專利名稱：一種金霉素降解菌株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金霉素降解菌株的篩選方法，屬于微生物降解抗生素殘留技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金霉素(Chlortetracycline ;Aureomycin),又稱氯四環(huán)素，屬于四環(huán)素類抗生素?；瘜W(xué)名稱為6-甲基-4- ( _■甲氣基)-3,6,10,12,12a~五輕基-I，11- _■氧代_7-氣-I， 4，4a，5，5a，6，11，12a-八氫-2-并四苯甲酰胺，分子式為C22H23ClN2O8，分子量為478. 88，化
學(xué)結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于具體步驟如下1)金霉素降解菌株的分離采集金霉素菌渣與廢水，將菌渣加入到蒸餾水中，混合，提取菌渣浸出液；分別吸取廢水和菌渣浸出液，依次涂布于金霉素含量不同的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于28°C -30°C條件下遮光培養(yǎng)2-7天，得到不同菌落；2)菌株純化將步驟I)分離得到的菌落，分別在含有金霉素的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線，進(jìn)一步分離和純化；此步驟重復(fù)1-2次，直至得到單一菌落；然后將單菌落依次接入含有金霉素的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，置于28°C -30°C，160-170r/min振蕩條件下，遮光培養(yǎng)1_3天，得到單一菌落培養(yǎng)液；3)菌株降解功能驗(yàn)證將步驟2)得到的培養(yǎng)液，分別在金霉素為唯一碳源且金霉素濃度不同的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線，28°C -30°C避光培養(yǎng)2-7天；能夠生長(zhǎng)的菌株即為能夠以金霉素為唯一碳源的降解菌株；4)菌株降解活性測(cè)定將步驟3)得到的能在金霉素為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，分別轉(zhuǎn)接到活化培養(yǎng)基上進(jìn)行活化；然后將活化的菌液按1% -3%的接種量，轉(zhuǎn)接到以金霉素為唯一碳源且濃度適宜的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，28°C -30°C,160-170r/min震蕩暗培養(yǎng)1_3天，最后用高效液相色譜法測(cè)定各菌株對(duì)金霉素的降解率；試管斜面保存不同濃度降解率高的菌株，4V儲(chǔ)存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟I)中菌渣和蒸餾水的添加比例為Ig 10ml，吸取廢水和菌渣浸出液的體積均為200-400 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟I)中培養(yǎng)基中金霉素含量為I. Og/L-15. Og/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟I)中無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基的組成為(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. 2g，CaCl2O. lg，F(xiàn)eSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 2g，瓊脂 13g ;將上述物質(zhì)溶于 1000ml 蒸餾水中，115°C濕熱滅菌15-20min ;在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加金霉素，添加濃度依次為 O. lg/L、l. Og/L,2. Og/L,3. Og/L,4. Og/L,5. 0g/L、10. Og/L 和 15. 0g/L，搖勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟2)中無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基的組成為(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. 2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 5. 0g/L，瓊脂 13g/L ;將上述物質(zhì)溶于 1000ml蒸懼水中，115°C濕熱滅菌15_20min ;倒平板前,加入2. 0g/L金霉素,搖勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟2)中無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成為(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl0.2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 5. Og/L ;將上述物質(zhì)溶于 1000ml 蒸餾水中，115°C濕熱滅菌15-20min，待冷卻到室溫后，加入2. 0g/L金霉素，搖勻。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟3)中無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基組成為(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g， NaClO. 2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g,瓊脂 13g ;將上述物質(zhì)溶于 1000ml 蒸餾水中，121 °C濕熱滅菌20min ;在倒平板前，分別加入金霉素為O. lg/L、5. 0g/LU0. Og/L、 15. Og/L,配成4個(gè)金霉素梯度的培養(yǎng)基,搖勻。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟4)中細(xì)菌活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其配方為牛肉膏3.0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. Og, 瓊脂13. Og ;將其溶于IOOOmL蒸餾水中，121 °C濕熱滅菌20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于步驟4) 中真菌活化培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基，其組成為葡萄糖10. 0g，蛋白胨5. 0g, KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g ;將其溶于IOOOmL蒸餾水中，115°C濕熱滅菌15_20min。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種金霉素降解菌株的篩選方法，其特征在于用如下步驟代替步驟I)和步驟2) 1)菌種富集采集菌渣與廢水，稱取廢渣10g，置于250mL三角瓶中，加入IOOml蒸餾水，在搖床上搖勻，提取浸出液；吸取IOmL廢水樣與菌渣浸出液，分別接入裝有IOOml富集培養(yǎng)基的250mL 的三角瓶中，280C -300C，170r/min震蕩條件下，暗培養(yǎng)2_3天；然后取5ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的相同的培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)一次；無(wú)機(jī)鹽液體富集培養(yǎng)基組成為葡萄糖2g，(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl 0. 2g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA0. 015g，瓊脂 13g ;將上述物質(zhì)溶于1000ml蒸餾水中，分裝到250mL三角瓶中，115°C濕熱滅菌15_20min，在超凈工作臺(tái)中添加金霉素，添加濃度依次為 0. lg/L、l. 0g/L、2. 0g/L、3. 0g/L、4. 0g/L、5. 0g/L、10. Og/L 和 15. 0g/L，搖勻；2)菌株分離吸取200 μ I上述富集培養(yǎng)液，分別一一對(duì)應(yīng)涂布于上面所述8種不同金霉素濃度的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于28°C -30°C條件下遮光培養(yǎng)2-7天；無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基組成為葡萄糖2. 0g，(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 ·7Η20 0. 5g，NaCl 0. 2g, CaCl2O. lg，F(xiàn)eSO4O. 01g，EDTA0. 015g，瓊脂 13. 0g，溶于 1000ml 蒸餾水中；115°C濕熱滅菌15-20min ;在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加金霉素，添加濃度與無(wú)機(jī)鹽液體富集培養(yǎng)基相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金霉素降解菌株的篩選方法，屬于微生物降解抗生素殘留技術(shù)領(lǐng)域。具體為金霉素降解菌株的分離；菌株純化；菌株降解功能驗(yàn)證；菌株降解活性測(cè)定。本發(fā)明采用的篩選方法快速易行，經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，有利于同時(shí)獲得降解不同濃度金霉素殘留的菌株，特別是降解低濃度或貧營(yíng)養(yǎng)級(jí)金霉素的高效菌株。所得到的菌株可用于制備金霉素降解菌劑；本發(fā)明利用金霉素菌渣和廢水為篩選的最初原料，所得到的菌株及制成的菌劑可直接應(yīng)用于金霉素企業(yè)廢棄物的處理，也有可能應(yīng)用于周邊被金霉素污染的土壤與水體環(huán)境的修復(fù)；本發(fā)明用高效液相色譜法測(cè)定菌株降解活性，所得結(jié)果的準(zhǔn)確度和精度較高。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102604832SQ20121003125
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者李艷菊, 肖思穎, 董曉霞, 蔣耘晨, 袁聰穎 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)