專利名稱：一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于嗜酸乳桿菌制品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率及菌粉活菌數(shù)的抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)是人和動物腸道內(nèi)的主要微生物之一，也是目前乳酸菌家族中極為重視研究開發(fā)的益生菌。當(dāng)存在一定數(shù)量時(shí)，它能有效地調(diào)節(jié)腸道內(nèi)有益和有害微生物菌群間的平衡，從而達(dá)到促進(jìn)宿主健康的功效。大量科學(xué)研究證明嗜酸乳桿菌具有①緩解乳糖不耐癥；②抑制腸道中的致病菌，預(yù)防腹瀉發(fā)生；③增進(jìn)機(jī)體的免疫能力；④降低血清膽固醇水平；⑤抑制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生成的前體物質(zhì)，預(yù)防癌變細(xì)胞的形成。真空冷凍干燥具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)①蛋白質(zhì)、微生物不產(chǎn)生或較少變性或失去活力；②物料中的揮發(fā)性成分或熱敏性營養(yǎng)成分損失少；③在低溫下，能最好地保持物質(zhì)原來的性狀④干燥后體積、形狀變化，物料呈海綿狀，無干縮，復(fù)水時(shí)，能迅速回復(fù)到原來的性狀；⑤能除去物料中95% -99%的水分，制品保存期長。目前，利用凍干技術(shù)制備和貯存嗜酸乳桿菌菌粉已有很多報(bào)道。然而，由于嗜酸乳桿菌特有的生理性狀，菌體細(xì)胞在冷凍和干燥過程中死亡率很高，造成菌粉中活菌含量低而影響產(chǎn)品質(zhì)量。同時(shí)，要提高菌粉的常溫穩(wěn)定性，還必須把凍干過程對活菌的不良損傷盡可能減少。要實(shí)現(xiàn)此目的，可在凍干前的菌泥中加入復(fù)合保護(hù)劑，這是目前主要采用的方法，如CN200910236172. 8中公開了一種嗜酸乳桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其配方如下9 11 重量份脫脂奶粉、10 12重量份乳糖、0. 3 0. 6重量份甘油、1. 5 2. 5重量份谷氨酸鈉和0. 15 0. 25重量份維生素C ；CN200910056871. 4中也公開了一種嗜酸乳桿菌凍干保護(hù)劑，保護(hù)劑配方各組份重量百分比為谷氨酸鈉0. 1 5. 0%、乳糖0. 1 8. 0%、海藻糖1 15%、抗氧化劑0. 1 1%、脫脂奶粉1 20%、甘油或吐溫-800. 1 5. 0%，其余為水。文獻(xiàn)“PVPK-30對嗜酸乳桿菌的凍干保護(hù)研究”中公開了一種嗜酸乳桿菌保護(hù)劑配方為4% PVP !(。。。(^脫脂乳^^海藻糖、。.5%谷氨酸鈉和4%甘油。除此之外，還可以在培養(yǎng)基中添加一些物質(zhì)，這些物質(zhì)可在培養(yǎng)的過程中積累在嗜酸乳桿菌體內(nèi)或轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，抑制凍干過程中共晶現(xiàn)象的發(fā)生，這些物質(zhì)的添加也可改變嗜酸乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗凍蛋白，從而有效提高嗜酸乳桿菌菌體的抗冷凍能力，可以達(dá)到減少甚至避免菌體凍干損傷、提高活菌存活率和菌粉活菌數(shù)、延長凍干嗜酸乳桿菌菌粉常溫保存期的目的。目前還沒有檢索到有關(guān)嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基方面的發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法，解決了嗜酸乳桿菌在凍干過程中存在的凍干存活率不高，活菌數(shù)低的問題。
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為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基，該抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分16-20g葡萄糖、0. 4-0. Sg蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化鈉、0. 3-0. 5g甘露醇、0. 8-1. 2g谷氨酸鈉，8-12g大豆蛋白胨、0. 5-2. Og檸檬酸氫二銨、0. 2-0. 5g甜菜堿、1. 0-2. 5g磷酸氫二鉀、 0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml 吐溫 80 和 IOOOml 蒸餾水。所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、3. 5g酵母提取物、5. Og氯化鈉、0. 35g甘露醇、1. Og谷氨酸鈉，9. Og大豆蛋白胨、1. 5g檸檬酸氫二銨、 0. 4g甜菜堿、1. 5g磷酸氫二鉀、0. Ig MgS04、0. 8ml吐溫80和IOOOml蒸餾水。所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、4. 5g酵母提取物、4. Og氯化鈉、0. 4g甘露醇、1. 2g谷氨酸鈉，8. Og大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、 0. 5g甜菜堿、1. 5g磷酸氫二鉀、0. Ig MgSO4U. Oml吐溫80和IOOOml蒸餾水。所述嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟(1)將按量稱取的谷氨酸鈉、甜菜堿和甘露醇溶解于50mL蒸餾水中，然后用 0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液；(2)向950mL蒸餾水中加入按量稱取的葡萄糖、蒺藜多糖、酵母提取物、氯化鈉、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、MgSO4和吐溫80，加熱溶解并混合均勻，調(diào)節(jié)pH至 5. 