專利名稱：一種北京棒桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說是涉及一種北京棒桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-谷氨酸又名“麩酸”，是一種酸性氨基酸，L-谷氨酸在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，參與動(dòng)物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)。除此之外，L-谷氨酸還被廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面。在醫(yī)藥化學(xué)方面，L-谷氨酸主要用于治療肝性昏迷，還用于改善兒童智力發(fā)育，是合成某些手性化合物和醫(yī)藥中間體的常用原料；在食品工業(yè)方面，L-谷氨酸除了是生產(chǎn)味精的主要原料之一外，它還可用作代鹽劑、營養(yǎng)增補(bǔ)劑、鮮味劑，也可用作蝦、蟹等水產(chǎn)罐頭中產(chǎn)生磷酸銨鎂結(jié)晶的防止劑；在日用化妝品方面，L-谷氨酸用于生發(fā)劑，能被頭皮吸收， 預(yù)防脫發(fā)并使頭發(fā)新生，對毛乳頭、毛母細(xì)胞有營養(yǎng)功能，并能擴(kuò)張血管，增強(qiáng)血液循環(huán)，有生發(fā)防脫發(fā)功效。用于皮膚，對治療皺紋有療效；在農(nóng)業(yè)方面，L-谷氨酸與某些激素配合， 可制成柑桔增甜劑，還可作為微肥的載體，在氮、磷、鉀肥基本滿足的條件下，作為葉面噴灑的微肥具有投入少、效益高等特點(diǎn)。L-谷氨酸是目前世界上產(chǎn)量最大的氨基酸，現(xiàn)有技術(shù)主要以糖質(zhì)為原料經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生，然后采用“等電點(diǎn)提取”加上“離子交換樹脂”分離獲得。L-谷氨酸產(chǎn)量高低與所采用的微生物種類密不可分，北京棒桿菌是在L-谷氨酸發(fā)酵中常用的菌種之一，但是其 L-谷氨酸產(chǎn)量并不高。因此，提供一種L-谷氨酸高產(chǎn)菌株，對于提高L-谷氨酸的發(fā)酵效率具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種北京棒桿菌及其應(yīng)用，使得所述北京棒桿菌能夠提高L-谷氨酸的產(chǎn)量。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明以野生型北京棒桿菌AS 1.四9 (購自于中國科學(xué)院微生物研究所)為出發(fā)菌株，通過紫外線對其進(jìn)行物理誘變，然后將經(jīng)紫外照射后的北京棒桿菌AS 1. 299的懸浮菌液涂布在含有新霉素的培養(yǎng)基上，從含有新霉素培養(yǎng)基上篩選出具有新霉素抗性的菌株，命名為菌株MHZ-0110。本發(fā)明將上述篩選出的菌株MHZ-0110按照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法對其進(jìn)行生理生化特性檢測，檢測結(jié)果與野生型北京棒桿菌一致。此外， 經(jīng)16S DNA檢測分析，菌株MHZ-0110與野生型北京棒桿菌同源性高達(dá)99%，結(jié)合生理生化特征，鑒定其為北京棒桿菌。本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110已于2011年10月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5360。本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110與野生型北京棒桿菌AS 1. 299的L-谷氨酸發(fā)酵對比試驗(yàn)顯示，本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110發(fā)酵合成的L-谷氨酸含量為^g/L， 而野生型北京棒桿菌AS 1. 299發(fā)酵合成的L-谷氨酸含量為19g/L，L-谷氨酸產(chǎn)量提高了 47. 4%。因此，本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110能夠應(yīng)用于生產(chǎn)L-谷氨酸中。新霉素是一種氨基糖苷類抗生素，通過結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)的核糖體上干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，使之合成異常的蛋白質(zhì)，并使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要生理物質(zhì)外漏而呈現(xiàn)殺菌作用，對靜止期細(xì)菌殺菌作用較強(qiáng)，為靜止期殺菌類抗生素。而本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-Ol 10具有對新霉素的抗性并能提高L-谷氨酸合成能力。在野生菌株獲得新霉素抗性后，可能由于本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110合成異常的蛋白質(zhì)抵抗新霉素，這些異常的蛋白質(zhì)導(dǎo)致L-谷氨酸合成酶系解除了某些產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而導(dǎo)致突變株的L-谷氨酸產(chǎn)量得到提高。此外，本發(fā)明還提供了一種L-谷氨酸生產(chǎn)方法，將保藏編號為CGMCCNo. 5360的北京棒桿菌接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵期間維持PH值為6-9、葡萄糖含量為10-180g/L。其中，作為優(yōu)選，發(fā)酵期間的pH值為6. 5-7. 4，葡萄糖含量為20_100g/L。本發(fā)明所述生產(chǎn)方法可以一直進(jìn)行到不再產(chǎn)生L-谷氨酸為止，然后可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法對L-谷氨酸進(jìn)行分離。對于擴(kuò)繁用的種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵用的發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域公知，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可采用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行L-谷氨酸的發(fā)酵。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述種子培養(yǎng)基由25g/ L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米漿、lg/L KH2P04、0. 4g/L MgSO4 WH2OJmg/!硫酸亞鐵、2mg/L 硫酸錳組成，PH值為6. 8-7. 4。所述發(fā)酵培養(yǎng)基由80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米漿、 1. 2g/L磷酸二氫鉀、0. 7g/L硫酸鎂、2mg/L硫酸亞鐵、2mg/L硫酸錳、200ug/L硫胺素、2mL/L 1 %苯酚紅組成，pH值為6. 8-7. 4。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述保藏編號為CGMCC No. 5360的北京棒桿菌 MHZ-0110以野生型北京棒桿菌AS 1. 299為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外照射后通過含有新霉素培養(yǎng)基篩選得到，其發(fā)酵生成L-谷氨酸的能力較野生型北京棒桿菌顯著提高，L-谷氨酸產(chǎn)量提高了 47. 4%。