專利名稱：一種巴馬香豬體細胞克隆的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物繁殖、動物胚胎生物技術，具體是一種巴馬香豬體細胞克隆的方法。
背景技術：
至今并未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明相同或相似的報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了 1.解決人類異種器官移植所進行轉基因豬研究必需的關鍵技術問題，為基因打靶豬和異種器官移植等研究奠定基本而又必要的研究手段。2.為具有重要經(jīng)濟價值的優(yōu)良地方品種巴馬香豬的保種開辟了一條新的途徑，也可大量繁育其它具有優(yōu)良性狀的種豬，解決優(yōu)良種豬引種、保種和品種改良等問題，大大加快優(yōu)良種豬引種、保種和品種改良的速度。3.對探討豬早期胚胎發(fā)育的全能性，揭示豬胚胎、組織、個體發(fā)育中基因組印跡現(xiàn)象的本質，對研究發(fā)育過程中同種動物或異種動物核質互作關系，特別是對解決核遺傳物質(核DNA)與細胞質遺傳物質(線粒體DNA)的調(diào)控和相容性等發(fā)育核心問題均具有重要價值。提供一種具有重要經(jīng)濟價值的優(yōu)良地方品種巴馬香豬體細胞克隆的方法。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下一種巴馬香豬體細胞克隆的方法，是按以下步驟進行操作1.相關試劑的配制 1)磷酸鹽緩沖液DPBS的配制磷酸鹽緩沖液DPBS的配制稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和鏈霉素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解后，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分
裝，4°C保存。2)體細胞培養(yǎng)液DMEM的配制體細胞培養(yǎng)液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L，44mM NaHCO3, ImM丙酮酸鈉， 66mg/L青霉素鈉和100mg/L硫酸鏈霉素，體積百分濃度10% -15%的FCS和體積百分濃度
的非必需氨基酸。根據(jù)以上配方，將DMEM粉末溶于超純水中，加入NaHCO3，丙酮酸鈉，青霉素鈉和硫酸鏈霉素，然后調(diào)PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于4°C 備用；使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱平衡。3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配制細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. ^igAilEDTA-Nii4。根據(jù)以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解于磷酸緩沖液中，充分溶解完后，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于-20°C備用。4)體細胞冷凍液的配制體積百分濃度10-15% FCS的DMEM培養(yǎng)液中加入體積百分濃度10% DMSO ；5)洗卵液的配制洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調(diào)pH至7. 3-7. 4后，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放于4°C保存，1-4周內(nèi)用完，使用前放在35-39°C恒溫箱中預熱。6)豬卵泡液的配制抽取豬卵巢上直徑3_8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°c至_80°C保存?zhèn)溆谩?) FSH和LH儲存液的配制取體外成熟液儲液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中，再加入FSH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C至_80°C保存?zhèn)溆?；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1. 0 μ g/ml。取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中，再加入LH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C至-80°C保存?zhèn)溆?；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1. 0 μ g/ml。8) EGF儲液的配制稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C至_80°C 保存?zhèn)溆?；使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml。9)體外成熟液的配制體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate, 26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4 · 2H20, 75 μ g/mlPenicillin G,50y g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存?zhèn)溆茫皇褂们?，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液，再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡備用。10)胚胎培養(yǎng)液的配制采用NCSU-23或者PZM-3培養(yǎng)液用于重構胚胎的體外培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，1-4周內(nèi)用完。11)核移植操作液的配制在洗卵液中添加體積百分濃度5-15% FCS和5_7. 5 μ g/ml細胞松弛素B，使用前將其放在35-39°C恒溫箱中預熱。12)融合激活液稱取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0. 5mM Hepes,0. 3% BSA或者0. lg/L PVA0用超純水定容，調(diào)整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4 °C保存，使用前在30-39 °C恒溫箱中預熱。13)細胞松弛素B的配制用DMSO溶解細胞松弛素B，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C凍存，最終工作濃度為 5-7. 5 μ g/ml。
