例按照改進的 M. Y. LIN 和 C. L. YEN 的方法(Reactive oxygen species and lipidperoxidationproduct-scavenging ability of yogurt organisms. Journal of DairyScience，1999,82 :1629-1634)測定出CCFM1107完整細胞與無細胞提取物抑制脂質過氧化的能力，其抑制脂質過氧化能力是以脂質過氧化抑制率表示的，脂質過氧化抑制率是根據(jù)該文獻給出的計算方法計算得到的。上述CCFM1107完整細胞與無細胞提取物的DPPH清除率、羥自由基清除率、還原力與脂質過氧化抑制率的結果匯集于表I中。表I鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的抗氧化能力
~~DPPH~~擇自由基~還原力/相當于半胱氨酸脂質過氧化 抗氣化指標
清除率/% 清除率/% 鹽酸鹽的濃度(pmol/L) 抑制率/%
完整細胞 93.51±3.57 94.16±5.64392.07±7.1584.52±3.69
無細胞提取液 89.66±4.02 93.87±2.38373.91±6.3681.18±4.85由上表可知鼠李糖乳桿菌CCFM1107在清除自由基、抑制脂質過氧化以及還原力方面均表現(xiàn)出較高的活性。綜上所述，CCFM1107在所篩的菌株中具有較高的抗氧化活性。實施例4 鼠李糖乳桿菌CCFMl 107對膽鹽的耐受性試驗在MRS液體培養(yǎng)基中加入牛膽汁鹽，牛膽汁鹽濃度達到以其MRS液體培養(yǎng)基質量計分別為 0. 0%、0. 10%,0. 20%,0. 30%,0. 35%,0. 40%和 0. 45%，滅菌后以 MRS 液體培養(yǎng)基體積計5%接種量接種本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107菌種，在溫度37 °C的條件下培養(yǎng)24h后觀察各組培養(yǎng)液菌體的生長情況，并測定其在600nm下的OD6tltl值，本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFM1107在不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中的生長情況見下表2。人們知道，膽鹽對這種菌株的抑制作用取決于膽鹽濃度和菌株本身的特性，人腸道中膽鹽的含量為0. 03%-o. 30%，能夠在正常生理膽鹽濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道中存活。由表2的結果可以看出本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFM1107在膽汁鹽濃度最高為0. 35%的培養(yǎng)基中還能生長。因此鼠李糖乳桿菌CCFM1107具有良好的耐膽鹽能力。表2在不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基中鼠李糖乳桿菌CCFM1107的生長情況
權利要求
1.一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1107,該菌菌株已于2011年11月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號為CGMCC5496。
2.根據(jù)權利要求I所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl107在使用鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑制備乳制品中的用途。
3.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于所述的乳制品是含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的乳、乳粉、乳膠囊制品或發(fā)酵乳。
4.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的 將鼠李糖乳桿菌CCFM1107菌種按照以脫脂乳重量計12%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14_16h至凝乳，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，得到的發(fā)酵脫脂乳作為母發(fā)酵劑； 將所述的母發(fā)酵劑按照以滅菌脫脂乳體積計3-5%接種于在溫度110°C下滅菌IOmin的脫脂乳中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，得到所述的工作發(fā)酵劑，該工作發(fā)酵劑的活菌濃度是1-3X 109cfu/mL。
5.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl107工作發(fā)酵劑是按照下述制備方法制備的 將鼠李糖乳桿菌CCFM1107菌種按照以MRS液體培養(yǎng)基重量計1_5%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按照以MRS液體培養(yǎng)基體積計2-4%接種于MRS培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)16-18h，再在溫度4°C條件下以4000r/min離心15min，去除上清液，得到的細胞沉淀用無菌脫脂乳懸浮，得到所述的工作發(fā)酵劑，該工作發(fā)酵劑的活菌濃度是l-3X109cfu/mL。
6.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳桿菌CCFMl107的乳是按照下述步驟制備得到的 原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在溫度140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻到溫度4°C，再加入根據(jù)權利要求4或5所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑，使其濃度達到106cfu/mL以上，在4°C冷藏保存，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳。
7.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳桿菌CCFMl107的乳粉或乳膠囊制品是按照下述步驟制備得到的 原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再按照以原料乳體積計4%接種根據(jù)權利要求4或5所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107工作發(fā)酵劑，然后在溫度37°C的條件下發(fā)酵16h，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳；接著，含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳按照其與上述滅菌原料乳的體積比I : 3加到所述滅菌原料乳中，進行均質，真空濃縮、噴霧干燥得到含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的乳粉； 把所述的含有鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳粉裝入膠囊，制成乳膠囊制品。
8.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳桿菌CCFMl107的發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的原料乳在溫度95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，得到的滅菌原料乳再冷卻到37°C，再加入以原料乳體積計3-5%根據(jù)權利要求4或5所述的鼠李糖乳桿菌CCFMl 107工作發(fā)酵劑與3-5%可制備發(fā)酵乳的商品發(fā)酵劑，混勻后在溫度37°C的條件下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計O. 6-0. 7%，然后冷卻至溫度4°C，再進行冷藏保存，得到含有鼠李糖乳桿菌CCFMl 107的發(fā)酵乳。
9.根據(jù)權利要求8所述的用途，其特征在于所述的商品發(fā)酵劑是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。
10.根據(jù)權利要求6、7或8中任一項權利要求所述的用途，其特征在于所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或馬奶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠抗氧化、緩解慢性酒精性肝損傷的鼠李糖乳桿菌CCFM1107，還涉及所述的鼠李糖乳桿菌CCFM1107在使用其工作發(fā)酵劑制備乳制品中的用途。所述的乳制品是含有本發(fā)明鼠李糖乳桿菌CCFM1107的乳、乳粉、乳膠囊制品或發(fā)酵乳。本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107具有很高的抗氧化能力、二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基與羥自由基的清除能力、抑制脂質過氧化能力、耐受膽鹽、氯化鈉和pH的能力。本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌CCFM1107能改善酒精性肝損傷小鼠肝功能、抗氧化指標、降低血清內毒素水平及調節(jié)腸道菌群分布，可以有效地緩解酒精性肝損傷。
文檔編號C12R1/225GK102618456SQ20121004632
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權日2012年2月28日
發(fā)明者劉小鳴, 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 范大明, 趙建新, 遲菲菲, 陳衛(wèi), 黃文利 申請人:江南大學