專利名稱：適用于實驗小鼠基因分型的鼠尾dna提取試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鼠尾DNA提取試劑盒及其應用，具有簡捷、經(jīng)濟、可靠的特點，特別適用于實驗小鼠基因型的準確鑒定。
背景技術：
利用遺傳學手段研究各種基因突變小鼠已成為生命科學和醫(yī)學研究最有力的方法之一，而進入各實驗室的轉(zhuǎn)基因小鼠(主要包括基因敲入、敲除和免疫缺陷小鼠等)的品系和數(shù)量也呈日益增多的趨勢。該現(xiàn)象在有效提高了科研平臺和水平的同時，也使得小鼠的基因分型成為長期、大量和頻繁的常規(guī)工作。目前常用的基因分型中涉及組織DNA提取的方法是鼠尾DNA的提取，其傳統(tǒng)方法包括酚/氯仿提取法和高鹽提取法。這些方法雖然能夠獲取較高純度和得率的鼠尾DNA，但都具有一些共同的不足之處一是步驟較繁瑣，例如多次涉及離心；二是涉及的試劑過多， 例如均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶K等試劑；三是時間偏長，例如均有實驗過夜步驟。即便是文獻中報道的其它方法，其所花時間至少也在2h以上。上述特點都在無形中增加了實驗成本(包括試劑成本和人力成本)，不利于經(jīng)費緊張、人力有限的實驗室進行相關的基因型分型實驗。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的不足，基于長期、大量、頻繁地從事實驗小鼠基因分型的實驗室工作的實際需要，本發(fā)明提供一種操作簡便、成本低廉、結果可靠的適用于實驗小鼠基因分型的鼠尾DNA提取試劑盒。本發(fā)明提供的DNA提取試劑盒，包括A液和B液。所述A液由終濃度為0. 025N的NaOH和終濃度為2mM的EDTA組成；每40ml試劑含有 100 μ 1 ION NaOH 溶液，160 μ 1 0. 5Μ EDTA 溶液和 39. 74ml ddH20。所述B液為終濃度為40mM的Tris溶液；每40ml試劑含有1. 6ml IM Tris溶液和 38. 4ml ddH20。本發(fā)明提供一種適合于基因型鑒定的鼠尾DNA提取快捷試劑盒按如下步驟進行
(1)取小鼠尾尖0.2-0. 5cm組織并置于1. 5ml EP管中；
(2)加入180 μ 1 A 液；
(3)置于沸水浴30min，或置于溫度設定為100°C的微量恒溫器中30min，使組織細胞中的核酸成分在A液和高溫的作用下通過裂解而釋放出來；
(4)取出EP管，冰浴2min；
(5)加入180μ 1 B液，充分混勻；
(6)4°C保存，即可用于基因型鑒定。本發(fā)明是立足于基因分型實驗的實際需要，簡化常規(guī)提取流程，選取A液中的 NaOH溶液和高溫因素對組織進行直接裂解，使其DNA得以充分釋放，同時采用A液中的EDTA溶液與Mg2+整合，減少Dnase的活性，從而進一步保護DNA樣品的完整性，而B液中的 Tris溶液則繼續(xù)為組織提供一個合適的裂解環(huán)境。由于實驗小鼠的基因型鑒定對DNA純度和得率的要求不是太高，因此本發(fā)明在沒有選用蛋白酶K和酚/氯仿等試劑，也沒有采用相應的離心手段，從而大大減少了實驗的步驟和時間。同時，本發(fā)明注重對A液/樣品比例的控制，即可保證所得產(chǎn)物可用于基因型的準確鑒定。發(fā)明人在美國哈佛大學醫(yī)學院和第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院相關實驗室使用該試劑盒進行了大量實驗，結果可靠?？梢姡撛噭┖兄苽浞椒ê唵?，所用A液和B液成分均為常規(guī)生化試劑，整個過程不需蛋白酶K和酚/氯仿等試劑參與，也無多次離心等繁瑣步驟，操作時間不超過lh，快捷經(jīng)濟，性價比高，特別適合長期、大量、頻繁鑒定實驗小鼠基因型的實驗室使用。


圖1是C57B/6背景的Foxp3-GFPKI小鼠基因型鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結果泳道 M 為 DNA Marker (DL2000,至上而下帶型分子量依次為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp和lOObp)，泳道1-9為不同小鼠Foxp3表達結果，泳道NC為陰性對照。其模板為根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒方法提取的鼠尾DNA.結果顯示，除陰性對照外，所有小鼠帶型均為 470bp，表明這些樣品均為Foxp3-GFPKI純合子小鼠。圖2A和圖2B是Foxp3-GFPKI小鼠周圍淋巴結和脾細胞懸液的流式細胞分析結^ ο
具體實施例方式以下的實施例是便于更好地理解本發(fā)明，但不限定于本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的實驗材料，若無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。實施例1 試劑盒配制
A液40ml 取100 μ 1 10Ν NaOH溶液置于50ml塑料容器中，再分別加入160 μ 1 0. 5Μ EDTA 溶液和 39. 74ml ddH20,混勻。B液40ml 取1. 6ml IM Tris溶液置于50ml玻璃容器中，加入38. 4ml ddH20，混勻，pH 7. 6。實施例2 :C57B/6背景的Foxp3- GFP敲入小鼠基因分型(即將綠色熒光蛋白敲入小鼠，使其和Foxp3基因連鎖，這樣凡是表達綠色熒光的細胞均為Foxp3陽性細胞)
