用于測(cè)定HE4a的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明包括HE/HE4a標(biāo)志物用于評(píng)估受試者的卵巢癌的用途。還包括使用HE/HE4a標(biāo)志物進(jìn)行卵巢癌的診斷、分級(jí)和分期、以及確定已經(jīng)診斷出具有卵巢癌的受試者的預(yù)后和治療有效性的組合物和方法。
【專利說(shuō)明】用于測(cè)定HE4a的組合物和方法
[0001]本發(fā)明包括用于疑似患有和/或罹患卵巢癌的受試者的檢測(cè)、診斷、分級(jí)、分期、預(yù)后以及預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)所述受試者的治療應(yīng)答性的組合物和方法。也公開了通過(guò)確定全長(zhǎng)HE4a在得自患者的樣品中的存在來(lái)檢測(cè)卵巢癌的免疫測(cè)定、結(jié)合劑和抗體和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]WFDC2 (HE4/HE4a)基因產(chǎn)物是穩(wěn)定的4_ 二硫鍵核心蛋白家族的一個(gè)成員。HE4是一種首先在人附睪組織中觀察到的分泌型糖基化蛋白(人附睪蛋白4;HE4)，且在某些癌癥(包括卵巢癌)中過(guò)表達(dá)。HE4/HE4a蛋白和核酸的表征已經(jīng)被報(bào)道在，例如，KirchhoffC，Habben I,Ivell R, KrulI N(Mar1992).“A major human epididymis-specificcDNA encodes a protein with sequence homo logy to extracellularproteinase inhibitors”.Biol Reprod45 (2):350 - 7Schummer M, Ng WV, BumgarnerRE, Nelson PS,Schummer B,Bednarski DW, Hassell L,Baldwin RL,Karlan BY,HoodL (Decl999).“Comparative hybridization of an array of 21,500ovarian cDNAs forthe discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas，，.Gene238 (2):375 -85;Kirchhoff C (1998).“Molecular characterization of epididymal proteins.^Rev.Reprod.3 (2): 86 - 95.; Kirchhoff C, Osterhoff C, Habben I,等人.(1990).“Cloningand analysis of mRNAs expressed specifically in the human epididymis.，，Int.J.Androl.13(2):155 - 67; Hellstrom I,等人;Cancer Res.2003Jull; 63 (13): 3695-700。HE4/HE4a在癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)提示，該蛋白和它的各種異形體可以作為用于檢測(cè)癌癥和用于鑒別具有增加的罹患癌癥的可能性的患者的有用生物標(biāo)志物。以前已經(jīng)報(bào)道了與例如HE4/HE4a等分子標(biāo)志物的應(yīng)用有關(guān)的方法和組合物，包括US7270960、US20100311099、US20080020473、US20070286865、US20100047818、US20090104684 和 US20030108965，它們中的每一篇的內(nèi)容整體并入本文中。
[0003]已經(jīng)報(bào)道，由于選擇性剪接以及不同糖基化模式所導(dǎo)致的不同糖型，HE4/HE4a蛋白具有不同的異形體。考慮到上述內(nèi)容，本領(lǐng)域需要能夠檢測(cè)生物標(biāo)志物例如HE4a、它們的變體、剪接異形體和糖型的過(guò)表達(dá)來(lái)診斷癌癥的組合物和結(jié)合劑(例如抗體)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明包括用于診斷受試者的卵巢癌和用于鑒別具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受試者的組合物和方法。所述組合物包括特異性地結(jié)合在卵巢癌上過(guò)表達(dá)的HE4/HE4a的可溶性形式和細(xì)胞表面形式的單克隆抗體、它們的變體和片段。還提供了具有公開的HE4a抗體的結(jié)合特征的單克隆抗體。還公開了生產(chǎn)HE4/HE4a單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。公開的組合物可以用于診斷方法中以及用于鑒別具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受試者的篩選方法中。具體地，診斷方法可以包括免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定或雙夾心ELISA測(cè)定。還提供了試劑盒，其包括一種或多種公開的HE4a單克隆抗體，并用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。還公開了包含HE4a表位的氨基酸序列的多肽和在抗體的生產(chǎn)中使用這些多肽的方法?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0005]圖1解釋了包含HE4a結(jié)構(gòu)域和人/小鼠IgG的一個(gè)示例性的HE4a融合蛋白實(shí)施方案。
[0006]圖2解釋了單克隆抗體實(shí)施方案(12A2和14E2抗體)對(duì)全長(zhǎng)HE4a、HE4a的HE4a-V4和HE4a_V2結(jié)構(gòu)域的一些結(jié)合特異性。在該實(shí)施例中，MAbl2A2和14E2與HE4a_V4變體和與全長(zhǎng)HE4a結(jié)合，但是不與HE4a-V2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這表明，12A2和14E2MAb與HE4aN-WFDC結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
