專利名稱：提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的稻瘟菌分離蛋白質(zhì)及其基因、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有多于20個(gè)氨基酸的肽、編碼該肽段的核苷酸序列以及其應(yīng)用，特別涉及一種能提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)來自于稻痕菌(Magnaporthe oryzae)的分離蛋白質(zhì)及編碼該的蛋白質(zhì)的核苷酸序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40% 50%，甚至顆粒無收，世界各稻區(qū)均有發(fā)生。稻痕病病原菌稻痕菌(Magnaporthe oryzae)在分類地位上，無性世代屬于半知菌亞門梨孢屬，有性世代屬于子囊菌亞門。目前對植物病害的防治主要采取化學(xué)防治和選育品種。但是它們往往存在著無法摒除的弊端。上世紀(jì)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物誘導(dǎo)抗性受到關(guān)注，激發(fā)子作為誘導(dǎo)植物抗性的主要因子，愈發(fā)受到關(guān)注。因 此從該病原菌中尋找出具有新活性，新功能的有效物質(zhì)已成為國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。作為我國水稻主要病害的稻瘟菌，其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為激發(fā)子是一種重要的效應(yīng)分子。它通過識別并作用植物細(xì)胞表面或亞細(xì)胞組分的受體分子來傳遞病原菌的激發(fā)子信號，啟動(dòng)植物的防衛(wèi)系統(tǒng)，誘導(dǎo)植物的局部組織產(chǎn)生過敏性細(xì)胞壞死，并通過局部細(xì)胞信號物質(zhì)的系統(tǒng)傳遞使植物最終產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。目前國內(nèi)外研究稻瘟菌激發(fā)子并不是很多。已經(jīng)從稻瘟菌中分離出一些能夠引起植物抗病反應(yīng)或致使植物發(fā)病的活性成分。如早在1993年H. Kanon, M. Haga等就在稻痕菌的細(xì)胞壁中分離到一種糖蛋白激發(fā)子(H. Kanon, M. Haga等，J. Pesticide Sci. ,993,18 :299-308)。1995年,德國的U. Schaffrath等從稻痕菌中分離到一個(gè)約15. 6kDa的糖蛋白，將該糖蛋白注入水稻葉片中，可以有效得提高水稻抗稻痕菌的能力(U. Schaffrath等，Physiological and Molecular Plant Pathology,1995,46,293-307)。1998 年 J. Koga等從稻痕菌中分離出兩種不飽和脂肪酸激發(fā)子(J. Koga等，The Journal of BiologicalChemistry,1998,48,273)。國內(nèi)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李云峰等人從稻瘟菌細(xì)胞壁中分離出一個(gè)約66kDa的糖蛋白激發(fā)子，該糖蛋白能夠誘導(dǎo)水稻葉片過氧化物酶與苯丙氨酸解氨酶活性升高。經(jīng)熱、胰蛋白酶和過碘酸鈉處理后的生物活性檢測結(jié)果表明此蛋白的活性位點(diǎn)為糖基部分(李云鋒等，植物病理學(xué)報(bào)2004，34 (2) :127 132)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的徐峰等稻瘟菌的細(xì)胞內(nèi)獲得了一個(gè)40kDa的蛋白激發(fā)子。該蛋白能夠增強(qiáng)植物的生長質(zhì)量(ActaAgriculturae Boreali-Sinica,2006,21 :1_5)。所有已公開發(fā)表的文獻(xiàn)表明，稻瘟菌確實(shí)可以產(chǎn)生激發(fā)子，引起植物的防御反應(yīng)提高植物的抗性。雖然該菌產(chǎn)生的激發(fā)子性質(zhì)和種類各不相同，但是它們的蛋白質(zhì)序列和基因序列報(bào)道的很少，所以尋找一種新的蛋白質(zhì)激發(fā)子，明確它的序列信息為揭示功能和進(jìn)一步提高植物的抗性是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的稻瘟菌分離蛋白質(zhì)及其基因序列和該蛋白及其基因的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明所述的稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株已經(jīng)于2012年2月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，登記入冊編號CGMCC No 5773,分類命名為稻痕菌(Magnaporthe oryzae)。