配對C57B/6背景的Foxp3-GFP敲入成年小鼠由美國哈佛大學醫(yī)學院饋贈(購自美國 Jackson Laboratory)，置于第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心按照SPF級動物標準飼養(yǎng)和繁殖，幼鼠斷奶分籠后進行Foxp3基因鑒定；
(1)取小鼠尾尖0.2-0. 5cm組織并置于1. 5ml EP管中；
(2)加入180 μ 1 A 液;
(3)IOO0C30min ；
(4)取出EP管，冰浴2min；
(5)加入180μ 1 B液，充分混勻；
(6)4°C保存，進行基因型鑒定PCR 引物合成(上海生工):Foxp3-l (common)-CAA AAC CAA GAA AAG GTG GGC, Foxp3-2(wild type reverse)-CAG TGC TGT TGC TGT GTA AGG GTC，F(xiàn)oxp3_3(mutant reverse) -GGA ATG CTC GTC AAG AAG ACA GG ；
按以下要求取樣，使總體積為15μ1 模板(由上述試劑盒方法獲得)2μ l，2XTag Master Mix (Promega，M712B) 7· 5 μ 1，弓丨物 Foxp3_l 0· 6 μ 1，弓丨物 Foxp3_2 0· 6 μ 1，弓丨物 Foxp3-3 0. 6 μ 1，Ckffl2O 3. 7 μ 1 ；
按以下PCR參數(shù)(Jackson Laboratory)完成PCR反應首先94°C 3min，然后按94°C 30sec，64°C lmin，72°C Imin順序進行35個循環(huán)，接著72°C 2min，最終產(chǎn)物置-20°C保存；
2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(參見圖1) :510bp單條帶為C57B/6野生型小鼠， 470bp單條帶為C57B/6背景的Foxp3-GFP敲入純合子小鼠，470bp和5IObp雙條帶為 Foxp3-GFPKI雜合子小鼠；
隨機選取上述鑒定獲得的Foxp3-GFP敲入純合子小鼠，脫頸椎法處死； 收集周圍淋巴結(包括腹股溝、腋窩和頸部淋巴結)和脾，碾磨為細胞懸液； 離心分離1500rpm 5min，棄上清；
加入2ml紅細胞裂解液(Tiangen)，混勻后室溫靜置2min ；
將液體移至預先加有6ml含10% FBS (Hyclone)的RPMI1640培養(yǎng)基(蘭州民海)中洗
滌；
離心分離1500rpm 5min，棄上清； 加入400 μ 1含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基制懸，過濾； 流式細胞儀(BD FACS Calibur)檢測GFP信號及其含該信號的細胞比例； 比較采用本發(fā)明獲得的鼠尾DNA進行基因分型結果與流式細胞分析結果的差異，推斷前者的可靠性，參見圖2Α和圖2Β。圖2Α樣本為C57B/6野生型小鼠(對照)，圖2Β樣本為經(jīng)圖1鑒定為Foxp3-GFPKI純合子的小鼠。結果顯示，流式細胞分析結果與圖1結果一致，說明本發(fā)明提供的鼠尾DNA提取快捷試劑盒可以用于基因型鑒定，而且結果可靠。
權利要求
1.一種適用于實驗小鼠基因型的鼠尾DNA提取試劑盒，其特征在于包括A液和B液， 其中A液40ml，由終濃度為0. 025N的NaOH溶液和終濃度為2mM的EDTA溶液組成，B液 40ml，為終濃度為40mM的Tris溶液，pH 7. 6。
2.權利要求1所述的鼠尾DNA提取試劑盒的配制方法，其特征在于取100μ 1 ION NaOH溶液置于50ml塑料容器中，再分別加入160 μ 1 0. 5Μ EDTA溶液和39. 74ml ddH20,混勻，即獲得A液；取1.6ml IM Tris溶液置于50ml玻璃容器中，加入38. 4ml ddH20，混勻，即獲得B液。
3.權利要求1所述的鼠尾DNA提取試劑盒的使用方法，其特征在于按如下步驟進行取小鼠尾尖0. 2-0. 5cm組織并置于1. 5ml EP管中；加入180 μ 1 A液;置于沸水浴30min，或置于溫度設定為100°C的微量恒溫器中30min，使組織細胞中的核酸成分在A液和高溫的作用下通過裂解而釋放出來；取出EP管，冰浴2min ；加入180 μ 1 B液，充分混勻；4°C保存，即可用于基因型鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開一種簡捷、經(jīng)濟、可靠的鼠尾DNA提取試劑盒，適用于實驗小鼠基因型的準確鑒定。該試劑盒包括A液和B液，其中A液由終濃度為0.025N的NaOH溶液和終濃度為2mM的EDTA溶液組成，B液為終濃度為40mM的Tris溶液，pH7.6。操作步驟如下取小鼠尾尖0.2-0.5cm組織并置于1.5mlEP管中；加入180μlA液，100℃30min；然后冰浴2min，再加入180μlB液，充分混勻，即可獲得組織DNA，可用于下一步的基因型鑒定。該試劑盒制備方法簡單，所用A液和B液成分均為常規(guī)生化試劑，整個過程不需蛋白酶K和酚/氯仿等試劑參與，也無多次離心等繁瑣步驟，操作時間不超過1h，快捷經(jīng)濟，性價比高，特別適合長期、大量、頻繁鑒定實驗小鼠基因型的實驗室使用。
文檔編號C12Q1/68GK102329791SQ201110294538
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者嚴軍, 曾靈, 杜娟, 楊策, 王海燕, 蔣建新, 顧瑋, 高聞達 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院