6-6. 0，然后裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，于 118-121°C滅菌15-20min，滅菌后拔下注射器針頭，冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；(3)在超凈工作臺中用無菌注射器將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻，得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。上述嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，包括以下步驟將已活化三次的嗜酸乳桿菌按5%的接種量接入嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基中于 37°C恒溫培養(yǎng)16-1 1，然后在6000rpm離心10-15min，棄去上清液，得嗜酸乳桿菌菌泥，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，核黃素和磷酸緩沖液的加入有利于進(jìn)一步提高凍干存活率，每克菌泥中加入0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍3-12h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、4-6I^a下進(jìn)行冷凍干燥 18-24h，得嗜酸乳桿菌菌粉。本發(fā)明所述嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基含有甘露醇，氯化鈉以及甜菜堿等組分，將各個(gè)組分按照比例混合后制得抗凍培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基獲得的嗜酸乳桿菌具有更高的抗冷凍能力，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)采用該抗凍培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜酸乳桿菌后， 可使其凍干存活率最高達(dá)79. M%，菌粉活菌數(shù)最高達(dá)4. OgXlO^cfu/g，而以嗜酸乳桿菌常用的商業(yè)培養(yǎng)基MRS肉湯培養(yǎng)，制備的菌粉凍干存活率最高僅為49. 72%，活菌數(shù)最高僅為 1. 24X10ncfu/go
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖，3. 5g酵母提取物、5. Og氯化鈉、9. Og大豆蛋白胨、1.5g檸檬酸氫二銨、1.5g磷酸氫二鉀、0. Ig MgSO4和0.8ml吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5. 6，然后裝于厭氧瓶中，裝量為 90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，在118°C滅菌15min，滅菌后拔下注射器針頭，冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；所述蒺藜多糖的制備方法，包括以下步驟將干燥的蒺藜粉碎后過40目篩得蒺藜粉末，向IOOg蒺藜粉末中加入1400mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為4. 8后在55°C水浴保溫下添加蒺藜粉末質(zhì)量2.0%的酶活力為6000U/g的纖維素酶反應(yīng)3. 0h，反應(yīng)后置于電磁爐上，將功率調(diào)至2000W加熱至沸騰，然后調(diào)至1000W并保持20min，然后用布氏漏斗抽濾，收集濾液得蒺藜多糖提取液，將蒺藜多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至IOOg得濃縮液，向濃縮液中加入三倍體積的無水乙醇后在冰箱中靜置16h，然后抽濾，收集濾渣得粗多糖，將粗多糖用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液洗滌，再用氯仿、正丁醇依次洗滌，洗滌后用濾紙過濾，收集濾渣得濕多糖，將濕多糖在45°C烘干至恒重，然后粉碎得蒺藜多糖；準(zhǔn)確稱取0. 4g甜菜堿、0. 35g甘露醇和1. Og谷氨酸鈉溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌得濾液；按照無菌操作要求，在超凈工作臺中用無菌注射器將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻， 得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。將活化好的嗜酸乳桿菌按5% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè) MRS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)中于37°C培養(yǎng)18h，然后在6000r/min離心lOmin，棄去上清液， 獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于-40°C預(yù)凍4h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、5I^下進(jìn)行冷凍干燥20h，即得嗜酸乳桿菌菌粉，凍干存活率為78. 32% (對照培養(yǎng)基為48. 52% )，菌粉活菌數(shù)為3. 79 X IO11Cfu/ g(對照培養(yǎng)基為1. 12X10ncfu/g)o實(shí)施例2準(zhǔn)確稱取20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖，4. 