一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明還涉及上述蛋白質(zhì)在提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明蛋白質(zhì)在提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中的應(yīng)用，其中，所述植物為煙草和水稻。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列為下列所述之一(I)編碼氨基酸序列如SED ID NO 2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列；(2)與(I)中多核苷酸序列根據(jù)堿基配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。本發(fā)明分離的多核苷酸，其中編碼氨基酸序列如SED ID NO :2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。本發(fā)明還涉及一種重組載體，其含有上述分離的多核苷酸。本發(fā)明重組載體，其中所述載體為在pET_28a(+)載體的BamHl/位點(diǎn)和Sall位點(diǎn)間插入上述分離的多核苷酸的重組載體。一種遺傳工程的宿主細(xì)胞，其含有上述重組載體。本發(fā)明遺傳工程的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為含有上述重組載體的大腸桿菌Transetta (DE3)。本發(fā)明的蛋白質(zhì),是指來自稻痕菌(Magnaporthe oryzae)的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或菌體的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為該種蛋白質(zhì)可以明顯的提高植物的抗性，濃度低起效快，10μΜHis-MoHripl溶液處理水稻葉片3d后再接種稻瘟菌，對稻瘟菌發(fā)病的抑制率可以達(dá)到63. 89%。該蛋白質(zhì)為提高植物的抗病性提供了新的途徑，因而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為粗蛋白通過HP Q HiTrap 陰離子交換柱的色譜圖，實(shí)線為吸收值，虛線為NaCl濃度。圖2為經(jīng)過MoHripl處理和水處理(對照)的煙草懸浮細(xì)胞的pH值變化。圖3為本發(fā)明所得克隆表達(dá)的分離的蛋白質(zhì)序列，其中下劃線部分為通過質(zhì)譜獲得的肽段序列。圖4為分別經(jīng)過MoHripl處理和水處理(對照)的水稻苗接種稻瘟菌孢子20天 后的照片。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明特點(diǎn)。實(shí)施例I稻瘟菌的培養(yǎng)及發(fā)酵液制備將稻痕菌(Magnaporthe oryzae)菌株劃線菌塊接種于西紅柿燕麥片培養(yǎng)基西紅柿燕麥片培養(yǎng)基的制備方法為取燕麥片30克,加水800毫升煮沸30分鐘,濾去燕麥殘?jiān)?，另取西紅柿兩個(gè)，打碎榨汁，取150毫升西紅柿汁加入燕麥濾液中，補(bǔ)足水至1000毫升，加瓊脂15克，溶化后分裝，121°C滅菌30分鐘平板，28°C培養(yǎng)2周，挑去菌落邊緣處接種于200mL盛有YPD液體培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基的制備方法為10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖(北京化工廠，分析純)，加去離子水至1L的500ml三角瓶中，26°C、130r/min培養(yǎng)14天，得到稻瘟菌的發(fā)酵液。實(shí)施例2粗蛋白質(zhì)激發(fā)子的制備和監(jiān)測取實(shí)施例I中所得的發(fā)酵液，在4°C、5000rpm條件下離心Ih(或13000rpm，30min),收集上清液,用O. 45mm的濾膜(Whatman產(chǎn))抽濾兩次,直至沒有菌體，得到發(fā)酵 上清液。加入硫酸銨粉末，使發(fā)酵上清液中硫酸銨終濃度為80%來沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)，4°C透析48h并凍干，得到除鹽后的胞外蛋白質(zhì)，即粗蛋白。最后將獲得的胞外蛋白質(zhì)溶解到Mes-NaOH緩沖液(20mM，pH 6.0)中，得粗蛋白溶液，其中胞外蛋白質(zhì)終濃度為lOymol/L。蛋白質(zhì)含量用 BCATM protein assay kit (Thermo Scientific)經(jīng) GF-M2000 型酶標(biāo)儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)在波長590nm處測定。生物活性的監(jiān)測以生長2個(gè)月，具有5-7片真葉的煙草為材料，分別以0. 2mM、pH