14)透明質酸酶儲存液的配制透明質酸酶儲存液的配制稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 過濾，分裝到Eppendorf管中，-20°C至_80°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為Hmg/ml。2.巴馬香豬睪丸細胞的體外培養(yǎng)采集當?shù)匕婉R香豬養(yǎng)殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液或者生理鹽水中清洗，然后用體積百分濃度75%酒精快速清洗后，再用含青、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液或者生理鹽水中徹底清洗；在超凈工作臺內(nèi)，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎， 加入磷酸緩沖液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉淀中加入少許DMEM培養(yǎng)液，移到培養(yǎng)皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天加入DMEM培養(yǎng)液；以后每2-3天換液一次，待細胞長到70-80% 匯合時，輕輕撥掉組織塊，然后將其和培養(yǎng)液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然后加入DMEM終止消化，并輕輕吹打；然后將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清，再向離心管中加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液，重懸細胞，調(diào)整濃度后，接種到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍。3.巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養(yǎng)長到70-90%匯合時，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻后分裝到細胞凍存管內(nèi)，于4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜后直接將凍存管放入液氮中。4.冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入30-37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化后，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養(yǎng)液，離心清洗，然后用預熱的DMEM調(diào)整到所需的細胞濃度后接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)。5)豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)從當?shù)厣i肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有含青、鏈霉素的30-37°C生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液中，送回實驗室，用含青、鏈霉素的生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液沖洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5-1小時，用洗卵液稀釋后放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最后放入含F(xiàn)SH和LH的成熟液滴中，培養(yǎng)20-22小時，然后移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續(xù)培養(yǎng)20-22小時，培養(yǎng)條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和濕度、38. 5_39°C。6.核移植1)卵母細胞的準備將體外培養(yǎng)40_44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞，用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用。2)巴馬香豬睪丸細胞的準備
選擇3-10代生長狀態(tài)良好的細胞，去除培養(yǎng)液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然后將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清后加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然后再向混合液中加入細胞松弛素B，使最終使用濃度為 5-7. 5μ g/ml。3)操作滴的準備用上述調(diào)整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑， 細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，并輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵。4)重構卵的融合/激活和培養(yǎng)將重構卵放在含有細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中，然后把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然后進行融合/激活，融合后的重構卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，放入平衡好的含細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養(yǎng)液洗滌， 然后移到胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和濕度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內(nèi)相應部位，懷孕到期后產(chǎn)下體細胞克隆的巴馬香豬。發(fā)明的有益效果是1.對社會的意義1)為加快國內(nèi)轉基因豬技術和人類異種器官移植的研究做出了貢獻；2)加快了廣西乃至全國畜牧業(yè)發(fā)展水平的速度；3)為國內(nèi)同類研究奠定了技術基礎；4)對培養(yǎng)人才、推廣科學知識起到了積極作用。2.對科技進步的意義1)在學術上填補了國內(nèi)空白；2)在國內(nèi)學術界有廣泛而深遠的影響。


圖1是本發(fā)明有關克隆巴馬香豬的照片。圖中A是新生克隆巴馬香豬及其代孕母親陸川豬的照片；B是成年后的該克隆巴馬香豬的照片；C是新生Fl代雜交豬及其母親陸川豬的照片；D是斷奶后的Fl代雜交豬的照片；E是F2代雜交豬的照片。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。必須說明在權利要求書中所有工藝條件下進行克隆試驗結果與本實施例結果相似。實施例1.相關試劑的配制(1)磷酸鹽緩沖液DPBS的配制
磷酸鹽緩沖液DPBS的配制稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和鏈霉素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解后，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存；(2)體細胞培養(yǎng)液DMEM的配制體細胞培養(yǎng)液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L,44mM NaHC03, ImM丙酮酸鈉， 66mg/L青霉素鈉和100mg/L硫酸鏈霉素，體積百分濃度15%的FCS和體積百分濃度1 %的
