專利名稱：一種聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)對(duì)聽力語言殘疾者進(jìn)行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。 因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發(fā)病機(jī)制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計(jì)劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進(jìn)步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認(rèn)識(shí)到聾病易感基因突變?cè)诰S護(hù)聽力健康和發(fā)現(xiàn)聽力異常中的重要性。在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關(guān)基因中，GJB2是最常見的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種突變類型，然而，不同種族GJB2基因常見的突變形式不同。在中國(guó)常見的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74. 14%，約22. 2%的中國(guó)耳聾患者與該突變有關(guān)。進(jìn)行婚育前、產(chǎn)前、新生兒 GJB2 235delC耳聾基因檢查，對(duì)前期指導(dǎo)和提供及時(shí)的救助都具有重要意義。目前常用的基因檢測(cè)方法有直接測(cè)序(direct sequencing，DS)、連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽性多等問題。采用熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、多重PCR復(fù)合擴(kuò)增，通過帶不同熒光標(biāo)記物的多對(duì)引物同時(shí)對(duì)GJB2 235delC特異性的擴(kuò)增，并在這些引物中摻入核酸類似物以提高引物的Tm值，進(jìn)一步增強(qiáng)引物的特異性，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)該耳聾基因位點(diǎn)的檢測(cè)。該方法靈敏度高、判讀清晰準(zhǔn)確、采樣方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC及Amelogenin基因座熒光檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案一種檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，5對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括內(nèi)標(biāo)R0X-300和用于基因分型的各基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物；
使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的pH值為
8.0-9. 0，鎂離子濃度為1.5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為 O. 1-0. 4U/ μ L，2對(duì)引物混合物中的單對(duì)引物終濃度為O. 2-0. 4 μ M0使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增 GJB2 235delC 及 Amelogenin 基因座。用于GJB2 235delC檢測(cè)的引物為SEQ NO. I :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’SEQ NO. 2 :5’ -GCCTGCAGCTGATCTTCGT-3’其中LNA核苷以斜體字表示。用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物為SEQ NO. 3 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’SEQ NO. 4 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。所述的2對(duì)引物，其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，所用的熒光染料可以為相同或不同的熒光素。所述復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。其中所檢測(cè)的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對(duì)來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序94-98°C l-5min ;26-32 個(gè)循環(huán)的 94-98°C 15_60s，55-65。。15-60s,72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。使用的帶熒光標(biāo)記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了引物的Tm值，縮短了引物長(zhǎng)度，從而增加了引物的靈敏度和特異性，防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)。對(duì)于Amelogenin的檢出，一方面是內(nèi)參的作用指示模板DNA是否有效或濃度范圍；另一方面能有效指示是否存在PCR產(chǎn)物污染，防止因污染產(chǎn)生的假陽性。


圖I是本發(fā)明的試劑盒對(duì)突變個(gè)體、正常個(gè)體血斑來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果；未經(jīng)修飾的引物對(duì)正常個(gè)體血斑來源DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)突變及正常個(gè)體的DNA樣本，用于聾病易感基因GJB2 235delC檢測(cè)的引物采用綠色熒光染料HEX標(biāo)記，用于Amelogenin 基因座擴(kuò)增的引物采用黃色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為TAMRA ;內(nèi)標(biāo)采用紅色熒光染料標(biāo)記，突光標(biāo)記物為ROX。I、待測(cè)樣本100份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴(kuò)增-測(cè)序”的技術(shù)方法對(duì)GJB2235位點(diǎn)進(jìn)行過測(cè)序檢測(cè)，其中突變樣本5份。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL離心管中，加入SdH2O ImL,振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5% Chelex-IOO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴 IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的DNA。3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析3. I PCR 擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴(kuò)增235delC及Amelogenin基因座的引物、內(nèi)標(biāo)和各基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于用于GJB2 235delC檢測(cè)的引物為:SEQ NO. I :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’SEQ NO. 2 :5’ -GCCTGCAGCTGATCTTCGT-3’其中LNA核苷以斜體字表示；用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物為SEQ NO. 03 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’SEQ NO. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒,其特征在于所述GJB2235delC及Amelogenin 基因座的檢測(cè)引物，每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行突光染料標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述GJB2235delC及Amelogenin基因座檢測(cè)的引物可以采用相同或不同的熒光染料標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)選用不同于上述的熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述GJB2235delC及Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
6.應(yīng)用權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)聾病易感基因GJB2235delC的方法，其特征在于通過熒光引物PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC及Amelogenin基因座；用于GJB2 235delC檢測(cè)的引物如SEQ NO. K SEQ NO. 2所示；用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示；所述各基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)聾病易感基因GJB2 235delC熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增前試劑和擴(kuò)增后試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增GJB2 235delC及Amelogenin基因座的引物混合物；所述擴(kuò)增后試劑包括基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明首次復(fù)合采用了熒光標(biāo)記技術(shù)、LNA核苷單體摻入-引物修飾技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)耳聾基因位點(diǎn)GJB2 235delC的高靈敏度特異性同時(shí)檢測(cè)，大大節(jié)約了人力物力和時(shí)間、防止多步操作而產(chǎn)生污染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605052SQ201210033109
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者萬戈江, 夏子芳, 步訊, 魏宏泉 申請(qǐng)人:北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司