[0007]圖3描繪了參照單克隆抗體(2H5和3D8抗體)對(duì)融合蛋白的結(jié)合特異性。在該實(shí)施例中，參照MAb與HE4a-V2結(jié)構(gòu)域和與全長(zhǎng)HE4a結(jié)合，但是不與HE4a_V4結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這表明，它們識(shí)別HE4a C-WFDC結(jié)構(gòu)域中的表位。
[0008]圖4顯示了 HE4a核苷酸和肽序列；包括N-WFDC和C-WFDC HE4a結(jié)構(gòu)域。
[0009]圖5解釋了示例性的單克隆抗體(12A2)與N-WFDC和C-WFDC的結(jié)合相互作用。在該實(shí)施例中，使用噬菌體ELISA形式證實(shí)了 12A2的結(jié)合特異性，其中所述MAb僅與HE4aN-WFDC噬菌體pVIII融合蛋白反應(yīng)。
[0010]圖6描繪了 14E2MAb與變性的和還原的HE4a_hIg融合蛋白的反應(yīng)性。與變性的和還原的HE4a-hIg融合蛋白的結(jié)合指示，14E2MAb會(huì)識(shí)別HE4a蛋白的線性表位。
[0011]圖7顯示了使用14E2作為捕獲MAb和使用3D8或12A2MAB作為檢測(cè)MAb的夾心免疫測(cè)定的劑量響應(yīng)曲線。14E2和12A2MAb的組合的結(jié)果指示，它們能夠同時(shí)結(jié)合，并從而檢測(cè)HE4a N-WFDC結(jié)構(gòu)域的獨(dú)立表位。
[0012]圖8解釋了與2H5MAb組合的12A2和14E2MAb的一些實(shí)施例夾心免疫測(cè)定和結(jié)合。在該實(shí)施例中，MAbl2A2和14E2僅與全長(zhǎng)HE4a反應(yīng)，而MAb組合3D8和2H5與FL HE4a和HE4a-V2變體二者反應(yīng)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):12A2和14E2MAb會(huì)識(shí)別在HE4a N-WFDC結(jié)構(gòu)域中暴露的表位。
[0013]圖9顯示了全長(zhǎng)HE4a EIA的劑量響應(yīng)曲線。該測(cè)定是基于2H5MAb作為捕獲抗體和HRP綴合的12A2MAb作為檢測(cè)MAb。如在實(shí)施例3中所述進(jìn)行操作。
[0014]圖10描繪了健康受試者、具有良性婦科疾病的患者和在FL HE4a EIA (如在實(shí)施例3中所述)中確定具有卵巢癌的患者的HE4a水平。
[0015]圖11解釋了用于監(jiān)測(cè)卵巢癌的臨床進(jìn)程的一個(gè)示例性的全長(zhǎng)HE4a免疫測(cè)定(SD=穩(wěn)定疾?。籖=應(yīng)答；PD=進(jìn)行性疾病)。在該實(shí)施例中，全長(zhǎng)HE4a證實(shí)，全長(zhǎng)HE4a可用于跟蹤具有確診的卵巢癌的患者的疾病的臨床進(jìn)程。
[0016]圖12.解釋了使用對(duì)HE4a Ν-ffFDC結(jié)構(gòu)域特異性的示例性MAb的良性和惡性卵巢組織的IHC。在該實(shí)施例中，示例性的12A2MAb強(qiáng)烈地結(jié)合卵巢癌中的癌細(xì)胞，但是沒(méi)有結(jié)合良性腫瘤中的細(xì)胞。A:漿液性腺癌；B:漿液性腺癌；C:子宮內(nèi)膜樣卵巢癌；D:漿液性腺癌；E:纖維瘤；F:纖維卵泡膜細(xì)胞瘤。
【具體實(shí)施方式】
[0017]提供了用于診斷受試者的卵巢癌和用于鑒別具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受試者的不同組合物和方法。組合物包括能夠結(jié)合HE4/HE4a (即已經(jīng)證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的蛋白)的單克隆抗體。所述組合物包括特異性地結(jié)合在卵巢癌上過(guò)表達(dá)的HE4/HE4a的可溶性形式和細(xì)胞表面形式的單克隆抗體、它們的變體和片段。另外提供了具有本公開內(nèi)容的HE4a抗體的結(jié)合特征的單克隆抗體。還提供了生產(chǎn)本公開內(nèi)容的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。更具體地，提供了這樣的雜交瘤細(xì)胞系:其生產(chǎn)結(jié)合HE4a的N-WFDC結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。還公開了包含所述單克隆抗體的試劑盒。本發(fā)明還包括包含HE4a表位的氨基酸序列的多肽和在抗體生產(chǎn)中使用這些多肽的方法。所述組合物具體地用在診斷受試者的卵巢癌的“夾心"ELISA方法或IHC中和在鑒別具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受試者的篩選方法中。
[0018]在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了一種能夠特異性地結(jié)合HE4a的單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單克隆抗體由作為專利保藏物編號(hào)(Patent Deposit N0.)10091401保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系12A2生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單克隆抗體由作為專利
保藏物編號(hào)(14E2ECACC No_)保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系14E2生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施
方案中，所述單克隆抗體結(jié)合在SEQ ID N0:17HE4a N-ffFDC (E KTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
[0019]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷卵巢癌的試劑盒，其包括:結(jié)合在SEQ ID N0:HE4a N-WFDC中所示的氨基酸序列的單克隆抗體和結(jié)合在SEQ ID N0:19HE4aC-WFDC(K EGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF)中所示的氨基酸序列的另一種單克隆抗體。還提供了用于診斷患者的卵巢癌的試劑盒，其包括:被固定化在固體支持物上的捕獲抗體，其中所述捕獲抗體是第一種HE4a抗體；和標(biāo)簽抗體，其中所述標(biāo)簽抗體是被可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的第二種HE4a抗體；其中所述第一種或所述第二種HE4a抗體是單克隆抗體,其中所述單克隆抗體由作為專利保藏物編號(hào)(14E2ECACC No—)保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系14E2生產(chǎn)，和/或結(jié)合在 SEQ ID NO: 17HE4a N-f`fFDC (E KTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
