專利名稱：與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜(cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(cucumis) —年蔓生的草本植物。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一，占全國蔬菜面積的10%左右。目如已鑒定的品質(zhì)基因多為感觀品質(zhì)基因，如果瘤有無、果刺顏色、果刺多少、果皮顔色和果皮組織結(jié)構(gòu)等。我國的華北類型黃瓜果實上的果瘤和果刺大而且多，華南類型黃瓜果瘤和果刺大比較少，歐洲溫室類型黃瓜無果瘤，果刺小而且少，被稱為“水果”黃瓜，其市場價格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑的黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測表明無瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有瘤多刺的黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。表皮毛是大多數(shù)植物地上部分所具有的ー種特化的結(jié)構(gòu)，它由表皮細胞發(fā)育而來，形態(tài)多樣，有絲狀、螺狀、鱗片狀、盾狀、分枝狀、頭狀、塊狀等。按不同的分類方法，可分為單細胞和多細胞的表皮毛，有分支和無分支的表皮毛，有腺體和無腺體的表皮毛，植物表皮毛具有一系列功能，如抵御UV的傷害，應(yīng)對干旱脅迫，降低輻射熱，保護植物免受毒素、草食動物、昆蟲和病原菌的侵害等。此外，一些類型的表皮毛也有重要的經(jīng)濟價值，如棉纖維是錦葵科棉屬植物的種籽上被覆的纖維，又稱棉花，簡稱棉，是紡織エ業(yè)的重要原料。通過組織學觀察發(fā)現(xiàn)，黃瓜的表皮毛為多細胞、有腺體或無腺體表皮毛，果實上的果刺與葉片上的剛毛形態(tài)結(jié)構(gòu)一祥，均為多細胞無腺體的表皮毛。普通黃瓜植株的莖葉表面用肉眼即可看到一根根直立的剛毛，在解剖鏡下觀察，剛毛是由4-9個長形細胞組成，縱狀排列成針狀，基部的細胞膨大，頂端細胞呈針尖狀，細胞壁角質(zhì)化，剛毛硬而脆。黃瓜植株莖、葉、卷須、花萼、子房表面均覆有剛毛，多數(shù)子房表面有瘤狀突起，瘤上有刺。瘤上有小刺,果實發(fā)育膨大,表面的瘤刺也隨之長大。

模式植物擬南芥的表皮毛是由單個表皮原細胞發(fā)育而成的單細胞無腺體表皮毛；在植物表面這種由表皮細胞到表皮毛的分化不是隨機發(fā)生的，而是有其嚴格的調(diào)控模式的；擬南芥的許多與表皮毛分化相關(guān)的突變體的其他性狀并不發(fā)生變化。目前，擬南芥表皮毛的形成已經(jīng)成為研究細胞形態(tài)建成的模式系統(tǒng)。擬南芥葉片表皮毛的發(fā)育是一個在時空上受到嚴格調(diào)控的過程，其發(fā)育涉及多個基因的參與。擬南芥表皮毛發(fā)育的正調(diào)控因子包括3類蛋白質(zhì)由TRANSPARENTTESTAGLABRA I (TTGl)基因編碼的 WD40 類蛋白、由 GLABRA1 (GLl)，MYB23 和 MYB5 編碼的 R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子以及由GLABRA3(GL3)和ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3)編碼的bHLH蛋白。這3個蛋白組成ー個三聚體復合物，決定表皮毛發(fā)育的起始。反向調(diào)控因子為由6個功能冗余的家族基因括編碼的R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子，這些基因包括CAPRCE (CPC)，TRIPTYCHON(TRY)，ENHANCER OF TRY AND CPCl (ETCl)，ETC2，ETC3and TRICHOMELESSI (TCLl)。擬南芥表皮毛起始發(fā)育模式的核心是GL1-GL3/EGL3-TTG1蛋白復合體驅(qū)動下游基因GL2的表達，使表皮細胞分化成為表皮毛。與GLl和GL3/EGL3類似，TRY在分裂的表皮細胞中表達，在表皮毛前體細胞中尤為活躍。前人研究表明TRY可以打亂GLl和GL3之間的互作，抑制GL1-GL3/EGL3-TTG1形成的數(shù)量。TRY基因編碼的R3MYB蛋白可以通過競爭性地打破GLl蛋白和GL3蛋白之間的互作來阻礙GL1-GL3/EGL3-TTG1蛋白復合體的形成，導致GL2無法正常表達，從而抑制表皮毛的形成。try的突變體表現(xiàn)為表皮毛成簇生長，過表達TRY的擬南芥植株則表現(xiàn)為完全無毛，說明擬南芥TRY基因可以抑制表皮毛前體細胞周圍的表皮細胞分化為表皮毛細胞。黃瓜、煙草、矮牽牛和番茄的表皮毛是多細胞的，而擬南芥表皮毛是單細胞的。前人研究發(fā)現(xiàn)黃瓜TTGl基因可以互補擬南芥ttgl突變體的表型；棉花TRY基因可以抑制煙草葉片表皮毛的發(fā)育；擬南芥GLl基因的過表達并不影響煙草表皮毛的形成；玉米中的一個R-1ike bHLH基因與玉米表皮毛的形成無關(guān)，它的過表達卻可以使擬南芥的葉和莖上的表皮毛數(shù)量増加，但對煙草、矮牽牛和番茄表皮毛的形成卻沒有影響。