6.O的Mes-NaOH緩沖液和10 μ mol/L牛血清蛋白溶液為對照，粗蛋白溶液濃度為IOymol/L，利用ImL不帶針頭的注射器，將50 μ LMes-NaOH緩沖液、50 μ L BSA溶液、50 μ L粗蛋白溶液從葉子背面分別注射進(jìn)葉片中去。經(jīng)過24h觀察是否有壞死斑形成。結(jié)果注射粗蛋白溶液的葉片，注射部位6h后出現(xiàn)水潰斑，12h后注射處葉片變得透明較薄一些，24h后可以呈現(xiàn)典型的過敏反應(yīng)，有壞死斑形成。對照并無任何反應(yīng)，和正常葉片一樣。實(shí)施例3粗蛋白溶液中蛋白質(zhì)激發(fā)子的分離純化及生物活性測定使用AKTAexplore 10 (GE Healthcare)蛋白質(zhì)純化儀對所得的粗蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化，樣品首先通過HP Q HiTrap 陰離子交換柱(GE Healthcare)，用NaCl進(jìn)行線性洗脫(0%-100%，30min)，獲得到蛋白質(zhì)洗脫峰(見圖1)，將各蛋白質(zhì)洗脫峰組分進(jìn)行生物活性的檢測，所應(yīng)用的各組分中使蛋白質(zhì)濃度為Ιθμπιο /L，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)峰a2(如圖I所示)可以強(qiáng)烈的引起煙草的過敏反應(yīng)；將該蛋白質(zhì)峰a2的組分再通過15% Native-PAGE、割膠純化和電洗脫的進(jìn)一步純化，得到有活性的單一蛋白質(zhì)，以上純化過程中需要監(jiān)測蛋白質(zhì)激發(fā)子的活性，監(jiān)測方法是按實(shí)施例2中生物活性的監(jiān)測方法進(jìn)行的。該純化所得單一蛋白質(zhì)經(jīng)15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一帶，說明蛋白質(zhì)純度高。該蛋白質(zhì)表觀分子量為15kD(pI = 4. 53)，將此蛋白質(zhì)激發(fā)子命名為MoHripl (Magnaporthe oryzae Hypersensitive response-inducing Protein I)。用實(shí)施例2中生物活性的監(jiān)測方法對不同濃度的MoHripl (30 μ M，10 μ M，5 μ M，I μ M，500ηΜ,ΙΟΟηΜ，IOnM)進(jìn)行活性監(jiān)測，10 μ M的MoHripl能夠引起典型過敏性反應(yīng)，最低能引起過敏反應(yīng)的蛋白濃度為5 μ Μ。結(jié)果分離純化的MoHripl可以使煙草形成過敏反應(yīng)的壞死斑。
分離純化得到的MoHripl對植物引起的一些反應(yīng)(I)氧爆發(fā)的測定氧爆發(fā)指的是活性氧物質(zhì)的積累，活性氧物質(zhì)包括H2O2。本實(shí)驗(yàn)通過監(jiān)測H2O2的積累來說明氧爆發(fā)的過程。氧爆發(fā)(Reactive Oxygen Species,R0S)在激發(fā)子誘導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中起著非常重要的作用，它們都參與調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞編程性死亡，直接或間接殺死入侵的病原菌，作為第二信使可在轉(zhuǎn)錄水平上激活和調(diào)控植物體內(nèi)各種防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)以及參與系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance, SAR)的建立等。 a、對煙草懸浮細(xì)胞的作用煙草懸浮細(xì)胞(tobaccoBY-2)來自 Nicotiana tabacum cv. Xanthi,由中國農(nóng)業(yè) 大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院贈(zèng)送。煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基MS液體培養(yǎng)基(MS+100mg/ml，肌醇；0. 2%,KH2PO4 ；0. 2mg/ml,2,4-D ；lmg/ml, VBl ;3%鹿糖),121 °C高壓蒸汽滅菌 15min,室溫保存。懸浮細(xì)胞在25°C、130rpm的搖床中培養(yǎng)，使細(xì)胞保持在指數(shù)增長期。取上述所得煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收集重懸于緩沖液(緩沖液配方為175mM甘露醇，O. 5mM氯化鈣，O. 5mM硫酸鉀(北京化工，分析純)，IOmM羥乙基哌嗪乙磺酸(HERES，Sigma)pH 5.75)中，使煙草細(xì)胞濃度為O. lg/mL(細(xì)胞濕重/體積)，孵育Ih在24°C，150rpm。然后取250 μ L懸浮細(xì)胞加入HERES緩沖液(緩沖液配方為175mM甘露醇，O. 5mM氯化鈣，O. 5mM硫酸鉀(北京化工，分析純)，IOmM羥乙基哌嗪乙磺酸(HERES，Sigma) pH 5. 