非必需氨基酸；根據(jù)以上配方，將DMEM粉末溶于超純水中，加入NaHCO3,丙酮酸鈉，青霉素鈉和硫酸鏈霉素，然后調(diào)PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于4°C 備用；使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱平衡；(3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配制細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根據(jù)以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解于磷酸緩沖液中，充分溶解完后，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于-20°c備用；(4)體細胞冷凍液的配制體積百分濃度15% FCS的DMEM培養(yǎng)液中加入體積百分濃度10% DMSO ；(5)洗卵液的配制洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調(diào)pH至7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放于4°C保存，4周內(nèi)用完，使用前放在39。C恒溫箱中預熱(6)豬卵泡液的配制抽取豬卵巢上直徑3_8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°c保存?zhèn)溆茫?7) FSH和LH儲存液的配制取體外成熟液的儲存液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中， 再加入FSH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C保存?zhèn)溆?；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中，再加入LH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C保存?zhèn)溆茫皇褂脮r將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5 μ g/ml ；(8)體外成熟液的配制體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4· 2H20,75 μ g/mlPenicillin G,50 μ g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存?zhèn)溆?；使用前，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液， 再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡備用；(9)胚胎培養(yǎng)液的配制采用NCSU-23培養(yǎng)液用于重構胚胎的體外培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為 0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，4周內(nèi)用完；
(10)核移植操作液的配制在洗卵液中添加體積百分濃度15% FCS和7. 5 μ g/ml細胞松弛素B，使用前將其放在39°C恒溫箱中預熱；(11)融合激活液稱取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. lg/L PVA。用超純水定容，調(diào)整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，使用前在39°C恒溫箱中預熱；(12)細胞松弛素B的配制用DMSO溶解細胞松弛素B，分裝到Eppendorf管中，-20至_80°C凍存，最終工作濃度為7. 5 μ g/ml ；(13)透明質酸酶儲存液的配制透明質酸酶儲存液的配制稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 過濾，分裝到Eppendorf管中，_20°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為2mg/ml ；(14) EGF儲液的配制稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C保存?zhèn)溆茫?使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml ；2.巴馬香豬睪丸細胞的體外培養(yǎng)采集當?shù)匕婉R香豬養(yǎng)殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈霉素的磷酸緩沖液或者生理鹽水中清洗，然后用體積百分濃度75%酒精快速清洗后，再用含青、鏈霉素的磷酸緩沖液或者生理鹽水中徹底清洗；在超凈工作臺內(nèi)，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎， 加入磷酸緩沖液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉淀中加入少許DMEM培養(yǎng)液，移到培養(yǎng)皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天加入DMEM培養(yǎng)液；以后每2天換液一次，待細胞長到70-80%匯合時，輕輕撥掉組織塊，然后將其和培養(yǎng)液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然后加入DMEM終止消化，并輕輕吹打；然后將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清， 再向離心管中加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液，重懸細胞，調(diào)整濃度后，接種到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍；3.巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養(yǎng)長到70-90%匯合時，用磷酸緩沖液清洗細胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻后分裝到細胞凍存管內(nèi)，于4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜后直接將凍存管放入液氮中；4.冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化后，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養(yǎng)液，離心清洗，然后用預熱的 DMEM調(diào)整到所需的細胞濃度后接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)；5.豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)
從當?shù)厣i肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有青、鏈霉素的30-37°C生理鹽水或者磷酸緩沖液中，送回實驗室，用含青、鏈霉素的生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液沖洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5小時，用洗卵液稀釋后放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有 2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最后放入含F(xiàn)SH和LH的成熟液滴中，培養(yǎng)20-22小時，然后移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續(xù)培養(yǎng)20-22小時，培養(yǎng)條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和濕度、39°C ；6.