[0020]本發(fā)明的公開內(nèi)容也提供了一種用于生產(chǎn)HE4a單克隆抗體的方法，所述方法包括:在引起免疫應(yīng)答的條件下用多肽免疫動(dòng)物，其中所述多肽包含在SEQ ID N0:l、3和5(HE4a;HE4a V2;HE4a_V4)中所示的氨基酸序列及其變體；從所述動(dòng)物分離出抗體生產(chǎn)細(xì)胞；使所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞與培養(yǎng)的永生化細(xì)胞融合以形成生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞；和從所述培養(yǎng)物中分離出單克隆抗體。
[0021]本公開內(nèi)容也提供了 HE4a結(jié)合劑，其結(jié)合:(a)HE4a的N-WFDC結(jié)構(gòu)域；(b)由SEQ ID N0:lHE4a編碼的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑是抗_HE4a抗體或HE4a抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑選擇性地結(jié)合HE4a N-ffFDC (SEQ IDNO: 17)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑是多克隆的、單克隆的、雙特異性的、嵌合的或人源化的抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑被可檢測(cè)的標(biāo)志物標(biāo)記。
[0022]本發(fā)明還包括純化的氨基酸序列，其與作為專利保藏物編號(hào)10091401保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系12A2所生產(chǎn)的單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%同一性。
[0023]在另一個(gè)方面，提供了純化的氨基酸序列，其中與單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列由作為專利保藏物編號(hào)14E2ECACC No保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系14E2生產(chǎn)。
[0024]本公開內(nèi)容也包括一種獲得編碼HE4a多肽的核酸序列的方法，所述方法包括:a)用包含正向引物和反向引物的引物集合，從樣品擴(kuò)增核酸，其中所述引物集合選自:SEQ IDN0:21V4F 和 SEQ ID NO:23_V4R, SEQ ID N0:25V2F 和 SEQ ID N0:27V2R ；b)分離所述擴(kuò)增的核酸。
[0025]本發(fā)明還包括一種分離的核酸分子，其編碼結(jié)合SEQ ID N017HE4a N-WFDC的序列的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白的氨基酸序列與由作為專利保藏物編號(hào)10091401保藏在ECACC的雜交瘤12A2或作為專利保藏物編號(hào)14E2ECACC No保藏在ECACC的細(xì)胞系14E2生產(chǎn)的單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%同一性，和/或所述結(jié)合蛋白結(jié)合在SEQ IDNO:17HE4a N-ffFDC(E KTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
[0026]在另一個(gè)方面，提供了載體和宿主細(xì)胞，其包含編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，所述結(jié)合蛋白結(jié)合SEQ ID N017HE4a N-WFDC的序列。
[0027]本公開內(nèi)容也提供了一種分離的融合蛋白，其包含與Fe受體多肽連接的異源HE4a多肽，所述Fe受體多肽包含SEQ ID N0:17HE4a N-WFDC的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用由 SEQ ID N0:29W1F、SEQ ID NO: 3 Iff IR, SEQ ID N0:33W2F、SEQ ID N0:35W2R編碼的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，得到分離的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含作為剪接變體的異源HE4a抗原多肽。
[0028]本發(fā)明還包括一種篩選卵巢癌在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的生物樣品與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的抗體接觸，以確定所述生物樣品中存在以可溶形式天然存在 于該樣品中、并具有可與所述至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的分子，所述接觸在足以檢測(cè)所述抗體與所述抗原決定簇的結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，然后檢測(cè)卵巢癌的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物樣品選自:血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴液、尿、腦脊液、唾液、粘膜分泌物、陰道分泌物、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液、腹水、培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基和洗出液。