75，同時(shí)添加O. 3mM發(fā)光氨(Luminol))中，同時(shí)加入MoHripl使其終濃度為10 μ M，開始用化學(xué)發(fā)光檢測儀(Promega)，檢測細(xì)胞所生成的活性氧。b、對煙草葉片的作用煙草葉片處理方法如實(shí)施例2生物活性監(jiān)測中的方法，MoHripl濃度為10 μ M，經(jīng)過24h觀察。取處理的葉片用蒸餾水洗凈后將其置于2mL管中，取適量DAB(3，3，-Diaminbenzidine) (Sigma)染液(lmg. mlΓ1, pH 3· 8),用 NaOH 調(diào) pH 值至 5· 8 后，將染液加入預(yù)處理的葉片，室溫避光保存8小時(shí)。隨后去除各管中染液，加入95%乙醇，沸水浴數(shù)分鐘，去除各管液體，再加入無水乙醇并沸水浴直至葉片綠色完全脫去為止，再次吸出各管液體，將脫去綠色的浸泡在70%甘油中，趕出細(xì)胞間氣泡，用顯微鏡觀察。C、對水稻葉片的作用取8周水稻葉片，裁剪成直徑為I厘米的圓盤狀，至于盛有100微升蒸餾水的96孔板中，避光浸泡6-8小時(shí),隨后分別向96孔板中加入100微升發(fā)光氨(luminol, Sigma)、I微升辣根過氧化物酶(HRP，Sigma)和10微升濃度為10 μ M的MoHripl，立即利用化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer, Promega)定量檢測活性氧物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光值。結(jié)果a、MoHripl處理約30min后,煙草懸浮細(xì)胞出現(xiàn)氧爆發(fā)現(xiàn)象；b、在MoHripl處理的煙草葉片部位有明顯的褐色沉積物質(zhì)出現(xiàn)，并且處理部位的氣孔上的保衛(wèi)細(xì)胞也出現(xiàn)紅褐色沉淀；c、MoHripl處理水稻葉片2_3分鐘，出現(xiàn)明顯氧爆發(fā)現(xiàn)象。(2)細(xì)胞培養(yǎng)基的堿化鈣離子流動(dòng)普遍被認(rèn)為是激發(fā)子的早期反應(yīng)之一，而鈣離子的流動(dòng)勢必會(huì)改變細(xì)胞環(huán)境的PH值變化，本實(shí)驗(yàn)檢測了激發(fā)子處理后細(xì)胞培養(yǎng)基的堿化情況。
取濃度為O. lg/mL的煙草懸浮細(xì)胞，重新轉(zhuǎn)接到新的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方見氧爆發(fā)的測定中對煙草懸浮細(xì)胞的作用部分)中，25°C，150r/min培養(yǎng)3天后，力口入蛋白質(zhì)激發(fā)子MoHripl處理，使MoHripl終濃度為10 μ M，繼續(xù)搖培，以水處理為對照，此后每過IOmin用pH劑測定培養(yǎng)基的pH,直到處理后180min。結(jié)果蛋白質(zhì)激發(fā)子MoHripl能夠引起細(xì)胞培養(yǎng)基的堿化,在處理后IOmin培養(yǎng)基的PH明顯提高(如圖2所示)。(3)胼胝質(zhì)的沉積、酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累胼胝質(zhì)的沉積、酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累被認(rèn)為是典型激發(fā)子引起的宿主細(xì)胞的次級反應(yīng)，這些次級代謝物的生成或者積累與宿主防御系統(tǒng)相關(guān)。胼胝質(zhì)、酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累可以增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的韌性，抵御病原菌的入侵。a、對煙草葉片作用 煙草葉片處理方法如實(shí)施例2生物活性監(jiān)測中的的方法，經(jīng)10 μ M的MoHripl處理24h后的葉片，將葉片放入緩沖液(1%戊二醛，5mM檸檬酸，90mM磷酸氫二鈉(北京化工，分析純)pH 7.4)過夜。然后放入無水乙醇中煮lOmin，在放入50%乙醇中，接著轉(zhuǎn)入緩沖液(67mM磷酸氫二鉀(北京化工，分析純)，pH 12)。在染色液(O. 1%苯胺藍(lán)(Sigma)，67mM磷酸氫二鉀(北京化工，分析純)，PH 12)染色lh，放入70%甘油固定觀察。b、對煙草懸浮細(xì)胞的作用取O. 5g煙草懸浮細(xì)胞，加入MoHripl使其終濃度為IOuM,處理108h后，用6mol/L的2. 5w/v%間苯三酌· (Sigma)處理,立即觀察。結(jié)果a、用MoHripl處理的煙草葉片，細(xì)胞壁出現(xiàn)胼胝質(zhì)星狀的積累；b、處理過的煙草懸浮細(xì)胞有木質(zhì)素的積累。實(shí)施例4蛋白質(zhì)激發(fā)子MoHripl肽段序列的獲得純化的MoHripl蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳檢測為單點(diǎn)，切取蛋白質(zhì)單點(diǎn)分別經(jīng)IOng/ μ I測序級修飾膜蛋白質(zhì)酶(Sequencing Grade Modified Trypsin, Promega) 30°C、ρΗ7· 5 酶解30min lh，ESI-MS/MS為英國Micromass公司的Q-T0F2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。