5g酵母提取物、4. Og氯化鈉、8. Og大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、1.5g磷酸氫二鉀、0. Ig MgSO4和1.0ml吐溫80溶解于950mL 蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6. 0，然后裝于厭氧瓶中，裝量為 90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，在118°C滅菌15min，滅菌后拔下注射器針頭，冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；所述蒺藜多糖的制備方法，其中，水浴保溫的溫度為55°C，濕多糖的烘干溫度為 55 °C，其他步驟同實(shí)施例1 ；準(zhǔn)確稱取0. 5g甜菜堿、0. 4g甘露醇和1. 2g谷氨酸鈉溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌得濾液；按照無菌操作要求，在超凈工作臺中用無菌注射器將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻， 得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。將活化好的嗜酸乳桿菌按5% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè) MRS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)中于37°C培養(yǎng)16h，然后在6000r/min離心lOmin，棄去上清液， 獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于-40°C預(yù)凍4h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、5I^下進(jìn)行冷凍干燥Mh，即得嗜酸乳桿菌菌粉，凍干存活率為76. 69 % (對照培養(yǎng)基為47. 21 % )，菌粉活菌數(shù)為3. 62 X IO11Cfu/ g(對照培養(yǎng)基為1.20X10ncfu/g)o實(shí)施例3準(zhǔn)確稱取19g葡萄糖、0. 4g蒺藜多糖，5. Og酵母提取物、6. Og氯化鈉、12. Og大豆蛋白胨、0. 5g檸檬酸氫二銨、1. Og磷酸氫二鉀、0. 2g MgSO4和0. 5ml吐溫80溶解于950mL 蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5. 8，然后裝于厭氧瓶中，裝量為 90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，在120°C滅菌15min，滅菌后拔下注射器針頭，冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；所述蒺藜多糖的制備方法，其中，水浴保溫的溫度為50°C，濕多糖的烘干溫度為 50°C，其他步驟同實(shí)施例1 ；準(zhǔn)確稱取0. 3g甜菜堿、0. 3g甘露醇和0. Sg谷氨酸鈉溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌得濾液；按照無菌操作要求，在超凈工作臺中用無菌注射器將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻， 得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。將活化好的嗜酸乳桿菌按5% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè) MRS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)中于37°C培養(yǎng)18h，然后在6000r/min離心15min，棄去上清液， 獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于-40°C預(yù)凍12h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、6I^a下進(jìn)行冷凍干燥18h，即得嗜酸乳桿菌菌粉，凍干存活率為75. 47% (對照培養(yǎng)基為46. 83% )，菌粉活菌數(shù)為3. 57X IO11Cfu/ g(對照培養(yǎng)基為1. 15X10ncfu/g)o實(shí)施例4準(zhǔn)確稱取16g葡萄糖、0. 8g蒺藜多糖，3. Og酵母提取物、6. Og氯化鈉、10. Og大豆蛋白胨、1. Og檸檬酸氫二銨、2. 5g磷酸氫二鉀、0. 15g MgSO4和0. 5ml吐溫80溶解于950mL 蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6. 0，然后裝于厭氧瓶中，裝量為 90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，在121°C滅菌20min，滅菌后拔下注射器針頭，冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；所述蒺藜多糖的制備方法，其中，水浴保溫的溫度為53°C，濕多糖的烘干溫度為 60°C，其他步驟同實(shí)施例1。準(zhǔn)確稱取0. 2g甜菜堿、0. 5g甘露醇和0. Sg谷氨酸鈉溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌得濾液；按照無菌操作要求，在超凈工作臺中用無菌注射器將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻， 得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。將活化好的嗜酸乳桿菌按5% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè) MRS培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)中于37°C培養(yǎng)17h，然后在6000r/min離心12min，棄去上清液， 獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，其加量按每克菌泥添加0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml的pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于-40°C預(yù)凍3h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、4I^下進(jìn)行冷凍干燥22h，即得嗜酸乳桿菌菌粉，凍干存活率為77. 28 % (對照培養(yǎng)基為47. 91 % )，菌粉活菌數(shù)為3. 71 X IO11Cfu/