這些研究結(jié)果說明單細胞和多細胞表皮毛的形成機制有相似之處，但又不盡相同。與單細胞表皮毛相比，多細胞表皮毛的形成機制可能更為復雜，還需要在更多的其它植物種類上研究分析表皮毛形成的機制。目前對TRY基因在黃瓜果刺這種多細胞表皮毛植物中是否存在的研究從未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的ー個目的是提供與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白，名稱為CsTRY，來源于黃瓜(Cumcumis sativus L.),是如下 I)或 2)的蛋白質(zhì)I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列I由82個氨基酸殘基組成。所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由249個堿基組成，編碼具有序列表中序列I所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明保護的范圍。所述重組表達載體為在載體msl300的多克隆位點間插入所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。擴增所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍；
所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，表皮毛發(fā)育受抑制的轉(zhuǎn)基因植物。
所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因是通過所述重組表達載體導入目的植物中。所述重組表達載體為在載體msl300的多克隆位點間插入所述與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因得到的重組表達載體。所述目的植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或黃瓜。所述表皮毛發(fā)育受抑制體現(xiàn)為與所述目的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的表皮毛數(shù)目減少。本發(fā)明構(gòu)建了與表皮毛發(fā)育相關(guān)基因CsTRY的過表達載體，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，證明異源CsTRY的過量表達可引起擬南芥葉片表皮毛的大量減少，且可使擬南芥中GLABRA2 (GL2), TRICHOMELESS I (TCLl)等基因的表達量顯著下降。這表明CsTRY基因可能與擬南芥TRY基因一祥，抑制了表皮毛的形成。本發(fā)明將在黃瓜品質(zhì)改良中具有重要作用。


圖1為轉(zhuǎn)CsTRY基因擬南芥植株表型。圖2為轉(zhuǎn)CsTRY基因擬南芥植株表皮毛起始形成相關(guān)基因的半定量RT-PCR分析；其中1、2、3分別為轉(zhuǎn)CsTRY基因擬南芥植株的3個株系。GL1、GL2、EGL3、TTG1為表皮毛起始形成的正調(diào)控基因；TRY、TCL1、CPC、ETC1、ETC2及ETC3為負調(diào)控基因，ACTIN2為內(nèi)參。圖3為轉(zhuǎn)CsTRY基因擬南芥植株表皮毛起始形成相關(guān)基因的熒光定量PCR分析；其中35S: :CsTRY-U2,3分別表示轉(zhuǎn)CsTRY基因擬南芥的3個株系。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)基因CsTRY的克隆一、材料以黃瓜津研4號(購自天津市農(nóng)業(yè)科學院黃瓜研究所)為試材，該品種表皮毛明顯、刺瘤密集。將黃瓜種子播于日光溫室中，進行普通的栽培管理，待植株開始結(jié)瓜時，取開花當天的果實于液氮速凍，存于_80°C冰箱保存，備用。ニ、總RNA的提取與cDNA合成1、總RNA的提取 采用柱式植物RNAout試劑盒(購自北京天恩澤基因科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為71203)提取黃瓜果實的總RNA，并用DNase去除RNA樣品中殘留的DNA。步驟如下(I)在研缽中加入約200mg黃瓜果實，加入液氮研磨至粉末狀。將研磨物轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5mL塑料離心管，加入Iml細胞裂解液(試劑盒自帶)，充分振蕩混勻。