配備納升噴霧源。所有測定均在正離子方式下進(jìn)行。質(zhì)譜儀用Glu-fib的串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正，質(zhì)量準(zhǔn)確度小于O. IDa。霧化氣為氮?dú)?，碰撞氣體為氬氣。源溫80°C，錐孔電壓50V。TOF加速電壓9. lkV。MCP檢測器電壓為2150V。毛細(xì)管電壓800V。獲得該蛋白質(zhì)的多個(gè)肽段序列，肽段序列如下所示(l)NTPTNVNFK ； (2)⑶SAYSF。實(shí)施例5蛋白質(zhì)激發(fā)子MoHripl編碼基因的克隆根據(jù)質(zhì)譜測序結(jié)果和密碼子的簡并性設(shè)計(jì)引物為MoHripl-正向5’ -ATGCGCTTCGCCACCATCACCG-3’ 和 MoHripl-反向 5’ -CTAAGCGGAGCCGTCAATGGCAATA-3’，并以稻瘟菌株抽提的mRNA為模板，選用HiFi反轉(zhuǎn)錄聚合酶進(jìn)行PT-PCR(94°C 3min ；94°C30s, 65°C 30s, 72°C 30s,35cycles ；72°C IOmin ;4°C °^ )，擴(kuò)增出 429bp 的 DNA 片段，其中包括429bp的完整開放閱讀框，將其命名為MoHripl基因，該基因的順序如SEQ ID N0:1所不。表達(dá)SEQ ID NO :1可得到的氣基酸序列如SEQ ID NO :2所不的蛋白質(zhì)，如圖3所不，SEQ ID NO : 2包含有實(shí)施例5中獲得的2條肽段。實(shí)施例6 MoHripl基因的原核表達(dá)和純化(I)表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)激發(fā)子基因MoHripl的特異性引物，引入帶有酶切保護(hù)堿基的酶切位點(diǎn)，正向引物5 ’ -GGATCCATGCGCTTCGCCACCATCACCG-3 ’，(下劃線為 BamHl 的酶切序列)，反向引物5’ -GTCGACCTAAGCGGAGCCGTCAATGGCAATA-3，,(下劃線為 Sall 的酶切序列)，擴(kuò)增全長 MoHripl 基因(94°C 3min ；94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 30s,35cycles ；72°C IOmin ；40C- ) o先將MoHripl基因目的片段克隆到pMD18-T simple克隆載體，確認(rèn)測序正確后，經(jīng)BamHl和Sall酶切后，將MoHripl片段克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體(Novagen)的BamHl/和Sall位點(diǎn)，熱激發(fā)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans 5 a (Transgene),挑取陽性克隆,搖菌并提取質(zhì)粒，酶切并測序驗(yàn)證。(2)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(I)中所獲得表達(dá)載體用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transetta(DE3)中。質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌株的方法同(I)，驗(yàn)證正確后，進(jìn)行表達(dá)。將驗(yàn)證正確的重組表達(dá)菌株過夜活化，同時(shí)取pET-28a空質(zhì)粒的菌株作為對照。分別取ImL過夜培養(yǎng)液加入到含有100 μ g/mL卡那霉素的IOOmL LB液體培養(yǎng)基中(I %接種量)，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)2 3h培養(yǎng)至OD600為O. 6 O. 8。加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度為O. 2mmol/L)，16°C，220r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。高速離心，收集菌體加入緩沖液。經(jīng)超聲破碎菌體 后，4°C高速離心，收集上清，得到重組蛋白液。取20 μ L上清液，加入5 μ L 5 X SDS上樣緩沖液(變性)重懸菌體，沸水浴中加熱IOmin, 13000r/min離心IOmin,取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮蘭R250染色，觀察表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)過SDS-PAGE檢測，獲得一個(gè)分子量約18_kDa的包含組氨酸的融合表達(dá)蛋白(His-MoHripl)。