專利名稱：一種聾病易感基因slc26a4 ivs7-2a>g熒光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)聾病易感基因SLC26A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G及Amelogenin 基因座的熒光檢測(cè)試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
SLC26A4基因與弧立的大前庭水管綜合征及Pendred綜合征(前庭水管擴(kuò)大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫)的關(guān)系密切，臨床上表現(xiàn)為先天性或后天性耳聾，耳聾發(fā)生或加重與外傷、感冒有關(guān)。通過(guò)顳骨CT掃描可以得出結(jié)論，但目前由于設(shè)備和專業(yè)人員的限制，中國(guó)大部分地區(qū)的醫(yī)院不能進(jìn)行高分辨率的顳骨CT掃描，導(dǎo)致許多地區(qū)無(wú)法診斷大前庭水管綜合征。通過(guò)對(duì)SLC26A4基因的檢測(cè)，則可以在全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)80 %以上大前庭水管綜合征的準(zhǔn)確診斷，并先于CT檢查發(fā)現(xiàn)和確診大前庭水管綜合征，這一方法可以避免放射線檢查的輻射問(wèn)題，更易為患者家屬接受，并且由于基因診斷操作能夠批量進(jìn)行，可以在大標(biāo)本范圍內(nèi)進(jìn)行篩查。大量研究表明，存在于中國(guó)人群突變熱點(diǎn)區(qū)域?yàn)镾LU6A4基因外顯子 8的側(cè)翼序列的IVS7-2A > G0目前常用的基因檢測(cè)方法有直接測(cè)序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、變個(gè)生高效液才目色 i普分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽(yáng)性多等問(wèn)題。采用熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過(guò)帶熒光標(biāo)記物的引物對(duì)SLC26A4基因的IVS7-2A > G位點(diǎn)特異性的擴(kuò)增，并在此引物中摻入核酸類似物提高引物的Tm值，進(jìn)一步增強(qiáng)引物的特異性，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)耳聾基因位點(diǎn)的檢測(cè)。該方法靈敏度高、判讀清晰準(zhǔn)確，僅需采取少量血樣或口腔拭子樣本，即可進(jìn)行檢測(cè)，采樣方便尤其適合新生嬰幼兒樣本的采集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種聾病易感基因SLU6A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G熒光檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案一種聾病易感基因SL(^6A4突變熱點(diǎn) IVS7-2A > G熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，2對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括用于基因分型的對(duì)應(yīng)于SLC26A4基因突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G檢測(cè)和Amelogenin性別鑒定基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物的混合物和內(nèi)標(biāo)R0X-300 ；
使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的PH值為 8. 0-9. 0，鎂離子濃度為1.5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為 0. 1-0. 4U/ μ L，2對(duì)引物混合物中的單對(duì)引物終濃度為0. 2-0. 4 μ M0使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增SLC26A4基因的IVS7-2A > G和Amelogenin基因座。用于SLC26A4基因IVS7(-2)位點(diǎn)A>G突變檢測(cè)的引物為SEQ NO. 01和SEQ NO. 02. X。SEQ NO. 02. X為下列摻入了 LNA核苷的引物中的任意一條(LNA核苷以黑體字表示)SEQ NO. 02. 1 :5，-G T TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘SEQ NO. 02. 2 :5，-GTTTTTAACATCT T TTGTTTTATTTAG-3，SEQ N0. 02. 3 :5，-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT J G-3，。用于Amelogenin基因座檢測(cè)的弓| 物為SEQ N0. 03 5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，、SEQ NO. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。所述的2對(duì)引物，其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，所用的熒光染料可以為相同或不同的熒光素。所述復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。其中所檢測(cè)的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對(duì)來(lái)源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ；所述的來(lái)源樣本為來(lái)源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR儀上進(jìn)行， 擴(kuò)增程序:94-980C l-5min J6-32 個(gè)循環(huán)的 94_98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。對(duì)于IVS7-2位點(diǎn)突變的檢出，使用的帶熒光標(biāo)記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了引物的Tm值，縮短了引物長(zhǎng)度，從而增加了引物的靈敏度和特異性，防止假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)。對(duì)于Amelogenin的檢出，一方面是內(nèi)參的作用指示模板DNA是否有效或濃度范圍；另一方面能有效指示是否存在PCR產(chǎn)物污染，防止因污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性。