因此，本發(fā)明所述保藏編號為CGMCC No. 5360的北京棒桿菌能夠廣泛應(yīng)用于 L-谷氨酸的發(fā)酵中。生物保藏信息說明分類命名北京棒桿菌，Corynebacterium pekinense.于2011年10月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 5360。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種北京棒桿菌及其應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的菌株已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110的篩選將出發(fā)菌株-野生型北京棒桿菌AS 1. 299接種在液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)11小時(shí)獲得處于對數(shù)生長期的菌懸液，然后將該菌懸液濃度調(diào)整至每毫升含有約IO8個(gè)細(xì)胞后置于紫外線下照射35秒，最后將經(jīng)過紫外線照射的菌懸液涂布在含有0. 5mg/L新霉素的完全培養(yǎng)基平板上，30°C繼續(xù)培養(yǎng)2天，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落，命名為 MHZ-O110。其中，液體培養(yǎng)基配方如下葡萄糖25g/L、尿素5g/L、玉米漿30g/L、KH2P04 lg/L、 MgSO4 ·7Η20 0. 4g/L、硫酸亞鐵ang/L、硫酸錳ang/L，用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 4后定容至1000ml。完全培養(yǎng)基組成如下新霉素0. 5mg/L、牛肉膏10g、蛋白胨10g、NaC15g、葡萄糖 5g、瓊脂18g，用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 4后定容至1000ml。將上述篩選出的菌株MHZ-0110按照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法對其進(jìn)行生理生化特性檢測，檢測結(jié)果與野生型北京棒桿菌一致。此外，經(jīng)16S DNA檢測分析，菌株MHZ-Ol 10與野生型北京棒桿菌同源性高達(dá)99%，結(jié)合生理生化特征，鑒定其為北京棒桿菌。實(shí)施例2 本發(fā)明所述L-谷氨酸生產(chǎn)方法及L-谷氨酸發(fā)酵對比試驗(yàn)1、發(fā)酵方法將本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110接種在以下所述的種子培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，于 30°C振蕩培養(yǎng)11小時(shí)，將所得培養(yǎng)物接種到以下所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1 10(本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的量適當(dāng)調(diào)節(jié)，本比例只是優(yōu)選比例)，30°C振蕩培養(yǎng)至不再產(chǎn)生L-谷氨酸為止(一般為40小時(shí)左右)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)苯酚紅作為指示劑指示的培養(yǎng)基PH變化情況加入適量尿素，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的PH值介于6. 5-7. 4之間，中間采樣測定其中的葡萄糖含量，使葡萄糖含量介于20-100g/L。種子培養(yǎng)基25g/L 葡萄糖、5g/L 尿素、30g/L 玉米漿、lg/L ΚΗ2Ρ04、0· 4g/LMgS04 WH2OJmg/!硫酸亞鐵、2mg/L硫酸錳，用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 4。發(fā)酵培養(yǎng)基80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米漿、1. 2g/L磷酸二氫鉀、0. 7g/L 硫酸鎂、2mg/L硫酸亞鐵、2mg/L硫酸錳、200ug/L硫胺素、2mL/L 1 %苯酚紅，用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)PH至6. 8-7.4。 2、L-谷氨酸發(fā)酵對比試驗(yàn)將本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110和野生型北京棒桿菌AS 1.299按照上述生產(chǎn)方法同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，兩種菌株的發(fā)酵環(huán)境、接種量均相同，停止發(fā)酵后通過生物傳感儀測定兩種菌株所合成的L-谷氨酸含量。結(jié)果顯示，野生型北京棒桿菌AS 1.299發(fā)酵合成的L-谷氨酸量為19g/L，本發(fā)明所述北京棒桿菌MHZ-0110發(fā)酵合成的L-谷氨酸量為^g/L，突變菌株L-谷氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株AS 1.299提高了 47. 4%。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種北京棒桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 5360。
2.保藏編號為CGMCCNo. 5360的北京棒桿菌在生產(chǎn)L-谷氨酸中的應(yīng)用。
3.—種L-谷氨酸生產(chǎn)方法，其特征在于，將保藏編號為CGMCC No. 5360的北京棒桿菌接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵期間維持 PH值為6-9、葡萄糖含量為10-180g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵期間的pH值為6.5-7. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵期間的葡萄糖含量為 20-100g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基由25g/L葡萄糖、5g/L 尿素、30g/L 玉米漿、lg/L KH2P04、0. 4g/L MgSO4 · 7H20、ang/L 硫酸亞鐵、2mg/L 硫酸錳組成， PH 值為 6. 8-7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由80g/L葡萄糖、20g/ L尿素、8g/L玉米漿、1. 2g/L磷酸二氫鉀、0. 7g/L硫酸鎂、2mg/L硫酸亞鐵、2mg/L硫酸錳、 200ug/L硫胺素、2mL/L 苯酚紅組成，pH值為6. 8-7. 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，公開了一種北京棒桿菌，其保藏編號為CGMCC No.5360。本發(fā)明所述保藏編號為CGMCC No.5360的北京棒桿菌以野生型北京棒桿菌AS 1.299為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外照射后通過含有新霉素培養(yǎng)基篩選得到，其發(fā)酵生成L-谷氨酸的能力較野生型北京棒桿菌顯著提高，L-谷氨酸產(chǎn)量提高了47.4％。因此，本發(fā)明所述保藏編號為CGMCC No.5360的北京棒桿菌能夠廣泛應(yīng)用于L-谷氨酸的發(fā)酵中。
文檔編號C12R1/15GK102399732SQ20111041422
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者何君, 周希貴, 李巖, 胡丹, 胡征宇 申請人:梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司