[0029]本公開內(nèi)容另外提供了一種篩選卵巢癌在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的包含細(xì)胞的生物樣品與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的抗體接觸，以確定所述生物樣品中存在具有可與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的細(xì)胞表面分子，所述接觸在足以檢測(cè)所述抗體與所述抗原決定簇的結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，并從而檢測(cè)卵巢癌的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體被可檢測(cè)地標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體沒(méi)有被可檢測(cè)地標(biāo)記，且其中所述抗體與抗原決定簇的結(jié)合的檢測(cè)是間接的。
[0030]本發(fā)明還包括一種篩選卵巢癌在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的生物樣品與至少一種固定化的對(duì)HE4a抗原多肽特異性的第一抗體接觸，以確定分子在樣品中的存在，所述接觸在足以使所述第一抗體特異性地結(jié)合HE4a抗原多肽并由此形成免疫復(fù)合物的條件和時(shí)間下進(jìn)行；除去所述樣品的沒(méi)有特異性地結(jié)合所述第一抗體的組分；和使所述免疫復(fù)合物與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的第二抗體接觸，其中所述第二抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制所述固定化的第一抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述接觸在足以檢測(cè)所述第二抗體與HE4a抗原多肽的特異性結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，并從而檢測(cè)卵巢癌的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固定化的第一抗體選自:12A2、14E2、2H5和3D8。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二抗體選自:12A2、14E2、2H5和3D8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固定化的第一抗體是14E2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二抗體是12A2。
[0031]還公開了一種診斷具有卵巢癌的受試者的方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與卵巢癌的存在相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0032]本發(fā)明還包括一種診斷具有卵巢癌的受試者的方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域；在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與卵巢癌的存在相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0033]本公開內(nèi)容也包括具有卵巢癌的受試者的預(yù)后方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合 HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與卵巢癌的階段相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0034]本發(fā)明還包括具有卵巢癌的受試者的預(yù)后方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域；在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與卵巢癌的階段相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0035]還公開了一種監(jiān)測(cè)接受卵巢癌治療的受試者的方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與對(duì)所述治療的應(yīng)答性相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0036]本公開內(nèi)容另外提供了一種監(jiān)測(cè)接受卵巢癌治療的受試者的方法，所述方法包括:檢測(cè)得自受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原；在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域；在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與對(duì)所述治療的應(yīng)答性相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
[0037]本發(fā)明也提供了一種用于檢測(cè)卵巢癌在患者中的存在或不存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的試驗(yàn)卵巢組織樣品與抗體接觸，所述抗體特異性地結(jié)合在SEQ IDN0:HE4中所示的多肽；檢測(cè)結(jié)合試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量；和將結(jié)合試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量與預(yù)定的截止值進(jìn)行對(duì)比，其中當(dāng)結(jié)合試驗(yàn)卵巢組織樣品中的所述多肽的抗體的量高于預(yù)定的截止值時(shí)，所述試驗(yàn)卵巢癌組織樣品是卵巢癌陽(yáng)性的，由此檢測(cè)卵巢癌在受試者中的存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用免疫組織化學(xué)，確定結(jié)合試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量。
