專利名稱：一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，尤其是一種始旋鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用，為人類健康水平的提高、平均壽命的延長作出了極其重大的貢獻。但隨著抗生素的應(yīng)用，病原菌表現(xiàn)出驚人的適應(yīng)性，一次又一次地創(chuàng)造了臨床幾乎無法解決的嚴重問題。因此，開發(fā)全新結(jié)構(gòu)的抗生素品種或具有獨特性能的新類型抗生素，將是21世紀抗生素領(lǐng)域研究開發(fā)的重要方向。鏈陽性菌素是20世紀50年代發(fā)現(xiàn)的由鏈霉菌產(chǎn)生的一組天然環(huán)肽。對治療重危感染者具有非常重要的臨床意義，因而日益受到人們的關(guān)注。A族鏈陽性菌素的代表物質(zhì)普那霉素II A及普那霉素II A的衍生物達福普汀，B族鏈陽性菌素典型代表物質(zhì)普那霉素I A 及其普那霉素I A的衍生物奎奴普汀。普那霉素可作為萬古霉素的替代藥物，也可作為醫(yī)藥中間體用于合成奎奴普汀與達福普汀，因此具有良好的市場發(fā)展前景。普那霉素又名原始霉素，是由始旋鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種鏈陽性菌素類抗生素。 普那霉素對耐藥菌具有很好的殺菌效果，可為作為萬古霉素的替代藥物，在治療多重耐藥革蘭陽性菌引起的感染中有廣闊的應(yīng)用，但由于普那霉素水溶性極差，限制了其在臨床的應(yīng)用，普那霉素的衍生物奎奴普汀、達福普汀可以很好的解決上述問題，二者以30:70(W/W) 比例混合制成的藥物在臨床上具有很好的治療效果和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種保證普那霉素發(fā)酵產(chǎn)物中普那霉素II和普那霉素I比例為3:7的普那霉素的發(fā)酵；本發(fā)明還提供了采用該培養(yǎng)基的普那霉素的發(fā)酵方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基含有碳源2 10g/100ml，氮源2 7g/100ml，硫酸鹽 O. 25 I. 2g/100ml 和碳酸鈣 O. I O. 8g/100ml。本發(fā)明所述的碳源選自玉米淀粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、小麥淀粉，土豆淀粉和玉米粉中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米蛋白粉、花生餅粉、酵母粉、玉米漿、酵母膏、蛋白胨、豆柏和棉子餅粉中的一種或幾種；所述的硫酸鹽選自硫酸銨、硫酸鎂、硫酸納、硫Ife亞鐵和硫Ife鋒中的一種或幾種。本發(fā)明優(yōu)選的碳源為玉米淀粉和/或葡萄糖；優(yōu)選的氮源為黃豆餅粉、蛋白胨和/ 或酵母粉；優(yōu)選的硫酸鹽為硫酸銨和/或硫酸鎂。本發(fā)明優(yōu)選的碳源含量為5g/100ml ;優(yōu)選的氮源含量為4. 95g/100ml ;優(yōu)選的硫酸鹽含量為O. 5g/100ml ;優(yōu)選的碳酸鈣含量為O. 4g/100ml。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基在發(fā)酵初始的pH最好為6. 5。本發(fā)明的發(fā)酵方法,是在上述任意一種培養(yǎng)基中發(fā)酵40 80小時。
優(yōu)選的發(fā)酵時間為60小時。本發(fā)明所述的發(fā)酵期間補入的為氨基酸混合液，補料時間從第22小時持續(xù)到第 60小時，每四小時補一次。本發(fā)明優(yōu)選的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和氨基丁酸中的一種或幾種；優(yōu)選的氨基酸混合液濃度為O. I O.6g/100ml。本發(fā)明更優(yōu)選的氨基酸混合液濃度為O. 3g/100ml。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于普那霉素在發(fā)酵產(chǎn)生鏈陽性菌素A和鏈陽性菌素B，其中鏈陽性菌素A為多聚不飽和大環(huán)內(nèi)酯，鏈陽性菌素B為環(huán)己縮肽，兩種產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上有著明顯的差別，因此在同一發(fā)酵罐中需要進行兩種代謝途徑，并各自形成產(chǎn)物。因此本發(fā)明結(jié)合兩種代謝途徑的異同，在培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方和中間補料相結(jié)合的方法，最終達到控制兩種產(chǎn)物比例為3 7的目的。本發(fā)明通過對培養(yǎng)基中原材料種類及配比的調(diào)整，可以提高發(fā)酵單位，而且可以使產(chǎn)物中普那霉素I和普那霉素II的比例為3:7左右，為后續(xù)生產(chǎn)奎奴普汀和達福普汀奠定了基礎(chǔ)，使后續(xù)的普那霉素衍生物生產(chǎn)更加的方便。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。實施例I :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、120g玉米淀粉(濃度 2g/100ml)、30g葡萄糖(濃度O. 5g/100ml )U20g黃豆餅粉(濃度2g/100ml )、60g玉米蛋白粉(濃度lg/100ml)、60g酵母粉(濃度lg/100ml)、3g硫酸銨(濃度O. 05g/100ml)、60g硫酸鎂(濃度lg/100ml),用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5,加6g碳酸I丐(濃度O. lg/100ml),攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源2. 5g/100ml，氮源4. 