核移植(1)卵母細胞的準備將體外培養(yǎng)40_44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞，用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用；(2)巴馬香豬睪丸細胞的準備選擇3-10代生長狀態(tài)良好的細胞，去除培養(yǎng)液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然后將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清后加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然后再向混合液中加入細胞松弛素B，最終使用濃度為 7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的準備用上述調(diào)整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑， 細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，并輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵；(4)重構卵的融合/激活和培養(yǎng)將重構卵放在含有細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中，然后把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然后進行融合/激活，融合后的重構卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，放入平衡好的含細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養(yǎng)液洗滌， 然后移到胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和濕度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內(nèi)相應部位，懷孕到期后產(chǎn)下體細胞克隆的巴馬香豬。7.結果2007年度進行巴馬香豬體細胞核移植胚胎的胚胎移植4頭·次，結果于2007年 10月產(chǎn)下一頭體細胞克隆的雄性巴馬香豬，從毛色、體型、性別和DNA鑒定，都證明是巴馬香豬克隆豬。該雄性克隆巴馬香豬成年后與13頭陸川豬母豬配種，其中3頭母豬返情，受胎10 頭，產(chǎn)仔10窩共98頭仔豬，活產(chǎn)93頭，即該雄性克隆巴馬香豬已經(jīng)繁殖出了 93頭活仔豬后代，說明該雄性克隆巴馬香豬具有正常的繁殖能力。隨機選擇該雄性克隆巴馬香豬的雌性后代3頭，進行人工輸精配種，受胎3頭，產(chǎn)仔3窩共22頭仔豬，活產(chǎn)14頭，說明該雄性克隆巴馬香豬的后代也具備正常的繁殖能力。
表1 克隆巴馬小型豬及其Fl后代遺傳分析
權利要求
1. 一種巴馬香豬體細胞克隆的方法，其特征在于，按以下步驟進行操作1)相關試劑的配制(1)磷酸鹽緩沖液DPBS的配制磷酸鹽緩沖液DPBS的配制稱取DPBS粉劑9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和鏈霉素 100 μ g/L,超純水定容，待藥品充分溶解后，用滅菌的濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存；(2)體細胞培養(yǎng)液DMEM的配制體細胞培養(yǎng)液DMEM的成分為DMEM粉劑9. 5g/L，44mM NaHC03, ImM丙酮酸鈉，66mg/L 青霉素鈉和100mg/L硫酸鏈霉素，體積百分濃度10% -15%的FCS和體積百分濃度1 %的非必需氨基酸；根據(jù)以上配方，將DMEM粉末溶于超純水中，加入NaHCO3，丙酮酸鈉，青霉素鈉和硫酸鏈霉素，然后調(diào)PH至7. 2-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于4°C備用； 使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱平衡；(3)細胞傳代消化液胰蛋白酶的配制細胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根據(jù)以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Na4溶解于磷酸緩沖液中，充分溶解完后，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾除菌，分裝后儲于_20°C備用；(4)體細胞冷凍液的配制體積百分濃度10-15% FCS的DMEM培養(yǎng)液中加入體積百分濃度10% DMSO ；(5)洗卵液的配制洗卵液為改良TL-ifepes-PVA液，調(diào)pH至7. 3-7. 4后，用濾膜孔徑為0. 22 μ m濾器過濾分裝，放于4°C保存，1-4周內(nèi)用完，使用前放在35-39°C恒溫箱中預熱；(6)豬卵泡液的配制抽取豬卵巢上直徑3-8mm卵泡的卵泡液，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，-20°C至_80°C保存?zhèn)溆茫?7)FSH和LH儲存液的配制取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中，再加入FSH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C至_80°C保存?zhèn)溆?；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1.0 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的儲存液放入小瓶內(nèi)，稱量少量BSA或者血清溶解于該儲存液中，再加入LH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20°C至-80°C保存?zhèn)溆?；使用時將其添加到豬卵母細胞成熟液中，最終濃度為0. 5-1.0 μ g/ml ；(8)EGF儲液的配制稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液儲存液中，分裝，_20°C至_80°C保存?zhèn)溆?；使用時稀釋，最終使用濃度為lOng/ml ；(9)體外成熟液的配制體外成熟液儲液為改良的TCM-199，其成分為3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA ‘ Na4‘ 2H20,75 μ g/mlPenicillin G，50 μ g/ml Str印tomycin，用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存?zhèn)溆茫皇褂们?，在成熟液儲液中添加最終使用濃度為0. 57mM的半胱氨酸、最終使用濃度為lOng/ml的EGF、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的FSH、最終使用濃度為0. 5-1 μ g/ml的LH和最終使用濃度為10%的卵泡液，再次用濾孔為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡備用；(10)胚胎培養(yǎng)液的配制采用NCSU-23或者PZM-3培養(yǎng)液用于重構胚胎的體外培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7. 2-7. 3，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，1-4周內(nèi)用完；(11)核移植操作液的配制在洗卵液中添加體積百分濃度5-15% FCS和5-7. 5 μ g/ml細胞松弛素B，使用前將其放在35-39°C恒溫箱中預熱；(12)融合激活液稱取 0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. 3% BSA 或者0. lg/L PVA。用超純水定容，調(diào)整pH值7. 3-7. 4，用濾膜孔徑為0. 