(3)重組蛋白的純化利用Akta explorerlO蛋白純化儀進(jìn)行重組蛋白的純化。選用Hitrapchelating Column柱進(jìn)行親和層析,先用清洗緩沖液平衡親和柱；取步驟(2)中獲得的重組蛋白液5mL進(jìn)樣，流速為lmL/min，淋洗至基線后，洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫；收集的各洗脫峰，在大量體積的磷酸鹽緩沖液中4°C透析過夜，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮蘭染色檢測蛋白的純度。生物活性測定采用實(shí)施例2中方法測定重組蛋白質(zhì)激發(fā)子對煙草的活性。結(jié)果獲得純化的約18KD的融合表達(dá)蛋白(His-MoHripl重組蛋白)。實(shí)施例7重組蛋白(His-MoHripl)在煙草上引起的反應(yīng)用ImL不帶針頭的注射器，將約50mL，5μΜ融合表達(dá)蛋白(His-MoHripl)從葉子背面分別注入煙草葉片中，同時(shí)，以相同濃度的pET-28a(+)空質(zhì)粒表達(dá)蛋白及Mes-NaOH(20mM, pH 6.0)溶液作為對照，分別從葉子背面注入不同的煙草葉片中。24h后觀察葉片上的反應(yīng)。如實(shí)施例3中(I)的方法，觀察重組蛋白誘導(dǎo)H2O2在處理葉片上的積累；如實(shí)施例3中(2)的方法，觀察重組蛋白引起煙草細(xì)胞培養(yǎng)基的堿化。結(jié)果重組蛋白(His-MoHripl)能夠引起煙草葉片發(fā)生過敏反應(yīng)；His_MoHripl使處理煙草葉片獲得H2O2積累，產(chǎn)生紅褐色沉淀；HiS-MoHripl使處理的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基堿化，培養(yǎng)基PH最高的時(shí)間和天然純化的MoHripl引起的基本一致。實(shí)施例8重組蛋白(His-MoHripl)在水稻上引起的反應(yīng)(I)如實(shí)施例3中(I)的方法，定量檢測重組蛋白誘導(dǎo)H2O2在處理水稻葉片上的積累。結(jié)果重組蛋白His-MoHripl誘導(dǎo)水稻葉片產(chǎn)生活性氧物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光值與天然純化的MoHripl誘導(dǎo)的基本一致。(2)水稻抗性相關(guān)基因熒光定量RT-PCR分析取所需的樣品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol,室溫5min靜置，12000rpm離心5min,棄沉淀；按200 μ L氯仿/mL Trizol,震蕩混勻15min放置,4 V，12000rpm離心15min,吸取上層，加入O. 5mL異丙醇/mL Trizol,混勻，-20°C靜置20min ;離心，75%乙醇漂洗,離心去除乙醇，5-10min晾干。加入diethypyrocarbonate (縮寫為DEPC)處理水，測RNA濃度，調(diào)成相同濃度。第一鏈cDNA 的合成，米用 TransGen 公司的 TransScript Two-Step RT-PCR Kit0 取 500ng 總 RNA,按照試劑盒說明書，用 TransScript RT/RI Enzyme Mix,以Anchored Oligo(dT) 18為引物，42°C孵育30min,85°C加熱5min使酶失活。取I μ L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR，.Osactin為內(nèi)標(biāo)基因，以抗性相關(guān)基因特異引物做PCR(OsPR-Ia基因F 5 ' -GTATGCTATGCTACGTGTTTATGC-3 ' , R :5 ' -GCAAATACGGCTGACAGTACAG-3 ' ;OsPR-1Oa基因 F:5' -GGCTTGGTCGACGACATTG-3' , R 5/ -CAGGGTTAAGCTTCATGGTGTAGA-3' ；0sL0X2基因 F:5' -AGATGAGGCGCGTGATGAC-3' , R 5/ -CATGGAAGTCGAGCATGAACA-3' ;0sA0S2 基因 F :5 ' -TACCAGCCGTGCGCCACCAG-3 '，R :5 ' -AGGACGGAGCTGGTTGAGTGG-3 ' ;OsEDSI 基因 F :5 ' -CCCCGCATACCACTTACT-3 '，R :5 ' -TGTTGATGAAACCACTCCC-3 ' ；OsPALI 基因F :5 ' -GGTGTTCTGCGAGGTGATGA-3 '，R :5 ' -AGGGTGGTGCTTCAGCTTGT-3 ' ；OsNHl 基因 F :5' -ATCTTGATGATGCGTTTGC-3' ,R 5/ -TCAGCTTGCTCCAGTATTTC-3')，觀察抗性相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)過熒光定量PCR結(jié)果可見His-MoHripl在處理煙草葉片后2天，就可以誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)。