05g/100ml，硫酸鹽 I. 05g/100ml,碳酸 丐 O. lg/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸的混合溶液，濃度為0. lg/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時， 即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為1:3 (3:9)。實施例2 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在10L的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、120g玉米淀粉(濃度 2g/100ml)、60g葡萄糖(濃度lg/100ml )、150g黃豆餅粉(濃度2. 5g/100ml )、90g玉米蛋白粉(濃度 I. 5g/100ml)>60g 酵母粉(濃度 lg/100ml)、3g 硫酸銨(濃度 0. 05g/100ml)>60g 硫酸鎂(濃度lg/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加6g碳酸鈣(濃度0. lg/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源3g/100ml，氮源5. 05g/100ml，硫酸鹽 I. 05g/100ml,碳酸 丐 0. lg/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸的混合溶液，濃度為O. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 1:2. 8 (3:8. 4)。實施例3 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、120g玉米淀粉(濃度 2g/100ml )、90g葡萄糖(濃度I. 5g/100ml )、180g黃豆餅粉(濃度3g/100ml )、120g玉米蛋白粉(濃度2g/100ml)、60g酵母粉(濃度lg/100ml)、3g硫酸銨(濃度O. 05g/100ml)、60g硫酸鎂(濃度lg/100ml),用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5,加6g碳酸I丐(濃度O. lg/100ml),攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源3. 5g/100ml，氮源6. 05g/100ml，硫酸鹽 I. 05g/100ml,碳酸 丐 0. lg/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、 丙氨酸、纈氨酸和谷氨酸的混合溶液，濃度為0. 6g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)80小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 1:2. 5 (3:7. 5)。實施例4 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在10L的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、180g玉米淀粉(濃度 3g/100ml )、30g葡萄糖(濃度0. 5g/100ml )、120g黃豆餅粉(濃度2g/100ml )、18g蛋白胨(濃度0. 3g/100ml)、60g玉米蛋白粉(濃度lg/100ml)、30g酵母粉(濃度0. 5g/100ml)、6g硫酸銨(濃度O. lg/100ml)、30g硫酸鎂(濃度O. 5g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加 12g碳酸鈣(濃度0. 2g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源 3. 5g/100ml，氮源 3. 9g/100ml，硫酸鹽 O. 6g/100ml,碳酸鈣 0. 2g/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°c，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，濃度為0. lg/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)40小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 1:2. 5 (3:7. 5)。實施例5 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在10L的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、180g玉米淀粉(濃度 3g/100ml)、60g葡萄糖(濃度lg/100ml)、150g黃豆餅粉(濃度2. 5g/100ml)、18g蛋白胨(濃度 0. 3g/100ml),90g 玉米蛋白粉(濃度 I. 5g/100ml )、30g 酵母粉(濃度 0. 5g/100ml )、6g 硫酸銨(濃度0. lg/100ml)、30g硫酸鎂(濃度0. 5g/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加 12g碳酸鈣(濃度0. 2g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源 4g/ 100ml,氮源 4. 9g/ 100ml,硫酸鹽 0. 6g/ 100ml,碳酸 丐 0. 2g/ 100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，濃度為0. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)50小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 1:2 (3:6)。