6g(對照培養(yǎng)基為1. 19X10ncfu/g)o
權(quán)利要求
1.一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于該抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分16-20g葡萄糖、0. 4-0. 8g蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化鈉、0. 3-0. 5g甘露醇、0. 8-1. 2g谷氨酸鈉，8-12g大豆蛋白胨、0. 5-2. Og檸檬酸氫二銨、0. 2-0. 5g甜菜堿、 1. 0-2. 5g 磷酸氫二鉀、0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml 吐溫 80 和 IOOOml 蒸餾水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分18g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、3. 5g酵母提取物、5. Og氯化鈉、0. 35g 甘露醇、1. Og谷氨酸鈉，9. Og大豆蛋白胨、1. 5g檸檬酸氫二銨、0. 4g甜菜堿、1. 5g磷酸氫二鉀、0. lgMgS04、0. 8ml 吐溫 80 和 IOOOml 蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分20g葡萄糖、0. 5g蒺藜多糖、4. 5g酵母提取物、4. Og氯化鈉、0. 4g 甘露醇、1. 2g谷氨酸鈉，8. Og大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、0. 5g甜菜堿、1. 5g磷酸氫二鉀、0. IgMgSO4U. Oml 吐溫 80 和 IOOOml 蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟(1)將稱取的谷氨酸鈉、甜菜堿和甘露醇溶解于50mL蒸餾水中，然后用0.22μπι濾膜過濾除菌得濾液；(2)向950mL蒸餾水中加入稱取的葡萄糖、蒺藜多糖、酵母提取物、氯化鈉、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、MgSO4和吐溫80，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至5. 6-6. 0,然后于 118-121°C滅菌15-20min，滅菌后冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；(3)將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻，得嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基。
5.一種如權(quán)利要求1所述嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟將活化的嗜酸乳桿菌按5%的接種量接入嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基中于37 °C培養(yǎng) 16-1他，然后在6000rpm離心10-15min，得嗜酸乳桿菌菌泥，向菌泥中加入脫脂奶粉、核黃素和磷酸緩沖液，每克菌泥中加入0. 2g脫脂奶粉、0. 006g核黃素和0. 8ml pH6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍3-12h，然后放入凍干機(jī)中于-56°C、4-6I^a下進(jìn)行冷凍干燥 18-24h，得嗜酸乳桿菌菌粉。
全文摘要
本發(fā)明提供一種嗜酸乳桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法包括16-20g葡萄糖、0.4-0.8g蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化鈉、0.3-0.5g甘露醇、0.8-1.2g谷氨酸鈉，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g檸檬酸氫二銨、0.2-0.5g甜菜堿、1.0-2.5g磷酸氫二鉀、0.1-0.2g MgSO4、0.5-1.0ml吐溫80和1000ml蒸餾水。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)采用該抗凍培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜酸乳桿菌后，可使其凍干存活率最高達(dá)79.54％，菌粉活菌數(shù)最高達(dá)4.09×1011cfu/g，而以嗜酸乳桿菌MRS肉湯培養(yǎng)，制備的菌粉凍干存活率僅為49.72％，活菌數(shù)僅為1.24×1011cfu/g。
文檔編號C12N1/04GK102408992SQ201110376538
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者張華 , 王娟, 秦濤, 舒國偉, 蔡寧岡, 陳合, 馬齊 申請人:陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院