圖1是本發(fā)明的試劑盒(采用不同熒光染料標(biāo)記)對(duì)突變個(gè)體血斑來(lái)源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖2是本發(fā)明的試劑盒(采用不同熒光染料標(biāo)記)對(duì)正常個(gè)體血斑來(lái)源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；圖3是本發(fā)明的試劑盒(采用相同熒光染料標(biāo)記)對(duì)突變及正常個(gè)體血斑來(lái)源 DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果。圖4是經(jīng)修飾和未修飾的引物對(duì)同一男性確證病例不同濃度DNA的分型結(jié)果。圖5是經(jīng)修飾和未修飾的引物對(duì)同一男性正常個(gè)體不同濃度DNA的分型結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1聾病易感基因SLC26A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)突變及正常個(gè)體的DNA樣本，用于聾病易感基因SLC26A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G檢測(cè)的引物采用藍(lán)色熒光染料6-FAM標(biāo)記，用于Amelogenin基因座擴(kuò)增的引物采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ；內(nèi)標(biāo)采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為R0X。1、待測(cè)樣本100份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴(kuò)增-測(cè)序”的技術(shù)方法對(duì)SLC26A4 突變熱點(diǎn)IVS7-2位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)測(cè)序檢測(cè)，其中突變樣本5份。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下1 3mm血斑置于1. 5mL離心管中，加入SdH2O lmL，振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5 % Chelex-IOO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴 IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min，上清中為提取的DNA。3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析3. IPCR 擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種聾病易感基因SLC26A4 IVS7-2A > G熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括DNA 聚合酶及其緩沖溶液、擴(kuò)增IVS7-2A > G&Amel0genin基因座的引物、及基因突變位點(diǎn) IVS7-2A > G和Amelogenin基因座的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于突變熱點(diǎn)IVS7-2A> G檢測(cè)的引物為 SEQ ID NO. 01 和 SEQ ID NO. 02. X ；SEQ NO. 01 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’SEQ NO. 02. 1 :5，-G T TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘SEQ NO. 02. 2 5' -GTTTTTAACATCT T TTGTTTTATTTAG-3’SEQ N0. 02. 3 :5，-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT A G"3'其中LNA核苷以黑體字表示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述Amelogenin基因座檢測(cè)的引物為SEQ N0. 03 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，SEQ N0. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的用于IVS7-2A> G和 Amelogenin擴(kuò)增的引物，每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述突變熱點(diǎn)IVS7-2A> 6檢測(cè)的引物和用于Amelogenin基因座擴(kuò)增的引物可以采用相同或不同的熒光染料標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)選用不同于上述的熒光染料標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述IVS7-2A> 6和Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
7.一種快速檢測(cè)聾病易感基因SLU6A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G的方法，其特征在于通過(guò)熒光引物PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測(cè)聾病易感基因SLU6A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A > G及 Amelogenin基因座；用于SLC26A4基因IVS7-2位點(diǎn)A > G突變檢測(cè)的引物為SEQ NO. 01 和SEQ NO. 02. X所示；用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物如SEQ N0. 03、SEQ NO. 04所示； 所述IVS7-2A > 6和Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)聾病易感基因SLC26A4突變熱點(diǎn)IVS7-2A＞G的熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增前試劑和擴(kuò)增后試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述擴(kuò)增后試劑包括基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明以IVS7-2A＞G、Amelogenin基因座為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)上述耳聾易感基因位點(diǎn)的擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳檢測(cè)，與基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的對(duì)比，即可篩選出含有上述位點(diǎn)突變的個(gè)體。對(duì)聾病易感基因的檢測(cè)，尤其是對(duì)新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義；在耳聾基因篩查領(lǐng)域中首次復(fù)合采用了熒光標(biāo)記技術(shù)、LNA核苷單體摻入-引物修飾技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)耳聾基因位點(diǎn)IVS7-2A＞G的高靈敏度特異性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559910SQ20121003312
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者萬(wàn)戈江, 夏子芳, 步訊, 魏宏泉 申請(qǐng)人:北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司