22 μ m的濾器過濾，分裝，4°C保存，使用前在30-39°C恒溫箱中預熱；(13)細胞松弛素B的配制用DMSO溶解細胞松弛素B，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C凍存，最終工作濃度為 5-7. 5 μ g/ml ；(14)透明質酸酶儲存液的配制透明質酸酶儲存液的配制稱取透明質酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，過濾，分裝到Eppendorf管中，_20°C至_80°C保存；使用時稀釋，使用最終濃度為Hmg/ml ；2)巴馬香豬睪丸細胞的體外培養(yǎng)采集當?shù)匕婉R香豬養(yǎng)殖場給雄性巴馬香豬去勢的睪丸組織，將其放入含青、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液或者生理鹽水中清洗，然后用體積百分濃度為75%酒精快速清洗后，再用含青、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液或者生理鹽水中徹底清洗；在超凈工作臺內(nèi)，把去勢的睪丸組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎，加入磷酸緩沖液或者生理鹽水，移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉淀中加入少許 DMEM培養(yǎng)液，移到培養(yǎng)皿中攤均勻，轉入體積百分濃度5% CO2、溫度37°C和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天加入DMEM培養(yǎng)液；以后每2-3天換液一次，待細胞長到70-80 %匯合時，輕輕撥掉組織塊，然后將其和培養(yǎng)液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然后加入DMEM終止消化，并輕輕吹打；然后將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清， 再向離心管中加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液，重懸細胞，調(diào)整濃度后，接種到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天換液一次。70-90%匯合時，將細胞傳代或冷凍；3)巴馬香豬睪丸細胞的冷凍睪丸細胞體外培養(yǎng)長到70-90%匯合時，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細胞變圓部分細胞已脫壁時迅速加入DMEM終止消化，吹打至細胞完全脫壁，把細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細胞凍存液，吹打均勻后分裝到細胞凍存管內(nèi)，于4°C冰箱中置0. 5個小時，再放入-80°C冰箱過夜，過夜后直接將凍存管放入液氮中；4)冷凍睪丸細胞的解凍從-80°C液氮中取出凍存管，快速投入30-37°C溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化后，將細胞懸液轉移至離心管中，加入預熱的DMEM培養(yǎng)液，離心清洗，然后用預熱的 DMEM調(diào)整到所需的細胞濃度后接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)；5)豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)從當?shù)厣i肉類加工廠收集豬卵巢，放入含有含青、鏈霉素的30-37°C生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液中，送回實驗室，用含青、鏈霉素的生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液沖洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2 6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置0. 5-1小時，用洗卵液稀釋后放在實體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有2層以上卵丘細胞、胞質均勻的卵母細胞，在洗卵液中洗滌，用預平衡的成熟液洗滌，最后放入含F(xiàn)SH和LH的成熟液滴中，培養(yǎng)20-22小時，然后移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續(xù)培養(yǎng)20-22小時，培養(yǎng)條件為體積百分濃度5% CO2、最大飽和濕度、38. 5-39°C ；6)核移植(1)卵母細胞的準備將體外培養(yǎng)40-44h的豬卵母細胞在透明質酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細胞， 用玻璃撥卵針在實體顯微鏡下輕輕轉動卵母細胞，挑選出胞質均勻且有極體排放的卵母細胞為核移植備用；(2)巴馬香豬睪丸細胞的準備選擇3-10代生長狀態(tài)良好的細胞，去除培養(yǎng)液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的細胞已脫壁時，加入預熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然后將細胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入核移植操作液，重懸睪丸細胞離心洗滌，棄上清后加入核移植操作液，重懸睪丸細胞，然后再向混合液中加入細胞松弛素B，使最終使用濃度為 5-7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的準備用上述調(diào)整好的睪丸細胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋礦物油，將挑選出的卵母細胞放在上述長條型液滴中，在顯微操作儀下去核操作；吸取中等大小圓形、表面光滑，細胞膜折光度較好的睪丸供體細胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，并輕點透明帶使睪丸供體細胞與卵母細胞膜接觸良好，形成了重構卵；(4)重構卵的融合/激活和培養(yǎng)將重構卵放在含有細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中，然后把恢復好的重構卵移到融合液中洗滌，然后進行融合/激活，融合后的重構卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，放入平衡好的含細胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)3個小時，挑選融合好的重構卵，用胚胎培養(yǎng)液洗滌，然后移到胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C，體積百分濃度5% CO2，最大飽和濕度，得到體細胞核移植胚胎，將體細胞核移植胚胎移植到受體雌豬體內(nèi)相應部位，懷孕到期后產(chǎn)下體細胞克隆的巴馬香豬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巴馬香豬體細胞克隆的方法。方法按以下步驟進行操作1)相關試劑的配制；2)巴馬香豬體細胞的培養(yǎng)；3)巴馬香豬體細胞的冷凍；4)冷凍體細胞的解凍；5)豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng)；6)體細胞核移植及胚胎移植。本發(fā)明的有益效果是1)加快國內(nèi)轉基因豬技術和人類異種器官移植的研究。2)加快了廣西乃至全國畜牧業(yè)發(fā)展水平的速度。3)在學術上填補了國內(nèi)空白。
文檔編號C12N15/877GK102321670SQ20111031119
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者盧克煥, 盧晟盛 申請人:廣西大學