[0038]本文公開的方法涉及HE4/HE4a，即描述的“ 4_ 二硫鍵核心”蛋白家族的一個(gè)成員?！?-二硫鍵核心”蛋白家族包含功能多樣的酸和熱穩(wěn)定的小分子的異質(zhì)群組，且該異質(zhì)群組包括人附睪4- 二硫鍵核心蛋白或“HE4” (Kirchhoff等人，1991Biol.Reprod.45:350-357;Wang 等人，1999Gene229:101;Sch`ummer 等人，1999Gene238:375)。HE4cDNA 最早分離自人附睪(Kirchhoff 等人，1991Biol.R印rod.45:350-357)，HE4cDNA 以后在從卵巢癌構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中高頻率地檢測(cè)出(Wang等人，1999Gene229:101; Schummer等人，1999Gene238:375)。在 Hellstrom 等人，2003，Cane.Res.63:3695-3700 中和在US7, 270，960中公開了 HE4a的修正序列。HE4a表現(xiàn)出的氨基酸序列與在更早的出版物中被稱作HE4的分子的推論序列高度類似，但是不同。
[0039]在下面表1中詳細(xì)報(bào)道了 HE4蛋白的許多異形體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，本公開內(nèi)容的HE4/HE4a單克隆抗體可以結(jié)合超過(guò)一種HE4異形體，只要每種異形體包括特定HE4/HE4a抗體的有關(guān)表位序列。
[0040]表1:HE4異形體
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種能夠特異性地結(jié)合HE4a的單克隆抗體,其中所述抗體選自: (a)由作為專利保藏物編號(hào)10091401保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系12A2生產(chǎn)的單克隆抗體； (b)由作為專利保藏物編號(hào)14E2ECACCNo—保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系14E2生產(chǎn)的單克隆抗體； (c)結(jié)合SEQID N0:HE4a N-WFDC中所示的氨基酸序列的單克隆抗體； (d)單克隆抗體，其是(a)-(c)的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，其中所述片段保留特異性地結(jié)合HE4a的能力。
2.作為專利保藏物編號(hào)10091401保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系12A2。
3.作為專利保藏物編號(hào)14E2ECACCNo—保藏在ECACC的雜交瘤細(xì)胞系14E2。
4.一種雜交瘤細(xì)胞系,其能夠生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
5.一種用于診斷卵巢癌的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
6.一種用于診斷卵巢癌的試劑盒，所述試劑盒包括:結(jié)合SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的單克隆抗體和結(jié)合SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列的另一種單克隆抗體。
7.一種用于診斷患者的卵巢癌的試劑盒，所述試劑盒包括: a)被固定化在固體支持物上的捕獲抗體，其中所述捕獲抗體是第一種HE4a抗體；和 b)標(biāo)簽抗體，其中所述標(biāo)簽抗體是被可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的第二種HE4a抗體；其中所述第一種或所述第二種HE4a抗體是根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
8.一種用于生產(chǎn)HE4a單克隆抗體的方法，所述方法包括: (a)在引起免疫應(yīng)答的條件下用多肽免疫動(dòng)物，其中所述多肽包含在SEQID ΝΟ:1、3或5中所示的氨基酸序列； (b)從所述動(dòng)物分離出抗體生產(chǎn)細(xì)胞； (C)使所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞與培養(yǎng)的永生化細(xì)胞融合以形成生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞； (d)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞；和， (e)從培養(yǎng)物中分離出單克隆抗體。
9.一種HE4a結(jié)合劑，其結(jié)合:
(a)SEQ ID NO:1 的 N-WFDC 結(jié)構(gòu)域； (b)由SEQID NO: 17編碼的氨基酸序列； (c)由HE4a編碼的氨基酸序列；或者 (d)(a)至(c)中的任一項(xiàng)的變體或片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑是抗_HE4a抗體或HE4a抗原結(jié)合片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑選擇性地結(jié)合HE4aN-ffFDC (SEQ IDNO:17)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑是多克隆的、單克隆的、雙特異性的、嵌合的或人源化的抗體或其抗原結(jié)合片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑是多克隆的、單克隆的、雙特異性的、嵌合的或人源化的抗體或抗原結(jié)合片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑是多克隆的、單克隆的、雙特異性的、嵌合的或人源化的抗體或抗原結(jié)合片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑用可檢測(cè)的標(biāo)志物標(biāo)記。
16.一種純化的氨基酸序列，其與根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%同一性。
17.一種用于獲得編碼HE4a多肽的核酸序列的方法，所述方法包括:a)用包含正向引物和反向引物的引物集合，從樣品擴(kuò)增核酸，其中所述引物集合選自:SEQ ID NO:21(V4F)和 SEQ ID NO:23(V4R), SEQ ID NO:25(V2F)和 SEQ ID NO:27(V2R) ；b)分離擴(kuò)增的核酸。