(3)誘導(dǎo)減少稻瘟菌對水稻的危害將10mL、純化后的His-MoHripl (10 μ Μ)溶液均勻噴灑在15株水稻葉片上,三天后接種稻瘟菌，以噴灑Mes-NaOH緩沖液并三天后接種稻瘟菌的15株水稻葉片作對照，將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(見圖4)。稻瘟菌的接種方法為取預(yù)先制備好的稻瘟菌孢子加緩沖液，該緩沖液中含1% TWeen20，使稻瘟菌孢子濃度為2X IO5個(gè)孢子/ml，均勻噴灑在水稻植株上。7天后統(tǒng)計(jì)植株發(fā)病數(shù)。接種稻瘟菌7天后，調(diào)查發(fā)病植株數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率和發(fā)病抑制率。抑制率(％ )=[(對照組發(fā)病植株數(shù)-處理組發(fā)病植株數(shù))/對照組發(fā)病植株數(shù)]XlOO發(fā)病率(％ )=(發(fā)病植株數(shù)/植株總數(shù))X 100結(jié)果如下表。
處理時(shí)間發(fā)病植株數(shù)(株)發(fā)病率(％)
(天)對照處理對照處理抑制百分比(％)
712±2.6458 4.33±1.1547 * 75±16.5427±7.22 *63.89
表中*表示在P < O. 05水平時(shí)，與對照組相比，處理組具有顯著差異性。上述結(jié)果表明，重組蛋白質(zhì)激發(fā)子His-MoHripl可以誘導(dǎo)減少稻瘟菌對水稻的危害，在用IOyM HiS-MoHripl溶液處理水稻葉片3d后再接種稻瘟菌，對發(fā)病的抑制率可以達(dá)到 63. 89%。以上實(shí)施例僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限 定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)在提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為煙草和水稻。
4.ー種多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列為下列所述之ー (1)編碼氨基酸序列如SEDID NO 2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列； (2)與(I)中多核苷酸序列根據(jù)堿基配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。
5.ー種根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在干，編碼氨基酸序列如SED ID NO2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
6.—種重組載體,其特征在于,含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述載體為在pET-28a(+)載體的BamHl/位點(diǎn)和Sall位點(diǎn)間插入權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸的重組載體。
8.一種遺傳工程的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6或7所述的重組載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的遺傳工程的宿主細(xì)胞，其特征在干，所述宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求6或7所述的重組載體的大腸桿菌Transetta (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明稻瘟菌分離蛋白質(zhì)及其基因、應(yīng)用涉及具有多于20個(gè)氨基酸的肽、編碼該肽段的核苷酸序列以及其應(yīng)用，該稻瘟菌分離蛋白能夠提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，該種蛋白質(zhì)可以明顯的提高植物的抗性，濃度低起效快，10μM His-MoHrip1溶液處理水稻葉片3d后再接種稻瘟菌，對發(fā)病的抑制率可以達(dá)到63.89％。該稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)分離蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明還涉及一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
文檔編號C12R1/19GK102675434SQ20121003565
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者劉崢, 曾洪梅, 楊秀芬, 袁京京, 邱德文, 郭立華, 陳銘佳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所