(2)在離心管中加入300iU的去蛋白液(試劑盒自帶)和200iU自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。室溫12000rpm離心3_5min，兩相間將有約5_10毫米厚的細胞破碎物。(3)將上清液(約600iU)轉(zhuǎn)移到另ー干凈的1. 5mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì),避免觸及或吸取。最好留下IOOii L上清液不取。加入等體積的漂洗液，充分顛倒混勻。將一半的溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心Imin,棄穿透液。(4)將剩下的一半溶液轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中，12000rpm室溫離心Imin,棄穿透液。(5)加700 V-1通用洗柱 液，12000rpm室溫離心Imin,棄穿透液。加300 U I通用洗柱液，12000rpm室溫離心Imin,棄穿透液。12000rpm室溫離心lmin。此步十分重要,否則殘留的こ醇會影響RNA的使用。往吸附柱的中央加入50 ii I DNAase反應(yīng)液,室溫靜置10-15min,加入500 U I通用洗柱液，12000rpm室溫離心lmin,棄穿透液。12000rpm室溫離心 lmin。(6)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到RNase-free收集管中，加入50iU RNA洗脫液，室溫放置l-2min。12000rpm室溫離心lmin，離心管中溶液即為RNA樣品，存放于_80°C待用。2、cDNA第一鏈的合成以I U g 黃瓜果實 RNA 為模板,利用 M-MLV Reverse Transcriptase 合成 cDNA 第ー鏈。反轉(zhuǎn)錄步驟參照該試劑盒的說明書。cDNA第一鏈合成后-20°C保存?zhèn)溆?。三、CsTRY基因的克隆利用擬南芥ETCl、TRY和CPC基因的⑶S序列和氨基酸序列在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http: / / cucumber. Renomics. orR. cn/paRe/cucumber/ index, isp)中分另I」& 'ii blast 比對，發(fā)現(xiàn)與這3個基因相似度最高的序列為同一條，暫命名為CsTRY，根據(jù)CsTRY的⑶S全長序列設(shè)計引物forward :5’ -ATGGACAATCATCGTCACCA-3’ (序列表中序列 3) ；reverse 5，-TCATCCTCTTCTTCTTTTTCCA-3’(序列表中序列 4)。用高保真酶 PrimeSTAR HS DNAPolymerase進行PCR擴增，回收得到目的片段。PCR擴增程序94 0C 3min
權(quán)利要求
1.ー種蛋白，是如下I)或2)的蛋白質(zhì) 1)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在干所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因； 3)與I)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.擴增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，表皮毛發(fā)育受抑制的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求4所述的重組表達載體導入目的植物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為在載體msl300的多克隆位點間插入權(quán)利要求2或3所述的編碼基因得到的重組表達載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或黃瓜。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述表皮毛發(fā)育受抑制體現(xiàn)為與所述目的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的表皮毛數(shù)目減少。
全文摘要
本發(fā)明公開了與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白。本發(fā)明所提供的與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物表皮毛發(fā)育相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明異源CsTRY的過量表達可引起擬南芥葉片表皮毛的大量減少，且可使擬南芥中GLABRA2(GL2)、TRICHOMELESS1(TCL1)等基因的表達量顯著下降。這表明CsTRY基因可能與擬南芥TRY基因一樣，抑制了表皮毛的形成。本發(fā)明將在黃瓜品質(zhì)改良中具有重要作用。
文檔編號C12N15/29GK103030686SQ20111029983
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者任華中, 譚崢, 郭芳, 劉興旺, 劉斌 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學