實施例6 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、180g玉米淀粉(濃度 3g/100ml)、90g葡萄糖(濃度I. 5g/100ml)、180g黃豆餅粉(濃度3g/100ml)、18g蛋白胨(濃度O. 3g/100ml)、120g玉米蛋白粉(濃度2g/ 100ml)、30g酵母粉(濃度O. 5g/100ml)、6g硫酸銨(濃度O. lg/100ml)、30g硫酸鎂(濃度O. 5g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加 12g碳酸鈣(濃度0.2wg/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源 4. 5g/IOOml,氮源 5. 9g/IOOml,硫酸鹽 O. 6g/IOOml,碳酸 丐 O. 2wg/IOOml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，濃度為O. 6g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 3:6. 5o實施例7 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、240g玉米淀粉(濃度 4g/100ml),30g葡萄糖(濃度O. 5g/100ml )U20g黃豆餅粉(濃度2g/100ml )、30g蛋白胨(濃度O. 5g/100ml)、60g玉米蛋白粉(濃度lg/100ml)、18g酵母粉(濃度O. 3g/100ml)、9g硫酸銨(濃度O. 15g/100ml)、21g硫酸鎂(濃度O. 35g/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加 24g碳酸鈣(濃度O. 4g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源 4. 5g/IOOml,氮源 3. 95g/IOOml,硫酸鹽 O. 4g/IOOml,碳酸 丐 O. 4g/IOOml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的混合溶液，濃度為O. lg/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)55小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為
3:6. 2o實施例8 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、240g玉米淀粉(濃度 4g/100ml)、60g葡萄糖(濃度lg/100ml)、150g黃豆餅粉(濃度2. 5g/100ml)、30g蛋白胨(濃度 O. 5g/100ml)、90g 玉米蛋白粉(濃度 I. 5g/100ml)、18g 酵母粉(濃度 O. 3g/100ml)、9g 硫酸銨(濃度O. 15g/100ml)、21g硫酸鎂(濃度O. 35g/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5， 加24g碳酸鈣(濃度O. 4g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中 碳源 5g/IOOml,氮源 4. 95g/IOOml,硫酸鹽 O. 5g/IOOml,碳酸|丐 O. 4g/IOOml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的混合溶液，濃度為O. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)70小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 3:7。實施例9 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、240g玉米淀粉(濃度 4g/100ml)、90g葡萄糖(濃度I. 5g/100ml)、180g黃豆餅粉(濃度3g/100ml)、30g蛋白胨(濃度O. 5g/100ml)、120g玉米蛋白粉(濃度2g/ 100ml)、18g酵母粉(濃度O. 3g/100ml)、9g硫酸銨(濃度O. 15g/100ml )、21g硫酸鎂(濃度O. 35g/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加 24g碳酸鈣(濃度O. 4g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源 5. 5g/IOOml,氮源 5. 95g/IOOml,硫酸鹽 5g/IOOml,碳酸 丐 O. 4g/IOOml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的混合溶液，濃度為O. 6g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 3:8.2。實施例10 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、300g玉米淀粉(濃度 5g/100ml )、30g葡萄糖(濃度O. 5g/100ml )U20g黃豆餅粉(濃度2g/100ml )、60g蛋白胨(濃度lg/100ml)、60g玉米蛋白粉(濃度lg/100ml)、12g硫酸銨(濃度O. 2g/100ml )、3g硫酸鎂 (濃度O. 05g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加48g碳酸鈣(濃度O. 8g/100ml),攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源5. 5g/100ml，氮源4. 2g/100ml，硫酸鹽 O. 25g/100ml，碳酸鈣 O. 8g/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為蘇氨酸、脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，濃度為O. lg/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為3:8. 2。實施例11 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、300g玉米淀粉(濃度 5g/100ml)、60g葡萄糖(濃度lg/100ml)、150g黃豆餅粉(濃度2. 