18.一種分離的核酸分子，其編碼結(jié)合SEQ ID N017HE4a N-WFDC的序列的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白的可變重鏈的氨基酸序列與根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的氨基酸序列具有至少90%同一性。
19.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的核酸分子。
20.一種分離的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求19所述的載體。
21.一種生產(chǎn)能夠結(jié)合N-WFDC的結(jié)合劑的方法，所述方法包括下述步驟: a)構(gòu)建載體，所述載體包含與調(diào)節(jié)元件可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸分子; b)將得到的載體轉(zhuǎn) 化進(jìn)宿主細(xì)胞中；和 c)在足以生產(chǎn)所述結(jié)合蛋白的條件和時(shí)間下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法生產(chǎn)的分離的結(jié)合劑。
23.一種分離的融合蛋白，其包含與Fe受體多肽連接的異源HE4a多肽，所述Fe受體多肽包含SEQ ID NO:17HE4a N-WFDC的氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的融合蛋白，其中通過(guò)使用由SEQID NO: 29 (WlF),SEQ ID NO: 31 (WlR)、SEQ ID NO:33(W2F)、SEQ ID NO:35(W2R)編碼的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，得到所述多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中所述HE4a抗原多肽是剪接變體。
26.一種篩選惡性病癥在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的生物樣品與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的抗體接觸，以確定所述生物樣品中存在以可溶形式天然存在于該樣品中、并具有可與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的分子，所述接觸在足以檢測(cè)所述抗體與所述抗原決定簇的結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，然后檢測(cè)惡性病癥的存在。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述生物樣品選自:血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴液、尿、腦脊液、唾液、粘膜分泌物、陰道分泌物、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液、腹水、培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基和洗出液。
28.一種篩選惡性病癥在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自受試者的包含細(xì)胞的生物樣品與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的抗體接觸，以確定所述生物樣品中存在具有與至少一種抗體反應(yīng)的抗原決定簇的細(xì)胞表面分子，所述接觸在足以檢測(cè)所述抗體與所述抗原決定簇的結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，并從而檢測(cè)惡性病癥的存在。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中至少一種抗體被可檢測(cè)地標(biāo)記。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中至少一種抗體被可檢測(cè)地標(biāo)記。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中至少一種抗體沒(méi)有被可檢測(cè)地標(biāo)記，且其中所述抗體與抗原決定簇的結(jié)合的檢測(cè)是間接的。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中至少一種抗體沒(méi)有被可檢測(cè)地標(biāo)記，且其中所述抗體與抗原決定簇的結(jié)合的檢測(cè)是間接的。
33.一種篩選卵巢癌在受試者中的存在的方法，所述方法包括:使得自所述受試者的生物樣品與至少一種固定化的對(duì)HE4a抗原多肽特異性的第一抗體接觸，以確定分子在所述樣品中的存在，所述接觸在足以使所述第一抗體特異性地結(jié)合HE4a抗原多肽并由此形成免疫復(fù)合物的條件和時(shí)間下進(jìn)行；除去所述樣品的沒(méi)有特異性地結(jié)合所述第一抗體的組分；和使所述免疫復(fù)合物與至少一種對(duì)HE4a抗原多肽特異性的第二抗體接觸，其中所述第二抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制所述固定化的第一抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述接觸在足以檢測(cè)所述第二抗體與所述HE4a抗原多肽的特異性結(jié)合的條件和時(shí)間下進(jìn)行，并從而檢測(cè)卵巢癌的存在。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述固定化的第一抗體選自:12A2、14E2、2H5和3D8。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第二抗體選自:12A2、14E2、2H5和3D8。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述固定化的第一抗體是14E2。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第二抗體是12A2。
38.一種診斷具有卵巢癌的受試者的方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和 c)在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與卵巢癌的存在相關(guān)聯(lián)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