5g/100ml)、60g蛋白胨(濃度lg/100ml)、90g玉米蛋白粉(濃度I. 5g/100ml )、12g硫酸銨(濃度O. 2g/100ml )、3g硫酸鎂(濃度O. 05g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加48g碳酸鈣(濃度O. 8g/100ml), 攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源6g/100ml，氮源5. 2g/100ml，硫酸鹽 O. 25g/100ml，碳酸鈣 O. 8g/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,攪拌速度600rpm，通氣量 lv/v及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為蘇氨酸、 脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，濃度為O. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為1:3.3 (3:10)。實施例12 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、300g玉米淀粉(濃度 5g/100ml)、90g葡萄糖(濃度I. 5g/100ml)、180g黃豆餅粉(濃度3g/100ml)、60g蛋白胨(濃度lg/100ml)、120g玉米蛋白粉(濃度2g/100ml)、12g硫酸銨(濃度O. 2g/100ml)、3g硫酸鎂 (濃度O. 05g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加48g碳酸鈣(濃度O. 8g/100ml),攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源6. 5g/100ml，氮源6. 2g/100ml，硫酸鹽 O. 25g/100ml，碳酸鈣 O. 8g/100ml。
發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為蘇氨酸、 脯氨酸和氨基丁酸的混合溶液，濃度為O. 6g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為1:3.2 (3:9. 6)。實施例13 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、60g玉米淀粉(濃度 lg/100ml )、60g葡萄糖(濃度lg/100ml )、120g黃豆餅粉(濃度2g/100ml )、30g蛋白胨(濃度 O. 5g/100ml)U20g酵母粉(濃度2g/100ml )、18g硫酸銨(濃度O. 3g/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)PH為6. 5，加18g碳酸鈣(濃度O. 3g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源2g/100ml,氮源4. 8g/100ml,硫酸鹽O. 3g/100ml,碳酸隹丐O. 3g/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的混合溶液，濃度為O. lg/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)60小時， 即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為1:2 (3:6)。實施例14 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在10L的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、120g玉米淀粉(濃度 2g/100ml)、240g葡萄糖(濃度4g/100ml)、30g蛋白胨(濃度O. 5g/100ml)、30g玉米蛋白粉 (濃度 0. 5g/100ml)、30g 酵母粉(濃度 0. 5g/100ml )、30g 硫酸銨(濃度 0. 5g/100ml)、6g 硫酸鎂(濃度0. lg/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加18g碳酸鈣(濃度0. 3g/100ml )，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源6g/100ml，氮源2g/100ml，硫酸鹽
0.6g/ 100ml，碳酸 丐 0. 3g/ 100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、 丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的混合溶液，濃度為0. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)65小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 2:5.9 (3:8.85)。實施例15 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在10L的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、180g玉米淀粉(濃度 3g/100ml)、120g葡萄糖(濃度2g/100ml)、黃豆餅粉240g(濃度4g/100ml)、60g蛋白胨(濃度lg/100ml)、60g玉米蛋白粉(濃度lg/100ml)、60g硫酸銨(濃度lg/100ml)、12g硫酸鎂 (濃度0. 2g/100ml)，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加18g碳酸鈣(濃度0. 3g/100ml)，攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源5g/100ml，氮源7g/100ml，硫酸鹽