41.一種診斷具有卵巢癌的受試者的方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域； c)在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和 d)在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與卵巢癌的存在相關(guān)聯(lián)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述抗體中的至少一種包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述抗體由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。
44.一種具有卵巢癌的受試者的預(yù)后方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和 c)在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與卵巢癌的階段相關(guān)聯(lián)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
47.一種具有卵巢癌的受試者的預(yù)后方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域； c)在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和 d)在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與卵巢癌的階段相關(guān)聯(lián)。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述抗體中的至少一種包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述抗體由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。
50.一種監(jiān)測(cè)接受卵巢癌治療的受試者的方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與抗體接觸，所述抗體具有結(jié)合HE4a N-WFDC的抗原結(jié)合域；和 c)在顯示器上檢測(cè)所述復(fù)合物的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述復(fù)合物的存在與對(duì)所述治療的應(yīng)答性相關(guān)聯(lián)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述抗體包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述抗體是由具有ECACC專利保藏物編號(hào)10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。
53.一種監(jiān)測(cè)接受卵巢癌治療的受試者的方法，所述方法包括: a)檢測(cè)得自所述受試者的試驗(yàn)樣品中的HE4a抗原； b)在足以形成第一抗體/抗原復(fù)合物的條件和時(shí)間下，使所述試驗(yàn)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體具有結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域；c)在足以形成第一抗體/抗原/第二抗體復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將綴合物加入所述第一抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包含連接至產(chǎn)生信號(hào)的化合物的第二抗體，所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)；和 d)在顯示器上檢測(cè)由所述產(chǎn)生信號(hào)的化合物產(chǎn)生的信號(hào)的存在，其中指示HE4a抗原在所述試驗(yàn)樣品中的存在的所述信號(hào)的存在與對(duì)所述治療的應(yīng)答性相關(guān)聯(lián)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗體中的至少一種包含結(jié)合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原結(jié)合域。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗體由具有ECACC專利保藏物編號(hào):10091401的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。
56.一種用于檢測(cè)宮頸癌在患者中的存在或不存在的方法，所述方法包括:使得自所述受試者的試驗(yàn)卵巢組織樣品與抗體接觸，所述抗體特異性地結(jié)合在SEQ ID N0:HE4中所示的多肽；檢測(cè)結(jié)合試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量；和將結(jié)合所述試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量與預(yù)定的截止值進(jìn)行對(duì)比，其中當(dāng)結(jié)合所述試驗(yàn)卵巢組織樣品中的所述多肽的抗體的量高于所述預(yù)定的截止值時(shí)，所述試驗(yàn)卵巢癌組織樣品是卵巢癌陽(yáng)性的，由此檢測(cè)卵巢癌在所述受試者中的存在或不存在。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中使用免疫組織化學(xué)，確定結(jié)合所述試驗(yàn)卵巢癌組織樣品中的所述多肽的抗體的量。
【文檔編號(hào)】C12N5/16GK103492582SQ201180070210
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月17日
【發(fā)明者】因格戈?duì)柕隆ず諣査固亓_姆, 卡爾-埃里克·赫爾斯特羅姆, 約翰·瑞克瑞夫特, 克里斯汀·費(fèi)爾默, 伊娃·羅耶 申請(qǐng)人:富士瑞生物診斷公司