1.2g/100ml,，碳酸鈣 0. 3g/100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、 丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的混合溶液，濃度為0. 6g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)45小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為1:3. 2 (3:9. 6)。實施例16 :采用下述的普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。培養(yǎng)基的制備在IOL的發(fā)酵罐中，加入5L自來水、240g玉米淀粉(濃度 4g/100ml)、360g葡萄糖(濃度6g/100ml)、黃豆餅粉300g(濃度5g/100ml)、30g蛋白胨(濃度 O. 5g/100ml)、30g 玉米蛋白粉(濃度 O. 5g/100ml)、42g 硫酸銨(濃度 O. 7g/100ml)、6g 硫酸鎂(濃度O. lg/100ml )，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH為6. 5，加24g碳酸鈣(濃度O. 4g/IOOml )， 攪拌均勻即可得到液體培養(yǎng)基。所得的液體培養(yǎng)基中碳源10g/100ml，氮源6.7g/100ml， 硫酸鹽 0. 8g/ 100ml,碳酸|丐 0. 4g/ 100ml。發(fā)酵過程始旋鏈霉菌在上述液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，攪拌速度600rpm，通氣量 lv/V及培養(yǎng)溫度28°C，22小時開始補入氨基酸混合液，補加的氨基酸混合液為甘氨酸、 丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的混合溶液，濃度為0. 3g/100ml，每四小時補料一次，培養(yǎng)72小時，即可得到普那霉素；得到的普那霉素取樣分析，普那霉素I和普那霉素II的質(zhì)量比為 3:6. 7 ο
權(quán)利要求
1.一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的培養(yǎng)基含有碳源2 10g/100ml， 氮源 2 7g/100ml，硫酸鹽 0. 25 I. 2g/100ml 和碳酸鈣 0. I 0. 8g/100ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的碳源選自玉米淀粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、小麥淀粉，土豆淀粉和玉米粉中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米蛋白粉、花生餅粉、酵母粉、玉米漿、酵母膏、蛋白胨、豆柏和棉子餅粉中的一種或幾種；所述的硫酸鹽選自硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸亞鐵和硫酸鋅中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的碳源為玉米淀粉和/或葡萄糖；所述的氮源為黃豆餅粉、蛋白胨和/或酵母粉；所述的硫酸鹽為硫酸銨和/或硫酸鎂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源的含量為5g/100ml ;所述氮源的含量為4. 95g/100ml ;所述硫酸鹽的含量為0. 5g/100ml ;所述碳酸鈣的含量為0. 4g/100ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一 4所述的任意一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基在發(fā)酵初始的pH為6. 5。
6.一種普那霉素的發(fā)酵方法，其特征在于在權(quán)利要求書I 一 5所述的任意一種培養(yǎng)基中發(fā)酵40 80小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種普那霉素的發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵時間為 60小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種普那霉素的發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵期間補入的為氨基酸混合液，補料時間從第22小時持續(xù)到第60小時，每四小時補一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種普那霉素的發(fā)酵方法，其特征在于所述的氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和氨基丁酸中的一種或幾種；所述氨基酸混合液的濃度為0. I 0. 6g/100ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種普那霉素的發(fā)酵方法，其特征在于所述氨基酸混合液的濃度為0. 3g/100ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種普那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，所述的培養(yǎng)基含有碳源2～10g/100ml，氮源2～7g/100ml，硫酸鹽0.25～1.2g/100ml和碳酸鈣0.1～0.8g/100ml；本發(fā)明的發(fā)酵方法，是在上述培養(yǎng)基中發(fā)酵40～80小時。其通過對培養(yǎng)基中原材料種類及配比的調(diào)整，可以提高發(fā)酵單位，而且可以使產(chǎn)物中普那霉素Ⅰ和普那霉素Ⅱ的比例為3:7左右，為后續(xù)生產(chǎn)奎奴普汀和達福普汀奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12P21/02GK102586370SQ201210015650
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者楊玉淮 申請人:石家莊佰銳生物技術(shù)有限公司